液相色谱的新进展-超高效液相色谱课件

液相色谱新进展

－超高效液相色谱液相色谱新进展

Waters公司的UPLC:UltraPerformanceLiquidChromatography(超高效液相色谱）

Agilent公司的RRLC:RapidResolutionLiquidChromatography

（快速高分离度液相色谱）一、定义：用细粒径填料（sub-2μm)、细内径柱子获得柱效高达(100,000-300,000/m)的液相色谱技术，简称超高效液相色谱Waters公司的UPLC:一、定义：用细粒径填料（sub为什么关注小颗粒色谱填料？根据VanDeemter方程H=A+B/v+Cv颗粒度越小，HETP越低，柱效越高，分离度越好对于小颗粒，通过高流速获得高分离速度对于小颗粒，提高流速时HETP不会提高－提高分离速度二、基本原理为什么关注小颗粒色谱填料？根据VanDeemter方程H=节约时间节约溶剂超高灵敏度超高分离度缺点：高压力AgilentRRLC约450barWatersUPLC约700bar优点：三、优缺点：节约时间优点：三、优缺点：西洋参成分的分离比对HPLCUPLC4.6×250mm，5μm2.1×50mm，1.7μm西洋参成分的分离比对HPLCUPLC4.6×250mm，5μ1、提高分离速度小颗粒填料的速度优势分离度RS∝L/dp，即保持L/dp，同比缩短柱长,以提高分离速度提高流速－小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度提高速度的辅助手段温度1、提高分离速度小颗粒填料的速度优势不同色谱柱和温度的分离速度比对不同色谱柱和温度的分离速度比对2、提高分离度和灵敏度提高L/dp

（dp变小）－提高柱效－提高分离度对于4.6×150mm，5μm色谱柱，L/dp

＝30对于4.6×150mm，1.8μm色谱柱，L/dp

＝83.3

-改善分离度，保持分离速度对于4.6×100mm，1.8μm色谱柱，L/dp

＝55.6

-改善分离度，提高速度2、提高分离度和灵敏度提高L/dp（dp变小）－提高分离度：颗粒对药物杂质分离的影响分离度：颗粒对药物杂质分离的影响改善分离度和灵敏度改善分离度和灵敏度四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）1、分离目标化合物：根据中国药典（2005年版）确定分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1，结构如下：四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪2、药典色谱条件样品：西洋参提取液仪器：Agilent1100高效液相色谱系统流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）色谱柱：ZORBAXSBC184.6×150mm，5μm柱温：40ºC流速：1.0mL/min检测波长：203nm进样量：5μL2、药典色谱条件四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agil四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）HPLC色谱柱规格:4.6x150mm，5μm,(L/dp=30)。根据L/dp值初步确定RRLC色谱柱规格：4.6x50mm，1.8μm，(L/dp≈28）故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度。3、色谱柱的选择：四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）4、方法转换的初步参数确定在MethodTranslator相应栏目中输入原始HPLC条件，包括HPLC色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数，并选择RRLC色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的RRLC分离的初步参数。四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪五、方法优化：由于人参皂苷Rg1、Re未达到基线分离，可通过温度进一步优化分离四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）五、方法优化：四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agile应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）6、RRLC色谱条件确定：RRLC色谱条件：Agilent1200高分离度快速液相色谱(RRLC)，色谱柱：ZORBAXSBC184.6x50mm,1.8um流动相：A:0.1%H3PO4，B:乙腈，梯度分离柱温：25ºC流速：2mL/min检测波长：203nm进样量：5μL应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）6四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）7、西洋参分析：HPLC与RRLC分离色谱图比较四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪在RRLC系统上可以实现HPLC分离,此外还可以大幅度缩短分析时间，降低溶剂消耗，大大提高工作效率。与HPLC相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的RRLC可以显著改善分离灵敏度。温度对RRLC分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，节约时间四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）8、结论在RRLC系统上可以实现HPLC分离,此外还可以大幅度缩短分五、展望及结语填料粒径进一步减小增大柱效，进一步提高灵敏度和通量。提高温度（流动相的粘度和温度成正比，适当的提高温度可进一步降低压力，同时温度升高有利于传质、加快吸附脱附平衡均可以带来柱效的进一步提高。但要注意安全性。）总之，随着商品仪器的应用及逐渐推广，超高效液相色谱将成为复杂样品分析的一个强有力的工具。五、展望及结语填料粒径进一步减小增大柱效，进一步提高灵敏度和谢谢!Thankyouforyourattention谢谢!Thankyouforyourattentio液相色谱新进展

－超高效液相色谱液相色谱新进展

Waters公司的UPLC:UltraPerformanceLiquidChromatography(超高效液相色谱）

Agilent公司的RRLC:RapidResolutionLiquidChromatography

（快速高分离度液相色谱）一、定义：用细粒径填料（sub-2μm)、细内径柱子获得柱效高达(100,000-300,000/m)的液相色谱技术，简称超高效液相色谱Waters公司的UPLC:一、定义：用细粒径填料（sub为什么关注小颗粒色谱填料？根据VanDeemter方程H=A+B/v+Cv颗粒度越小，HETP越低，柱效越高，分离度越好对于小颗粒，通过高流速获得高分离速度对于小颗粒，提高流速时HETP不会提高－提高分离速度二、基本原理为什么关注小颗粒色谱填料？根据VanDeemter方程H=节约时间节约溶剂超高灵敏度超高分离度缺点：高压力AgilentRRLC约450barWatersUPLC约700bar优点：三、优缺点：节约时间优点：三、优缺点：西洋参成分的分离比对HPLCUPLC4.6×250mm，5μm2.1×50mm，1.7μm西洋参成分的分离比对HPLCUPLC4.6×250mm，5μ1、提高分离速度小颗粒填料的速度优势分离度RS∝L/dp，即保持L/dp，同比缩短柱长,以提高分离速度提高流速－小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度提高速度的辅助手段温度1、提高分离速度小颗粒填料的速度优势不同色谱柱和温度的分离速度比对不同色谱柱和温度的分离速度比对2、提高分离度和灵敏度提高L/dp

（dp变小）－提高柱效－提高分离度对于4.6×150mm，5μm色谱柱，L/dp

＝30对于4.6×150mm，1.8μm色谱柱，L/dp

＝83.3

-改善分离度，保持分离速度对于4.6×100mm，1.8μm色谱柱，L/dp

＝55.6

-改善分离度，提高速度2、提高分离度和灵敏度提高L/dp（dp变小）－提高分离度：颗粒对药物杂质分离的影响分离度：颗粒对药物杂质分离的影响改善分离度和灵敏度改善分离度和灵敏度四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）1、分离目标化合物：根据中国药典（2005年版）确定分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1，结构如下：四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪2、药典色谱条件样品：西洋参提取液仪器：Agilent1100高效液相色谱系统流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）色谱柱：ZORBAXSBC184.6×150mm，5μm柱温：40ºC流速：1.0mL/min检测波长：203nm进样量：5μL2、药典色谱条件四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agil四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）HPLC色谱柱规格:4.6x150mm，5μm,(L/dp=30)。根据L/dp值初步确定RRLC色谱柱规格：4.6x50mm，1.8μm，(L/dp≈28）故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度。3、色谱柱的选择：四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）4、方法转换的初步参数确定在MethodTranslator相应栏目中输入原始HPLC条件，包括HPLC色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数，并选择RRLC色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的RRLC分离的初步参数。四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪五、方法优化：由于人参皂苷Rg1、Re未达到基线分离，可通过温度进一步优化分离四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）五、方法优化：四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agile应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）6、RRLC色谱条件确定：RRLC色谱条件：Agilent1200高分离度快速液相色谱(RRLC)，色谱柱：ZORBAXSBC184.6x50mm,1.8um流动相：A:0.1%H3PO4，B:乙腈，梯度分离柱温：25ºC流速：2mL/min检测波长：203nm进样量：5μL应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）6四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）7、西洋参分析：HPLC与RRLC分离色谱图比较四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪在RRLC系统上可以实现HPLC分离,此外还可以大幅度缩短分析时间，降低溶剂消耗，大大提高工作效率。与HPLC相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的RRLC可以显著改善分离灵敏度。温度对RRLC分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，节约时间四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）8、结论在