实验一水质的微生物检测

水微生物检测南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：8学时课程类型：专业实验课课程要求：必修每组人数：2人实验目的与要求掌握水样采集规则及注意事项。熟悉常用水卫生细菌学指标。熟悉菌落总数、大肠菌群的测定方法及检测意义。学会对所检测的水样作综合分析。水微生物检测的意义水体的微生物污染问题日趋严重。在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长。水体中微生物污染的来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染。水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测。一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。水微生物的检测指标菌落总数(aerobicbacterialcount)是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。水质微生物的检测指标总大肠菌群(coliformbacteria)是指一群需氧及兼性厌氧的，37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。实验内容水样采集；菌落总数的测定；总大肠菌群的测定。一、水样采集采样原则所采集的样品具有代表性。采样容器：选择硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。自来水水水样：先将自来来水龙头头用火焰焰烧灼3min灭灭菌，再开放放水龙头头使水流流5min（（经常用用水的水水龙头放放水1～3min）后，，采集水水样于无菌锥形形瓶，约占瓶容量量80%，以便摇摇匀水样样。水源水水水样：选有代表性的的地点及可疑地地方，一一般距水面下下10～15cm采样。采样后后，将瓶塞盖好好，再从从水中取取出。注意事项严格无菌操操作。做好标记：采得水样样后应立即即记录水样样名称、地地点、时间间等项目。。从速送检。水样从采采集到检验验不应超过过2h，在在0～4℃℃下保存不不应超过24h。二、菌落总总数的测定定—平板菌菌落计数法法（一）生活活饮用水[器材与试试剂]无菌1ml吸管1支支/组，无无菌平皿3个/组，，营养琼脂脂。[方法]水样摇匀20~25次，使细细菌分散。。倾注培养：无菌吸取取1ml水水样分别置置于2个空平皿皿，另一个作作空白对照。再倾注15ml琼琼脂（约45℃）于于平皿中旋旋转，混匀匀待琼脂凝凝固后倒置37℃24h。菌落计数：用肉眼或或放大镜检检查，计数数平皿内菌菌落数目。。[结果分析析与报告]计算平均菌落数数：报告方式：：菌落总数数(cfu/ml)。cfu：colonyformingunits当检样的菌菌落数为l~100时，按实实有数报告告；大于100时，，采用二位位有效数字字报告。国家标准（（GB5749-2006））规定生活活饮用水菌菌落总数每每毫升不得得超过100个。（二）水源源水[器材与试试剂]无菌1ml吸管6支支/组，无无菌10ml吸管1支/组。。无菌平皿9个/组，，营养琼脂脂。90ml灭灭菌盐水1瓶（内置适量量玻璃珠）），9ml灭菌盐水管3支支。[方法]稀释水样：无菌吸10ml混匀匀水样注入入90ml灭菌水瓶瓶中,混匀匀成1:10水样。。取1:10水样1ml注入9ml灭菌菌试管中混混匀成1:100水水样。同法法稀释成1:1000,1:10000水样样。[方法]倾注培养：用1ml无无菌吸管吸吸取2~3个适适当浓度的的稀释液1ml,分分别注入无无菌平皿中中，每个稀稀释度应同同时做2个个平皿，另另取一平皿皿作空白对对照。再做做倾注培养养(方法同同饮用水)。菌落计数：方法同饮饮用水。菌落总数测测定[结果分析析与报告]计算不同稀释度度的平均菌落落数：稀释度的选选择和菌落总数数报告方式式：首先选择平平均菌落在在30～300之间间者进行计计算。计算方法和和报告方式式如表1所所示。表1稀释释度选择及及菌落总数数报告方式式例次不同稀释度的平均菌落数两稀释度菌落总数之比

菌落总数(cfu／m1)

报告方式(cfu／m1)10-110-210-312345678136527602890150多不可计27多不可计01642952713046501l305020466085135120—1.62.22————164003775027100150051300027030500<1×1016000或1.6×10438000或3.8×10427000或2.7×1041500或1.5×103510000或5.1×105270或2.7×10231000或3.1×104<10由表2可判判定水质被被污染的程程度。表2一般般水源水中中菌落总数数与水清洁洁程度的关关系水的类别最清洁水清洁水不太清洁水不清洁水极不清洁水菌落总数

cfu／m110~100100~10001000~1000010000~100000＞100000[注意事项项]菌落总数测测定中，应应选择合适的的稀释度进行。（生活饮饮用水，国国家标准规规定每毫升升不得超过过100个个，因此可可以直接吸吸取1毫升升到平板进进行培养））各稀释管、、相应平皿皿做好标记。包括：水水样名称、、稀释度、、时间、小小组。严格无菌操操作。进行水样样稀释时，，每一稀释释度均需更更换吸管。。倾注时，要要注意营养琼琼脂的温度度。倾入琼脂后后要混匀，待琼脂凝凝固后倒置培养。三、总大肠肠菌群的测测定

—多多管发酵法法分为三步：：初发酵试验验平板分离复发酵证实实试验初发酵试验验：采用乳糖蛋蛋白胨培养养液37℃℃培养24h，观察察产酸产气情况。平板分离：对阳性管培培养物，接接种于品红红亚硫酸钠钠培养基或或伊红美蓝蓝培养基，，观察菌落特征，并进行革兰氏染色色和镜检。复发酵证实实试验：对典型和可可疑菌落，，接种于乳乳糖蛋白胨胨培养液，，进行复发发酵证实试验，并根据标标准所附检检数表报告告结果。产气初发酵、复复发酵试验验结果大肠菌群EMB上菌菌落特征大肠菌群革革兰染色形形态（一）生活活饮用水[器材与试试剂]2瓶50ml三倍浓浓缩的乳糖糖蛋白胨培培养液（内有导管）,10支5ml三倍浓缩缩的乳糖蛋蛋白胨培养养液（内有导管）,10ml吸管1支,100ml量量筒1支。。EMB，革革兰染液等等。[方法]初步发酵试试验：接种水样总总量为300ml（（100ml2份份，10ml10份，12支发酵酵管）。37℃培培养24h。平板分离：将产酸产气气及只产酸酸不产气(发酵乳糖)管接种EMB,37℃培培养24h，取典型型菌落作革革兰氏染色色镜检。复发酵试验验：革兰氏染色色镜检为革兰阴性无无芽胞杆菌菌，取该菌接接种于普通通浓度乳糖糖蛋白胨(每管接1~3个菌菌落),37℃培培养24h，有产酸产气者即证明有有大肠杆菌菌的存在。。产酸产气报告为大肠肠菌群阳性性[结果分析析与报告]根据证实有有大肠菌群群存在的阳阳性管（瓶瓶）数，查查接种水样总总量为300ml检检数表（表3）。。报告每升水水样中中的大大肠菌菌群数数（MPN值值，，MostProbableNumber，最最大可可能数数法））。国家标标准（（GB5749-2006））规定定生活活饮用用水大大肠菌菌数每每升不不得超超过3个。。表3大大肠肠菌群群数检检数表表接种水水样总总量300ml（100ml2份，，10ml10份份））10ml水量的阳性管数100ml水量的阳性管数012每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数0l2345678910＜33711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230＞230（二））水源源水[器材材与试试剂]1ml吸管管3支支/组组，10ml吸吸管1支/组，，10ml普通通发酵酵管（（内有有导管管）3支/组，，5ml三三倍发发酵管管（内内有导导管））1支支/组组。EMB，革革兰染染液等等。[方法法]稀释水水样：水样做做1:10及1:100稀释释。方方法同同菌落落总数数测定定。初发酵酵试验验：接种水水样总总量11.11ml，4支发发酵管管。取取10ml原水水样注注入5ml三倍倍乳糖糖发酵酵管（（内有有导管管）；；取1ml原水水样、、1ml1:10及1:100稀释释水样样分别别注入入10ml普通通乳糖糖发酵酵管（（内有有导管管），，37℃培培养24h。平板分分离与与复发发酵试试验：同生活活饮用用水。。[结果果分析析与报报告]根据证证实有有大肠肠菌群群存在在的阳阳性管管（瓶瓶）数数，查查接种水水样总总量为为11.11ml检检数表表（表4），，报告告每升升水样样中的的大肠肠菌群群数。。表4大大肠肠菌群群数检检数表表接种水水样总总量11.11ml（10ml、、1ml、、0.1ml、0.01ml各各1份））接种水样总量(ml)每升水样中大肠菌群数1010.10.01－－－－－－－＋－－－＋－＋＋－－＋＋－＋－－－－＋＋－－－＋＋－＋＋－－－＋＋－＋地＋－＜９０９０９０９５１８０１９０２２０２３０２８０９２０９４０[注意意事项项]总大肠肠菌群群的测测定方方法，，由于于饮用用水和和水源源水可可能的的污染染程度度不同