微生物学-第七章课件

第七章微生物的生长繁殖掌握研究微生物生长的方法及生长曲线在废水微生物处理中的应用；一、微生物生长繁殖的概念二、微生物的分离和纯种培养三、研究微生物生长的方法四、细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用五、微生物生长量的测定方法微生物的生长繁殖的概念

微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程，这是个体生长的定义。繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。世代时间：细菌两次细胞分裂之间的时间。第一节微生物的分离和纯培养用固体培养基分离纯培养

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿中，冷却凝固后，成为盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。二、纯培养的分离方法纯培养分离的目的：得到纯培养物，是研究和利用微生物的第一步。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。稀释倒平板法(pourplatemethod) 涂布平板法(spreadplatemethod) 平板划线分离法(streakplatemethod)选择培养基分离法单细胞挑取法待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面或琼脂培养基中的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。——用途广泛的分析方法稀释倒平板法

在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。

涂布平板法用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

——方法简单，多用于分离细菌平板划线分离法MixedculturePureculturePureculture光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落

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1ml9ml土豆培养基牛肉膏培养基高氏培养基该法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的方法。方法：将显微镜挑取器装在显微镜上，将一滴待分离的菌液滴入载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的毛细吸管对准某个单独的细胞挑取，在接种到培养基上，得到纯培养。——局限于高度专业化的科学研究单细胞挑取法

二、细菌的生长曲线growthcurve活菌数的对数培养时间迟缓期衰亡期稳定期（静止期）对数期（指数期）细菌的生长繁殖周期细菌的生长繁殖可分为4个时期：１．停滞期（迟滞期或适应期）：２．对数期（指数期）：３．静止期：

４．衰亡期：缩短延滞期的方法：接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄加大接种量用与培养菌种相同组成分的培养基指数期(对数期)(exponentialphase)活菌数和总菌数接近；酶系活跃，代谢旺盛，对不良环境抵抗力强；生长速率最大，细菌数量以几何级数速率增长（2n）；细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致；该期的细菌生产中多被用做种子和科学试验材料。指数期生长的数学模型繁殖代数n=3.322(lgx2-lgx1)生长速率常数R=3.322(lgx2-lgx1)/(t2-t1)代时G=(t2-t1)/3.322(lgx2-lgx1)x2x1t2t1培养时间Lg细胞数/ml稳定期(静止期)出现原因：营养的消耗；营养物比例失调；有害代谢产物积累；pH值等理化条件不适。活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平；细菌代谢物积累达到最高峰；芽孢杆菌这时开始形成芽孢；这是发酵生产收获时期。稳定期的特点衰亡期(declinephase/deathphase)营养物质消耗殆尽，微生物开始利用自身贮存物质进行内源呼吸；细菌死亡数大于增殖数，活菌数明显减少，群体衰落；细胞出现多形态、大小不等的畸形，变成衰退型；细胞死亡,出现自溶现象。

是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。三、连续培养(continouscultureofmicroorganisms)优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一缺点：菌种易退化；易染杂菌1、恒浊连续培养：通过不断调节流速使培养液中的细菌的浓度恒定,以浊度为控制指标——开用光电控制系统控制培养液流量来实现。2、恒化连续培养：维持进水中的营养成分恒定（其中对细菌生长有限制作用的成分要保持低浓度水平），以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，使细菌处于最高生长速率。四、细菌生长曲线在污废水微生物处理中的应用废水活性污泥处理系统中的活性污泥微生物与细菌的生长规律极为相似，因此，细菌生长曲线被广泛用于活性污泥法系统控制中。

在废水生物处理设计时，按废水的水质情况（主要是有机物浓度），可利用不同生长阶段的微生物处理废水。

常规活性污泥法利用生长下降阶段的微生物，包括减速期、静止期的微生物；原因：对数期微生物生长快，消耗的营养物多，出水残留的有机物也高，难以满足排放要求；且代谢旺盛期微生物难以形成菌胶团，沉淀性差。而静止期微生物絮凝沉淀性能好，泥水分离效果好。细菌生长不同阶段在污水处理中的应用高负荷活性污泥法利用生长上升阶段（对数期）和生长下降阶段（减速期）的微生物如AB法的应用，A级采用对数期提高降解速率，B级采用减速期保证处理水效果。用延时曝气法处理低浓度的有机废水时，利用衰亡期的微生物。

对低浓度、难降解的有机废水处理，采用衰亡期满足微生物对营养的低要求，延长生物反应时间达到较好的处理效果。直接测定法计数法：直接计数法和间接计数法称重量法；菌体内重要组成测定法：含N量法：N×6.25=PrDNA/RNA法叶绿素法第三节微生物生长量的测定方法间接测定法—生理指标法

直接计数

这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。

每毫升原液所含细菌数

＝每小格平均细菌数×（涂布面积÷视野面积）×l00×稀释倍数（以样品为0.01ml为例）计数法计数室各种型号的全自动血球计数仪

间接计数

此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。

每毫升原菌液活菌数＝

同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5（以样品为0.2ml为例）此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。微生物干重

DNA含量蛋白质总量

重量法干重法:测定单位体积培养物中细胞的干重，用来表示菌体的生长量。方法：取定容培养物，用离心或过滤将菌体分离洗净、烘干、称重，可求得单位体积菌液中的细胞干重。DNA含量测定法核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×10-5ng。利用DNA与DABA-2HCl（3,5二氨基苯甲酸-盐酸）能显示特殊荧光反应的原理，测定一定体积培养物菌液的荧光反应强度，可求得菌液的DNA含量，据此计算出细菌的数量。蛋白质总量（含氮量测定法）原理：在蛋白质中，氮的含量比较稳定。因此，测定菌体含氮量可反应菌体的量。测定方法为：分离菌体，用凯氏微量定氮法测定菌体中的总氮量。例如：细菌蛋白质总量＝细菌的含氮量÷（6.5%～13%）细胞总量＝蛋白质总量÷(50%～80%(或65%))≈蛋白质总量×1.54间接测定法—生理指标法

生理指标法：微生物的新陈代谢作用会消耗或产生一定量的物质，用这些物质来表示微生物生长量的方法。生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。这是根据微生物在生长过程中伴随出现的这些指标，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。本章授课内容到此结束第二节微生物的生长因子一、温度二、pH三、氧化还原电位四、溶解氧五、太阳辐射六、水的活度与渗透压七、表面张力一、温度细菌最低温度ºC最适温度ºC最高温度ºC嗜冷菌-５～０５～1020～30嗜中温菌5～1025～4045～50嗜热菌3050～6070～80嗜超热菌55ºC以上70～105110～113根据一般微生物对温度的最适生长需求，将微生物分为四大类：嗜冷微生物（低温微生物）的嗜冷机理酶系在低温下仍能起催化作用；细胞膜含较多的不饱合脂肪酸在低温下仍具有通透性。生长速度温度停止生长致死最低最高最适低温对普通微生物的影响：代谢降低；生长繁殖停滞；仍然存活；常在低温下对菌种和食品保藏嗜热微生物的嗜热机制：细胞内的酶具强抗热性；产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质等组织结构具有保护作用；核酸也具有热稳定性的保护结构；细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，使膜具有稳定性。二、pH微生物最低pH最适pH最高pH细菌3～56.5～7.58～10酵母菌2～34.5～5.57～8霉菌1～34.5～5.57～8微生物的生命活动、物质代谢与pH密切相关。不同的微生物要求不同pH，见下表：pH对微生物的影响影响细胞膜透性与稳定性；影响物质溶解度；影响细胞表面电荷分布；因此影响微生物生长、繁殖、发育；各类微生物能够生长的pH值较宽，但细胞内部pH值却接近中性；微生物的活动也能改变环境中的pH值。根据微生物生长的最适pH，可以将微生物分为：嗜酸性微生物嗜碱性微生物耐酸及耐碱微生物三、氧化还原电位（Eh）

在自然环境中，氧化还原电位的上限是＋820mV,此时环境中存在高浓度氧（O2）,无利用O2的系统存在；下限是-400mV，是充满氢（H2）的环境。不同的微生物对氧化还原电位的要求不同：一般好氧微生物要求Eh为+300mV~+400mV；兼性厌氧微生物在Eh为+100mV以上时进行好氧呼吸，在为+100mV以下时进行无氧呼吸；专性厌氧微生物在Eh为-200mV~-250mV。

氧化还原电位的影响因素：1．氧分压：氧分压高，氧化还原电位高；氧分压低，氧化还原电位低。2．pH：pH低时，氧化还原电位低；pH高时，氧化还原电位高。3．还原剂：当环境中有还原剂（如维生素、硫而乙醇钠、谷胱甘肽、硫化氢及金属铁）时，可使氧化还原电位维持在低水平。四、溶解氧根据氧与微生物生长的关系，可将微生物分为：微生物类型适合生长的氧分压好氧微生物专性好氧微生物0.2×101KPa微量好氧微生物(0.003—0.2)×101KPa兼性厌氧微生物有氧或无氧厌氧微生物专性厌氧微生物小于0.005×101KPa耐氧厌氧微生物0.02×101KPa以下O2+e-O2-H2O2+O2-O2+OH-+OH·2O2-+2H+H2O2+O22H2O22H2O+O2氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产物，如超氧基化合物O2-与H2O2，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基，自由基是一种强氧化基，它与生物大分子互相作用，从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外的其它四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧化物歧化酶（SOD）可催化O2-生成H2O2，然后在H2O2酶作用下分解生成H2O和O2。超氧化物歧化酶（SOD）功能：使好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害过氧化氢酶(Catalase)五、太阳辐射太阳辐射由三部分组成：短波紫外辐射、可见光（380nm~760nm）和长波红外辐射。太阳辐射中具有正面生物学效应的辐射是波长短于1000nm的红外辐射和可见光辐射，短波紫外辐射一般具有负面生物学效应。第三节其他不利环境因子对微生物的影响一、紫外辐射和电离辐射对微生物的影响二、超声波对微生物的影响三、重金属对微生物的影响四、极端温度对微生物的影响五、极端pH对微生物的影响六、干燥对微生物的影响七、若干有机物对微生物的影响八、抗生素对微生物的影响一、紫外辐射和电离辐射对微生物的影响紫外辐射的波长为200~390nm，以波长260nm的紫外辐射杀菌力最强。紫外辐射对微生物的致死作用是由于微生物细胞中的核酸、嘌呤、嘧啶及蛋白质对紫外辐射有特别强的吸收能力。紫外辐射能引起DNA链上两个邻近的胸腺嘧啶分子形成胸腺嘧啶二聚体（T=T），致使DNA不能复制，导致微生物死亡。光复活与暗复活：光复活：把经紫外辐射照射的微生物立刻暴露于蓝色可见光下部分受损细胞可恢复活力。光复活现象最早由AKelner（1949年）在Streptomycesgriseus（灰色链霉菌）中发现的。后来在许多微生物中都得到证实。暗复活：微生物细胞在黑暗条件下进行的DNA链修复，此修复作用与光全然无关。由于微生物的DNA具有修复作用，所以只有当某一剂量的紫外辐射对DNA的损伤力大大超过修复酶对DNA损伤的修复力时，才导致微生物的死亡。紫外线在科研、生产、医学和日常生活中的应用一、空气消毒；二、表面消毒；三、诱变育种。电离辐射对微生物的影响

X—射线和γ—射线是波长极短的高能电磁波，具有很强的穿透力，能使被照射物体产生电离作用。

X—射线和γ—射线对微生物的影响表现为：低剂量照射有促进微生物生长的作用，或引起微生物发生变异；高剂量照射对微生物有致死作用。利用X—射线和γ—射线诱导微生物变异，筛选优良菌种。二、超声波对微生物的影响超声波是频率超过20000Hz、不能引起人耳听觉的声波。超声波对微生物具有强烈的破坏作用。三、重金属对微生物的影响重金属Hg、Ag、Cu、Pb及其化合物能与酶的—SH基结合，使酶失去活性；或与菌体蛋白结合，使之变性或沉淀。因而可有效的杀菌和防腐。高温灭菌多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65℃10min可以致死；一般噬菌体65－80℃致死；放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，76－80℃10min可以杀死；细菌芽孢，在100℃下５－20min才能致死；嗜热脂肪芽孢杆菌可在80ºＣ条件下生活，在120℃，12min才能；同种微生物老龄菌比幼菌耐热。四、极端温度对微生物的影响超高温（微生物最高生长温度以上的温度）可使微生物细胞的蛋白质凝固变性、破坏细胞质膜的结构，对微生物有致死作用。利用超高温对微生物有致死作用，可采取高温杀菌。其杀菌效果与微生物的种类、数量、生理状态、芽孢有无、菌体含水量及pH值有关。五、极端pH对微生物的影响

过高或过低的pH对微生物生长繁殖都不利，表现在：（1）过低的pH会引起微生物表面电荷的改变；（2）极端的pH可影响培养基中有机化合物的离子化作用，间接影响微生物。（3）极端的pH使微生物细胞内的酶活性降低，影响细胞内正常生化反应的进行。（4）极端的pH降低微生物对高温的抵抗力。六、干燥对微生物的影响

干燥使微生物细胞的代谢处于停滞状态。在干燥的条件下，细菌的芽孢、藻类和真菌的孢子及原生动物的胞可一直呈休眠状态长期存活。可利用干燥来保藏菌种。七、若干有机物对微生物的影响一、醇以体积分数为70%的乙醇杀菌力最强。二、甲醛质量浓度为370－400g/L的甲醛水溶液（即福尔马林）是常用的杀菌剂。三、表面活性剂包括酚、新洁尔乐（季胺盐）、合成洗涤剂、染料等。八、抗生素对微生物的影响抗生素是微生物在代谢过程中产生的能杀死或抑制其它微生物生长的化学物质。如青霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等。抗生素有广谱抗生素和狭谱抗生素之分。抗生素对微生物的影响表现在：（1）抑制微生物细胞壁的合成；（2）破坏微生物的细胞质膜；（3）抑制蛋白质的合成；（4）干扰核酸的合成。英国科学家A.Fleming爵士发现青霉素第四节微生物与微生物之间的关系一、竞争关系二、原始合作关系三、共生关系四、偏害关系五、捕食关系六、寄生关系一、竞争关系物种1物种2时间数量竞争关系是指不同的微生物种群在同一环境中，对食物等营养、溶解氧、空间和其它共同要求的物质互相竞争，通过产生某些代谢产物或改变环境条件，能抑制其它微生物的生长繁殖，或毒害杀死其它微生物，互相受到不利的影响。二、原始合作关系原始合作关系（或互生关系）是指两种可以单独生活的生物共存于同一环境中，相互提供营养及其它生活条件，双方互为有利，当两者分开时各自可单独生存。互生关系在自然界中普遍存在。三、共生关系物种1物种2时间数量共生关系是指两种不能单独生活的微生物共同生活于同一环境中，各自执行优势的胜利功能，在营养上互为有利，组成共生体，生理上相互分工，组织上形成了新的结构，彼此分离各自就不能很好地生活。如地衣是藻类与真菌形成的共生体。地衣组成：真菌（子囊菌，担子菌）单细胞藻类（绿藻，蓝藻）共生组成一种植物体；结构：有些种地衣真菌无规律地缠绕藻类细胞，另一些种地衣真菌与藻类形成一定层排列。当地衣繁殖了解情时，表面生出珠状粉芽。其中含有少量藻细胞和真菌丝，粉芽脱离母体。生理：地衣中的真菌和藻类已形成特殊形态的整体，在生理上相互依存，真菌营异养生活，藻类制造养料，真菌提供水分、无机盐供藻类光合作用。四、偏害关系偏害关系（或拮抗关系）是指共存于同一环境中两种微生物，甲方对乙方有害，乙方对甲方无任何影响。偏害关系可分为非特异性偏害和特异性偏害。五、捕食关系捕食关系即一种微生物以另一种微生物为食，如原生动物以水体和土壤中的细菌，放线菌，真菌的孢子及单细胞藻类为食。时间数量物种1物种2六、寄生关系时间数量寄主寄生菌寄生关系是指一种生物需要在另一种生物体内生活，从中摄取营养才能生长繁殖。前者为寄生菌，后者为寄主。寄生的结果一般引起寄主损伤或死亡。第五节菌种的退化、复壮与保藏一、菌种的退化和复壮二、菌种的保藏一、菌种的退化和复壮微生物由于负变（变异）而导致菌种退化。可采取相应的措施使退化菌株复壮。

纯种分离通过寄主复壮联合复壮二、菌种的保藏菌种保藏的方法有：一、传代培养保藏二、冷冻保藏三、干燥保藏法四、沙土管