相互作用蛋白质组学课件

蛋白质相互作用研究方法、酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术三、细胞共定位技术四、GSTPull-dow技术五、FRET(荧光共振能量转移技术)六、BiFC(双分子荧光互补技术)七、TAP(串联亲和纯化技术)八、Far-Westernblot(亲和印迹技术)蛋白质相互作用研究方法1、酵母双杂交技术1.基本概述2.基本过程3.应用与优缺点、酵母双杂交技术2基本概述酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质该系统利用了酵母的转录激活因子GAL4,含有的两个结构域,DNA结合域①dNAbindingdomain,BD)及转录激活域(activationdomain,AD),将已知基因(诱饵基因)和靶基因分别构建在含BD及AD质粒载体上,将两种质粒共同转化酵母感受态细胞,若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中的某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时,则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近,呈现GAL4转录因子的完全活性,激活下游的报告基因表达,从而在特定的选择性培养基上生长BaittranscriptionDNA-BDGALUASminimalpromoter基本概述3原理示意图靶蛋白结合对象DNA结合蛋白转录激活结构域蛋白把分别编码“诱饵”和“猎物”的重组基因引入酵母细胞酵母细胞捕获猎物1诱饵转录激活子↓报告基因的转录结合位点报告基因表达的蛋白原理示意图4MCSSV40NLSpGBKT778A0M)TLmppGADT7AD7.3kbHATag7988bpHLEUZ△c-MycepitopetagMCS5AH109ConstructsGALIUASGALITATAHIS3GALZUASGAL2TATAADEZMELTUASMELITATAMELlUASMEL1TATAMEL1His3是编码组氨酸合成的基因,3-AT是它的竞争性抑制剂;ADE2是编码腺苷酸合成酶的基因。lacZ是编码β-半乳糖苷酶的基因,可以用β半乳糖实验测定活性。MEL1编码α-半乳糖苷酶,可以降解X-α-Gal,产生蓝色。GAL1,GAL2和MEL1的上游激活序列(UAS)应答于GAL4转录激活因子。AH09衍生于PJ69-2A菌株,包括ADE2,HS3营养标记和一个内源的MEL基因,lacZ报告基因被引入PJ69-2A而得到AH109菌株AH109Constructs6基本过程构建表达载体构建表达载体醋酸锂转化法PGBKT7-BaitPGADT7-Prey转化酵母AH109(或直接提质粒)菌株感受态醋酸锂转化法转化酵母AH109拿测序结果进行Pey菌株自激活菌株感受态BLAST找出相应基因验证Bai菌株自激活对阳性克隆进行将BD-Bait与AD-Pre验证ColonyPCr后测序用醋酸锂转化法共转化酵母AH109菌株感受态,涂到含BDB酵母与文库中冷缺陷培养基检测三缺培养基上验证酵母混合培养形成二相互作用也可用其他方法验证「倍体在三缺培养基筛选基本过程7ncbi.nlm.nihgov/ATGGCGTCTTACCAGAACCGTCCAGGAGGTCAGGCCACTGACGAGTACGGAAACCCGATCCAGCAGCAGTATGACGAGTACGGAAATCCGATGGGAGGAGGAGGATACGGAACTGGTGGTGGTGGAGGAGCTACAGGTGGCCAAGGATACGGAACAGGTGGCCAAGGGTACGGATCAGGTGGCCAAGGGTACGGAACCGGTGGCCAAGGATACGGAACCGGGACCGGGACTGAAGGCTTTGGAACTGGCGGGCTTGGGAGGAATGCTTCACCGCTCCGGATCTGGATCCAGCTCTAGCTCTCAAGGAGAAGTTGCCAGGTCATCATGATCAGTCTGGTCAAGCTCAAGCGATGGGCGGCATGGGATCCGGATATGATGCTGGTGGCTACGGTGGTGAGCACCACGAGAAGAAGGGGATGATGGACAAGATCAAGGAAAAGCTTCCCGGTGGTGGCCGTTAAncbi.nlm.nihgov/8应用·发现新的相互作用蛋白质鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用建立基因组蛋白连锁图应用9优点1.快速获得相互作用蛋白质的基因;2.检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况3.作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤;4.检测的结果可以是基因表达产物的累积效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用;优点10相互作用蛋白质组学课件11相互作用蛋白质组学课件12相互作用蛋白质组学课件13相互作用蛋白质组学课件14相互作用蛋白质组学课件15相互作用蛋白质组学课件16相互作用蛋白质组学课件17相互作用蛋白质组学课件18相互作用蛋白质组学课件19相互作用蛋白质组学课件20相互作用蛋白质组学课件21相互作用蛋白质组学课件22相互作用蛋白质组学课件23相互作用蛋白质组学课件24相互作用蛋白质组学课件25相互作用蛋白质组学课件26相互作用蛋白质组学课件27相互作用蛋白质组学课件28相互作用蛋白质组学课件29相互作用蛋白质组学课件30相互作用蛋白质组学课件31相互作用蛋白质组学课件32相互作用蛋白质组学课件33相互作用蛋白质组学课件34相互作用蛋白质组学课件35相互作用蛋白质组学课件36相互作用蛋白质组学课件37相互作用蛋白质组学课件38相互作用蛋白质组学课件39相互作用蛋白质组学课件40相互作用蛋白质组学课件41相互作用蛋白质组学课件42相互作用蛋白质组学课件43相互作用蛋白质组学课件44蛋白质相互作用研究方法、酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术三、细胞共定位技术四、GSTPull-dow技术五、FRET(荧光共振能量转移技术)六、BiFC(双分子荧光互补技术)七、TAP(串联亲和纯化技术)八、Far-Westernblot(亲和印迹技术)蛋白质相互作用研究方法45、酵母双杂交技术1.基本概述2.基本过程3.应用与优缺点、酵母双杂交技术46基本概述酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质该系统利用了酵母的转录激活因子GAL4,含有的两个结构域,DNA结合域①dNAbindingdomain,BD)及转录激活域(activationdomain,AD),将已知基因(诱饵基因)和靶基因分别构建在含BD及AD质粒载体上,将两种质粒共同转化酵母感受态细胞,若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中的某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时,则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近,呈现GAL4转录因子的完全活性,激活下游的报告基因表达,从而在特定的选择性培养基上生长BaittranscriptionDNA-BDGALUASminimalpromoter基本概述47原理示意图靶蛋白结合对象DNA结合蛋白转录激活结构域蛋白把分别编码“诱饵”和“猎物”的重组基因引入酵母细胞酵母细胞捕获猎物1诱饵转录激活子↓报告基因的转录结合位点报告基因表达的蛋白原理示意图48MCSSV40NLSpGBKT778A0M)TLmppGADT7AD7.3kbHATag7988bpHLEUZ△c-MycepitopetagMCS49AH109ConstructsGALIUASGALITATAHIS3GALZUASGAL2TATAADEZMELTUASMELITATAMELlUASMEL1TATAMEL1His3是编码组氨酸合成的基因,3-AT是它的竞争性抑制剂;ADE2是编码腺苷酸合成酶的基因。lacZ是编码β-半乳糖苷酶的基因,可以用β半乳糖实验测定活性。MEL1编码α-半乳糖苷酶,可以降解X-α-Gal,产生蓝色。GAL1,GAL2和MEL1的上游激活序列(UAS)应答于GAL4转录激活因子。AH09衍生于PJ69-2A菌株,包括ADE2,HS3营养标记和一个内源的MEL基因,lacZ报告基因被引入PJ69-2A而得到AH109菌株AH109Constructs50基本过程构建表达载体构建表达载体醋酸锂转化法PGBKT7-BaitPGADT7-Prey转化酵母AH109(或直接提质粒)菌株感受态醋酸锂转化法转化酵母AH109拿测序结果进行Pey菌株自激活菌株感受态BLAST找出相应基因验证Bai菌株自激活对阳性克隆进行将BD-Bait与AD-Pre验证ColonyPCr后测序用醋酸锂转化法共转化酵母AH109菌株感受态,涂到含BDB酵母与文库中冷缺陷培养基检测三缺培养基上验证酵母混合培养形成二相互作用也可用其他方法验证「倍体在三缺培养基筛选基本过程51ncbi.nlm.nihgov/ATGGCGTCTTACCAGAACCGTCCAGGAGGTCAGGCCACTGACGAGTACGGAAACCCGATCCAGCAGCAGTATGACGAGTACGGAAATCCGATGGGAGGAGGAGGATACGGAACTGGTGGTGGTGGAGGAGCTACAGGTGGCCAAGGATACGGAACAGGTGGCCAAGGGTACGGATCAGGTGGCCAAGGGTACGGAACCGGTGGCCAAGGATACGGAACCGGGACCGGGACTGAAGGCTTTGGAACTGGCGGGCTTGGGAGGAATGCTTCACCGCTCCGGATCTGGATCCAGCTCTAGCTCTCAAGGAGAAGTTGCCAGGTCATCATGATCAGTCTGGTCAAGCTCAAGCGATGGGCGGCATGGGATCCGGATATGATGCTGGTGGCTACGGTGGTGAGCACCACGAGAAGAAGGGGATGATGGACAAGATCAAGGAAAAGCTTCCCGGTGGTGGCCGTTAAncbi.nlm.nihgov/52应用·发现新的相互作用蛋白质鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用建立基因组蛋白连锁图应用53优点1.快速获得相互作用蛋白质的基因;2.检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况3.作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤;4.检测的结果可以是基因表达产物的累积效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用;优点54相互作用蛋白质组学课件55相互作用蛋白质组学课件56相互作用蛋白质组学课件57相互作用蛋白质组学课件58相互作用蛋白质组学课件59相互作用蛋白质组学课件60相互作用蛋白质组学课件61相互作用蛋白质组学课件62相互作用蛋白质组学课件63相互作用蛋白质组学课件64相互作用蛋白质组学课件65相互作用蛋白质组学课件66相互作用蛋白质组学课件67相互作用蛋白质组学课件68相互作用蛋白质组学课件69相互作用蛋白质组学课件70