临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第六章沉淀反应

第第8页共8页第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。沉淀反应分两个阶段，特异性结合肉眼不可见免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。（三）方阵滴定法即棋盘滴定法。二、免疫浊度测定微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。（一）免疫比浊测定的影响因素抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。在反应体系中需保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。特异性强效价高：（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。则抗体的活性高，可加快抗原抗体反应的速度，且形成的IC（4）R型和H型抗体：R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。抗原抗体反应的溶液反应液最适pH为6.5～8.5。常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。在一定范围内，离子强度大，IC形成越快。增浊剂某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20，其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。（二）免疫比浊法方法分类透射免疫比浊法合物。散射免疫比浊法散射光强度来定量抗原抗体的复合物。免疫胶乳比浊法是以胶乳作为载体定的灵敏度。第三节凝胶内沉淀试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。不同分子量的物质在凝胶中扩散速度不同，借此可用以识别不同待测物分子量的差别。一、单向扩散试验在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。（一）试管法将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液，使其自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。（二0.9%琼脂糖行自由扩散，24～48小时两种计算方法：Mancini曲线适用大分子抗原长时间扩散（48小时的结果，沉淀环直径的平方d2）浓度（c）。Fahey小分子抗原的结果处理，用半对数纸画线，浓度对数logc散环直径其中c）。（三）影响因素抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。每次测定都必须作标准曲线。每次测定时必须用质控血清作质控。注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。二、双向扩散试验抗原抗体。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。（一）试管法抗体——琼脂——抗原（二）平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计靠近抗原孔抗体较大；靠近抗体孔抗原较大；不出现沉淀线抗体（抗原）抗原过量。抗原或抗体相对分子量的分析，反之则较慢。；如果两者分子量大致相等，则形成直线。抗原性质的分析两个抗原相同；相切有部分相同；交叉而过完全不同。抗体效价的滴定。。第四节免疫电泳技术电泳分析与沉淀反应的结合产物。一、优点（一）加快了沉淀反应的速度；（二）电场规定了抗原抗体的扩散方向，使其集中，提高了灵敏度；（三）可将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应。二、对流免疫电泳双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。在pH8.6缓冲液中，大多蛋白质带强负电荷，在电场中向正极移动；而IgG等电点偏高（pH6～7），在pH8.6时带负电荷较少，且分子量较大，移动速度慢。在凝胶的电渗作用下，随水流向负极。IgG3和IgG4泳向正极，而IgG1和IgG2因其带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，所以被水分子挟裹向负极移动。三、火箭免疫电泳个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰。，未达终点。作IgG定量时，因电渗呈纺锤状，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化负电荷，加快了电泳速度。四、免疫电泳区带电泳技术将抗原在凝胶中电泳，分成肉平行的抗体槽，加入相应抗血清，置室温18～24小时后免疫电泳为定性试验，目前主要应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定方面，例如多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧。五、免疫固定电泳各种蛋白质区带电泳，将蛋白质分离成不同区带，然其上覆盖抗血清后通过漂洗和染色，并与蛋白质参考泳道对照分析，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。本法可用于迁移率近似的蛋白和M蛋白的鉴定与分型，免疫球蛋白轻链，尿液中的本-周蛋白检测及κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型，鉴定游离轻链，补体裂解产物等。免疫固定电泳最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。六、交叉免疫电泳将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的技术。定量白质裂解产物和不正常片段等进行定性分析。第五节沉淀反应在医学检验中的应用免疫浊度法主要用于血液、体液中蛋白质的测定。稳定性好，敏感度高（达ng/L），精确度高（CV＜5%），简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合于大批量标本的检测。血清中M（1～4题共用答案）A.带现象B.前带C.后带D.等价带E.拖尾现象沉淀反应中抗原过量的现象称为『正确答案』C沉淀反应中抗体过量的现象称为『正确答案』B沉淀反应的反应曲线中，抗原抗体分子比例合适的范围称为『正确答案』D沉淀反应的反应曲线中，抗原或抗体极度过剩而引起无沉淀物形成的现象称为『正确答案』A过剩而引起无沉淀物形成的现象称为带现象。沉淀反应的抗原是A.颗粒性抗原B.可溶性抗原C.半抗原D.超抗原E『正确答案』B『答案解析』沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。关于免疫浊度法测定错误的是A.反应液中抗体过量B.反应液中抗原过量C.反应液中抗原、抗体比例合适D.常用聚乙二醇等增浊剂E.通常用磷酸盐反应液『正确答案』B抗原抗体的比例抗原过量IC分子小，抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。在反应，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。下列有关沉淀反应第一阶段的说法，错误的是A.抗原抗体的特异性结合BC.可用散射比浊测定反应结果D.出现肉眼可见的沉淀线或沉淀环E.肉眼见不到免疫复合物『正确答案』D能完成，如沉淀线、沉淀环。免疫沉淀反应常用于颗粒性抗原检测C.用于可溶性抗原的检测D.不能用于定量检测E.可不考虑抗原抗体的比例『正确答案』C用于可溶性抗原的检测。A.需先将抗原混入琼脂内B.有试管法和平板法C.需先将抗体混入琼脂内D.可用于定量检测E.抗原抗体的比例合适处形成沉淀环『正确答案』A体结合，则形成沉淀环。通过观察双向琼脂扩散试验的结果，不能解决的问题是A.是否存在相应的抗原或抗体B.抗原和抗体相对含量的估计CDE.抗体浓度的确定『正确答案』E『答案解析』双向扩散试验能解决的问题：1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计2.抗原或抗体相对分子量的分析3.抗原性质的分析4.抗体效价的滴定5.抗原或抗体纯度鉴定。免疫电泳的影响因素不包括A.电场强度B.溶液pHC.离子强度D.抗体纯度E.电渗『正确答案』D『答案解析』免疫电泳的影响因素不包括抗体纯度。单向扩散试验时错误的是AB.每次测定必须做标准曲线CD.将抗原加入所打的孔中E.24～48『正确答案』C『答案解析』单向扩散试验影响因素12.34.注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）C双向琼脂扩散试验中，若抗原的含量比抗体多且分子量比抗体小，则沉淀线应为A.靠近抗原孔，且弧线弯向抗原侧B.靠近抗原孔，且弧线弯向抗体侧C.靠近抗体孔，且弧线弯向抗原侧D.靠近抗体孔，且弧线弯向抗体侧E.居于抗原抗体孔中间，且弧线弯向抗原侧『正确答案』D抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计沉淀线靠近抗体孔，不出现沉淀线则无对应的抗体（抗原）2量的分析（1）分子量小者扩散快，反之则较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方；如果两者分子量大致相等，则形成直线。双扩平板法测量两种不相关成分的抗原时，沉淀线A.二条直线相交叉BCD.二条弧线不连接E.二条直线平行『正确答案』A抗原性质的分析两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。双扩平板法出现多条沉淀线的原因是A.抗原过剩B.抗体过剩C.抗原缺乏D.抗体缺乏E.抗原或抗体不纯『正确答案』E『答案解析』双扩平板法抗原或抗体纯度鉴定：用混合抗