食品安全地方标准 畜肉食品中鸭源性成分PCR检测方法

畜肉食品中中鸭源性成分检测方法PCR法范围本方法规定了畜肉食品中鸭源性成分检测方法。本方法适用于新鲜、冰冻畜肉和肉干、肉酱、酱肉、火腿、肉松等畜肉加工食品中鸭成分定性检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测术语和定义下列术语和定义适用于本文件。术语和定义鸭源性成分duck-derivedmaterials鸭种属特异性DNA片段。原理对样品进行DNA提取，使之适用于PCR检测技术，通过PCR扩增，检测其中是否含有鸭特异性基因序列，达到对畜肉食品中鸭源性成分定性PCR检测的目的。试剂和材料除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。鸭源性成分检测用引物（对）序列为：F：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’R：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’CTAB提取缓冲液：CTAB20g/L，氯化钠1.4mol/L，Triso.1mol/L，EDTA20mmol/L，pH8.0，高压灭菌。使用前加入终浓度为2%的β-巯基乙醇。CTAB沉淀液：CTAB5g/L，氯化钠0.04mol/L，pH8.0，高压灭菌。氯化钠溶液：1.2mol/L。蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为20mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。无水乙醇、异丙醇等有机试剂。食物基因组DNA提取纯化试剂盒。10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。TaqDNA聚合酶。分子量标记：100bpDNAMarker。琼脂糖：电泳纯。仪器和设备天平：感量0.01g。PCR仪。电泳仪。凝胶成像系统。高速冷冻离心机：最高转速12000r/min以上。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。振荡器。恒温水浴锅。冰箱：2℃～-20℃。微量可调移液器及配套吸头：0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、200μL~1000μL。离心管：1.5mL。抽样采样工具下列采样工具应经180℃±2℃，2h高温灭菌：剪刀、镊子、钎子。样品采集待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。样品储运样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品放入一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。试样制备与保存试样制备从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分出不少于500g作为试样。装入清洁容器中，加封后，标明标记。试样保存将试样于-20℃冷冻保存。检测步骤待检样品的制备样品的设置检测过程中设置核酸提取空白对照、PCR扩增空白对照、PCR扩增阴性对照、PCR扩增阳性对照。样品前处理加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式的样品前处理尽量去除样品中的盐、糖和色素。具体步骤是：取约500mg样品加入50mL离心管，加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒充分混匀，8000g离心5min并弃去上清夜，重新加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒混匀，8000g离心5min并弃去上清夜，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。悬乳浊或浊状的液体食品样品，如酱汁等，可以通过物理方式破坏胶体稳定性并分离、浓缩。取适量样品加入2mL离心管，8000g离心5min并弃去上清液，再次加入适量样品，8000g离心5min并弃去上清液，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。样品均质采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。DNA提取和纯化CTAB法称取500mg待检样品于15mL离心管中，加入5mLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K溶液，65℃温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时，再加入适量CTAB裂解液；8000g离心5min，取1mL上清于2mL离心管中，加700μL三氯甲烷，漩涡震荡30s，14500g离心10min，收集600μL~650μL上清液到新的2mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温60min；14500g离心5min，去除上清液，加350μL氯化钠溶液溶解沉淀，加等体积三氯甲烷，漩涡震荡30s，14500g离心10min，转移上清液到新的离心管。加0.8倍体积异丙醇，室温20min，14500g离心10min，加500μL70%乙醇水溶液，漩涡震荡30s，14500g离心10min，去除上清液，室温条件下过夜或者60℃烘15min~25min，注意不要让沉淀过干。加50μL双蒸水溶解沉淀，-20℃保存。试剂盒法采用商品化的食品基因组DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。DNA浓度测定采用紫外分光光度法测定DNA，所测得OD值为核酸总量。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2μg/mL~50μg/mL，值应该在0.05~1的区间内。将DNA溶液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的比色皿中，于260nm处测定其吸收值，1OD260nm=50μg/mL双链DNA或38μg/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260nm/OD280nm比值为1.7~2.0。PCR检测PCR反应体系表1PCR反应体系试剂加入量（）10×PCRbuffer2.5dNTP溶液（10mmol/L）0.5TaqDNA聚合酶（5U/）0.2上游引物（10μmol/L）1.0下游引物（10μmol/L）1.0DNA模板（100ng/）2.0补水至25PCR扩增条件94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。凝胶电泳检测PCR产物用电泳缓冲液（1×TAE）制备1.0%~1.2%琼脂糖凝胶（55℃~60℃时加入溴化乙锭至终浓度为0.5g/mL，也可在电泳后进行染色）。取8L~15LPCR扩增产物，分别和2L上样缓冲液混合，进行点样，用100bpDNAMarker作参照。9V/cm恒压电泳，电泳20min~40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。限制性内切酶酶切及产物电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系（20L）：Stu

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酶2U，酶切缓冲液2L，加入PCR扩增产物至总体积20L。酶切在37℃下进行，20min。酶切完成后电泳，方法见8.4.3。结果判断与表述PCR扩增产物电泳检测结果阳性样品的PCR扩增产物大小为201bp（序列参考附录A）。酶切性内切酶酶切结果阳性样品PCR产物采用内切酶Stu

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酶切后，酶切片段大小为118bp和83bp。结果表述PCR产物和酶切产物都为阳性者判定含有鸭源性成分，表述为检出鸭源性成分；PCR产物为阴性者判定不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403执行。废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。附录A（资料性附录）PCR产物测序结果CATCTATCCTGCTAGCCGCCGGCCTCTTATCAATGCTCCT