流式细胞术的质量控制和影响因素课件

流式细胞术的质量控制和影响因素流式细胞术的质量控制和影响因素课件1一、标本的采集和固定方法的质量控制

标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，需注意：①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。一、标本的采集和固定方法的质量控制2例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度固定效果好，因为高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良。

有作者分析研究了自溶对DNA测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随时间的延长，DNA含量呈梯度降低例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度3

根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检测质量也有显著的影响。例如细胞DNA的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度。实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。

4如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择。在不能及时检测又没有低温保存条件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点。如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织5

如所测抗原物质在细胞内，可以使用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱(0-4℃)放置即可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。

6二、单细胞悬液制备的质量控制

人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态，它是流式分析最合适的样品来源。

二、单细胞悬液制备的质量控制7二、单细胞悬液制备的质量控制

全血中含有多种有形成分，流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象，因此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来。例如，以淋巴细胞DNA定量分析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而将其他有核细胞或红细胞去除，对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤，出现血小板凝集二、单细胞悬液制备的质量控制8新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料来源，但对其分散单细胞样品的技术和方法，仍存在着很多问题，仍需大量的探索工作。就目前，国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法，甚至同样组织，用于不同的实验目的，就需要不同的方法处理，或者每一种组织就是一个单独的问题新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织9因此必须根据实际情况，去选择合适有效的单分散方法，选用的方法必须达到细胞产量高，细胞损伤小的目标，但实际工作中达到这个目标是困难的，多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法，化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等，根据各种组织的特点，以及实验目的的不同，可选择不同的方法。因此必须根据实际情况，去选择合适有效的10①选则酶学方法时，应注意选择酶类型的问题，含有大量结缔组织的，选择胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或胰酶。并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间，pH值，浓度等对酶活性的影响①选则酶学方法时，应注意选择酶类型的问题，含有大量结缔组织的11①酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结果，由于酶学方法分散下来的细胞产量低，用组织较多，还要注意酶的纯度，活性单位，以及生产厂家对酶的污染①酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实12②化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合使用，分散效果更佳。③机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细胞碎片多，细胞团块多，在使用机械法时，要给于组织适当的压力，这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。②化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合13④低渗方法，其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放出来，是一个裸核悬液样品，本方法简便，但要避免脱核时间过长，造成核膨胀碎裂。流式细胞术的质量控制和影响因素课件14

以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法，往往不是单用，常常是一种或二种方法的结合使用，总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困难，因此还需要深入探讨流式样品的制备技术，制备出完整细胞产量高，细胞损伤小的合格悬液,获得更好的流式检测结果。以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方15三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制

石蜡包埋组织标本的材料选择，应经病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核实病理诊断三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制16三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制

切取适当厚度的石蜡组织片，大量研究证明，切取40-50μm厚度的切片是适宜的，过厚的组织片消化费时，消化下来的细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞碎片，影响检测结果，使肿瘤异倍体的检出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度(5,10,20,30,40,50μm)对流式分析DNA的影响，发现较薄的切片造成碎片较多,噪音增加,组方图的基线提高,影响倍体分析的精度三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制17在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石蜡可影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，表示蜡已脱净在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留18梯度酒精(100%70%50%)水化要充分,使组织还原到与新鲜组织相似的状态。

消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用0.5%胃蛋白酶（PH1.5）梯度酒精(100%70%50%)水19石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：⑴样品中的碎片较多，所测得的DNA组方图质量不及新鲜组织好，组方图的峰位较宽，CV值偏大。⑵异倍体率减少，由于组方图细胞峰CV值较大，一些近于二倍体的DNA异倍体峰被掩盖石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流20石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：⑶S期细胞百分比不如新鲜组织的S期计算精确，S期细胞的计算偏高，这仍然与CV值较大有关石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使21⑷DNA二倍体标准不稳定

Schutter等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞DNA含量(例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为石蜡包埋组织细胞DNA含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳定⑷DNA二倍体标准不稳定22⑷DNA二倍体标准不稳定

对存档中的石蜡包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本，作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品(例如鸡血细胞等)⑷DNA二倍体标准不稳定23四、脱落细胞样品的采集

脱落细胞样品的采集要保证足够的细胞数，在临床实际工作中，可以收集到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞标本经简单处理后，即可得到较好的单分散细胞，例如胸腹水，内镜刷检细胞，膀脱冲洗液等四、脱落细胞样品的采集24四、脱落细胞样品的采集这些材料得到的流式结果，要谨慎的分析解释结果的生物学意义。因这些材料获得的结果常出现假阴性或假阳性。原因是其中的白细胞常有变性，且样品细胞数量少。制备出一个合格的单细胞样品，其细胞数要求在1×106/ml，其杂质碎片团块应小于2%以下，否则应放弃检测，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品中，至少应有20%的肿瘤细胞存在，(因占主峰1/5以上的异倍体峰才可确认为异倍体)四、脱落细胞样品的采集25

五、细胞悬液荧光染色的质量控制

单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要。目前常使用的荧光染料有EB、PI、DAPI、AO、FITC、PE等，对细胞染色时应特别注意染料的特性及量效关系，定量细胞学荧光染色易受到多种因素的影响，以致造成不正确的测定结果，了解荧光染色的影响因素，将有助于在荧光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误差，并进行有效的校正措施，如下的一些常见影响因素需特别注意。

五、细胞悬液荧光染色的质量控制26⒈温度对荧光染色强度的影响：

在一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响。温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动力增大，这就使荧光分子和其他分子之间的相互碰撞几率增加，使荧光猝灭的可能性增加。因此，影响了荧光分子发光量子产额⒈温度对荧光染色强度的影响：27⒈温度对荧光染色强度的影响：温度升高时，荧光减弱，荧光减弱的百分比称温度系数。就一般荧光物质而言，温度系数大约为1%，如果温度在20℃时，一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温度的升高，荧光猝灭作用越强，以致造成完全猝灭，温度在20℃以下，荧光分子发光量子产额的变化不明显，基本上保持恒量。因此在荧光测定时要保持染色后的样品在适当低温环境下运行，尽可能减少样品的照射时间，有条件时应使样品观察室做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结果⒈温度对荧光染色强度的影响：282.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：

在溶液较稀时，荧光强度与浓度成正比关系，随浓度加大，荧光强度也增大，当荧光染料达到一定浓度时，如继续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加，反而使荧光强度减低，这种因染料浓度增大使荧光量子的产额下降的现象称为浓度猝灭现象2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：292.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：

因此在研究浓度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度，还是曲线高峰后的浓度(方法是减少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓度)。鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影响之大，因此要选择最合适的浓度，对于荧光定量检测技术是极其重要的

2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：303.pH值对荧光发射强度的影响：

荧光分子在溶剂中处于离子化状态，因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响极大，荧光分子发光的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有的斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子都有自己合适的pH值3.pH值对荧光发射强度的影响：314.其他一些影响荧光强度的因素：

像醛类固定剂(戊二醛，甲醛),可以干扰荧光染料与核酸分子的结合,像溶剂中的一些不发光的物质(如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等)均可造成荧光的猝灭现象4.其他一些影响荧光强度的因素：32六、流式细胞分析资料处理的质量控制

样品中的碎片杂质和团块过多，所测细胞数仅占20%以下，组方图的基线抬高，尤其不能进行细胞周期分析，尽管目前有计算机的硬件删除或软件补偿来消除碎片和团块的影响，也应放弃不作分析处理六、流式细胞分析资料处理的质量控制33六、流式细胞分析资料处理的质量控制

一个样品细胞数检测应在1万个细胞(不包括碎片、杂质、团块)。如果单独作DNA倍体分析而不作细胞周期的处理，小于1万个细胞也可以，但异倍体细胞占总细胞数的10%以下时，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞的20%以上，可以确定异倍体的存在六、流式细胞分析资料处理的质量控制34正常二倍体细胞组方图的CV值大于8%以上，应放弃细胞周期的分析，但肿瘤细胞CV值大于8%，这与肿瘤细胞DNA异质性增大有关。

对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/1期细胞占85-90%左右，S+G2M细胞占10-15%，但在同一个体的不同正常组织，细胞DNA含量也有漂移，在不同个体的同源组织也会出现10%的漂移正常二倍体细胞组方图的CV值大于8%以35S期细胞可作为评价肿瘤的增殖活性指标。大量报道认为，S期有明显的临床预后意义，但S期计算方面容易产生误差,而造成评价S期在肿瘤生物学行为不确切性S期细胞可作为评价肿瘤的增殖活性指标36

对于S期细胞计算较准确的方法，就是分别作两次样品的检测，加入DNA倍体标准样品检测一次，不加二倍体标准的样品检测一次，G0/1峰应是一个正态分布(或称高斯分布)。但实际测量过程,有部分组方图有时会出现G0/1峰的右偏峰或脱尾(Teiling)现象，或出现一个右或左侧的峭峰(Kurtosis)，造成S期细胞计算的不准确性。对于这样峰位，除了可用计算机软件加以消除外，可放弃S期的计算对于S期细胞计算较准确的方法，就37DNA倍体标准的质量控制：

DNA倍体的标准是根据正常二倍体细胞DNA含量的分布范围而确定的，对于二倍体的标准的选择，应遵照如下原则：◆采用同个体同源正常组织。◆同种固定方法。◆相同的样品处理方法。◆同样的染色方法,同步染色。◆同样的仪器检测条件。◆正常二倍体细胞作为内标准。

DNA倍体标准的质量控制：38

◆在不具备同个体，同源组织的情况下，可以使用鸡红细胞，或其他生物细胞为内参标准，作为计算倍体的标准细胞，但这种标准细胞的使用，仅限于新鲜组织倍体的判定，对于石蜡包埋组织倍体标准，解决的办法是将正常组织与肿瘤组织同时包埋于一个石蜡组织块中，这样正常组织作为一个二倍体内标准,能减少DNA倍体分析的误差。

◆在不具备同个体，同源组织的情况下，可以使用鸡红细39假性异倍体的识别与排除：

假性异倍体多出现在近二倍体肿瘤(Neardiploid)或DNA指数小于1.30以下的异倍体肿瘤。

假性异倍体出现的原因主要有组织自溶造成或在组织固定前或期间，细胞DNA出现变性(而非降解阶段)，染色质结构发生变性，与荧光染料结合增加或减少，更多出现在异倍体细胞数仅占总测细胞数的5-10%的情况下

假性异倍体的识别与排除：40

对于二倍体为主峰的右侧出现的异倍体峰，用0.5%胃蛋白酶或1%的DNA酶消化3-5分钟，如果再测仍然出现异倍体峰可为真性异倍体，如果异倍体峰消失，则认为是假性异倍体。

对于二倍体峰左侧出现的异倍体峰(称亚二倍体)要首先排除自溶的原因。对于二倍体为主峰的右侧出现的异倍体峰41八、流式免疫学检测的质量控制

在免疫荧光染色过程中常出现一些人为非特异性荧光，造成本底荧光过高，出现假阳性结果，常见的原因有：

①降低抗体非特异性结合的措施不够。②洗涤不充分。③细胞重叠和凝集团块。④细胞碎片过多贴附在细胞上。八、流式免疫学检测的质量控制42解决这些影响因素的方法：

1使动物血清蛋白等封闭非特异性结合位点，荧光抗体染色后充分洗涤。2减少重叠细胞和碎片。3设对照样品，与抗体来源的同型对照和荧光抗体的本底对照解决这些影响因素的方法：43

对于需要保存不能马上进行定量分析的标本，在免疫荧光染色后，不固定可以在4℃放置48小时不出现荧光强度或标记阳性率降低。时间更长时需要进行固定保存，但固定方法要求方法步骤简单，固定液单一，不明显影响细胞膜表面抗原的免疫荧光标记，细胞体积和荧光强度等，可保存较长时间对于需要保存不能马上进行定量分析的标本44较理想的固定剂为1-4%的多聚甲醒缓冲液或4%的甲醒缓冲液(pH7.2)，实验证明，固定1-2个月，仍可得到较好定量分析结果，对细胞膜内的抗原物质的免疫荧光检测，可用70%的冷乙醇(4℃)固定可获得满意的检测结果较理想的固定剂为1-4%的多聚甲醒缓冲45流式细胞术的质量控制和影响因素流式细胞术的质量控制和影响因素课件46一、标本的采集和固定方法的质量控制

标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，需注意：①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。一、标本的采集和固定方法的质量控制47例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度固定效果好，因为高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良。

有作者分析研究了自溶对DNA测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随时间的延长，DNA含量呈梯度降低例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度48

根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检测质量也有显著的影响。例如细胞DNA的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度。实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。

49如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择。在不能及时检测又没有低温保存条件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点。如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织50

如所测抗原物质在细胞内，可以使用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱(0-4℃)放置即可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。

51二、单细胞悬液制备的质量控制

人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态，它是流式分析最合适的样品来源。

二、单细胞悬液制备的质量控制52二、单细胞悬液制备的质量控制

全血中含有多种有形成分，流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象，因此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来。例如，以淋巴细胞DNA定量分析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而将其他有核细胞或红细胞去除，对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤，出现血小板凝集二、单细胞悬液制备的质量控制53新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料来源，但对其分散单细胞样品的技术和方法，仍存在着很多问题，仍需大量的探索工作。就目前，国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法，甚至同样组织，用于不同的实验目的，就需要不同的方法处理，或者每一种组织就是一个单独的问题新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织54因此必须根据实际情况，去选择合适有效的单分散方法，选用的方法必须达到细胞产量高，细胞损伤小的目标，但实际工作中达到这个目标是困难的，多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法，化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等，根据各种组织的特点，以及实验目的的不同，可选择不同的方法。因此必须根据实际情况，去选择合适有效的55①选则酶学方法时，应注意选择酶类型的问题，含有大量结缔组织的，选择胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或胰酶。并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间，pH值，浓度等对酶活性的影响①选则酶学方法时，应注意选择酶类型的问题，含有大量结缔组织的56①酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结果，由于酶学方法分散下来的细胞产量低，用组织较多，还要注意酶的纯度，活性单位，以及生产厂家对酶的污染①酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实57②化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合使用，分散效果更佳。③机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细胞碎片多，细胞团块多，在使用机械法时，要给于组织适当的压力，这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。②化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合58④低渗方法，其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放出来，是一个裸核悬液样品，本方法简便，但要避免脱核时间过长，造成核膨胀碎裂。流式细胞术的质量控制和影响因素课件59

以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法，往往不是单用，常常是一种或二种方法的结合使用，总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困难，因此还需要深入探讨流式样品的制备技术，制备出完整细胞产量高，细胞损伤小的合格悬液,获得更好的流式检测结果。以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方60三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制

石蜡包埋组织标本的材料选择，应经病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核实病理诊断三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制61三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制

切取适当厚度的石蜡组织片，大量研究证明，切取40-50μm厚度的切片是适宜的，过厚的组织片消化费时，消化下来的细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞碎片，影响检测结果，使肿瘤异倍体的检出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度(5,10,20,30,40,50μm)对流式分析DNA的影响，发现较薄的切片造成碎片较多,噪音增加,组方图的基线提高,影响倍体分析的精度三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制62在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石蜡可影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，表示蜡已脱净在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留63梯度酒精(100%70%50%)水化要充分,使组织还原到与新鲜组织相似的状态。

消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用0.5%胃蛋白酶（PH1.5）梯度酒精(100%70%50%)水64石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：⑴样品中的碎片较多，所测得的DNA组方图质量不及新鲜组织好，组方图的峰位较宽，CV值偏大。⑵异倍体率减少，由于组方图细胞峰CV值较大，一些近于二倍体的DNA异倍体峰被掩盖石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流65石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：⑶S期细胞百分比不如新鲜组织的S期计算精确，S期细胞的计算偏高，这仍然与CV值较大有关石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使66⑷DNA二倍体标准不稳定

Schutter等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞DNA含量(例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为石蜡包埋组织细胞DNA含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳定⑷DNA二倍体标准不稳定67⑷DNA二倍体标准不稳定

对存档中的石蜡包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本，作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品(例如鸡血细胞等)⑷DNA二倍体标准不稳定68四、脱落细胞样品的采集

脱落细胞样品的采集要保证足够的细胞数，在临床实际工作中，可以收集到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞标本经简单处理后，即可得到较好的单分散细胞，例如胸腹水，内镜刷检细胞，膀脱冲洗液等四、脱落细胞样品的采集69四、脱落细胞样品的采集这些材料得到的流式结果，要谨慎的分析解释结果的生物学意义。因这些材料获得的结果常出现假阴性或假阳性。原因是其中的白细胞常有变性，且样品细胞数量少。制备出一个合格的单细胞样品，其细胞数要求在1×106/ml，其杂质碎片团块应小于2%以下，否则应放弃检测，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品中，至少应有20%的肿瘤细胞存在，(因占主峰1/5以上的异倍体峰才可确认为异倍体)四、脱落细胞样品的采集70

五、细胞悬液荧光染色的质量控制

单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要。目前常使用的荧光染料有EB、PI、DAPI、AO、FITC、PE等，对细胞染色时应特别注意染料的特性及量效关系，定量细胞学荧光染色易受到多种因素的影响，以致造成不正确的测定结果，了解荧光染色的影响因素，将有助于在荧光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误差，并进行有效的校正措施，如下的一些常见影响因素需特别注意。

五、细胞悬液荧光染色的质量控制71⒈温度对荧光染色强度的影响：

在一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响。温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动力增大，这就使荧光分子和其他分子之间的相互碰撞几率增加，使荧光猝灭的可能性增加。因此，影响了荧光分子发光量子产额⒈温度对荧光染色强度的影响：72⒈温度对荧光染色强度的影响：温度升高时，荧光减弱，荧光减弱的百分比称温度系数。就一般荧光物质而言，温度系数大约为1%，如果温度在20℃时，一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温度的升高，荧光猝灭作用越强，以致造成完全猝灭，温度在20℃以下，荧光分子发光量子产额的变化不明显，基本上保持恒量。因此在荧光测定时要保持染色后的样品在适当低温环境下运行，尽可能减少样品的照射时间，有条件时应使样品观察室做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结果⒈温度对荧光染色强度的影响：732.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：

在溶液较稀时，荧光强度与浓度成正比关系，随浓度加大，荧光强度也增大，当荧光染料达到一定浓度时，如继续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加，反而使荧光强度减低，这种因染料浓度增大使荧光量子的产额下降的现象称为浓度猝灭现象2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：742.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：

因此在研究浓度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度，还是曲线高峰后的浓度(方法是减少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓度)。鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影响之大，因此要选择最合适的浓度，对于荧光定量检测技术是极其重要的

2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：753.pH值对荧光发射强度的影响：

荧光分子在溶剂中处于离子化状态，因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响极大，荧光分子发光的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有的斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子都有自己合适的pH值3.pH值对荧光发射强度的影响：764.其他一些影响荧光强度的因素：

像醛类固定剂(戊二醛，甲醛),可以干扰荧光染料与核酸分子的结合,像溶剂中的一些不发光的物质(如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等)均可造成荧光的猝灭现象4.其他一些影响荧光强度的因素：77六、流式细胞分析资料处理的质量控制

样品中的碎片杂质和团块过多，所测细胞数仅占20%以下，组方图的基线抬高，尤其不能进行细胞周期分析，尽管目前有计算机的硬件删除或软件补偿来消除碎片和团块的影响，也应放弃不作分析处理六、流式细胞分析资料处理的质量控制78六、流式细胞分析资料处理的质量控制

一个样品细胞数检测应在1万个细胞(不包括碎片、杂质、团块)。如果单独作DNA倍体分析而不作细胞周期的处理，小于1万个细胞也可以，但异倍体细胞占总细胞数的10%以下时，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞的20%以上，可以确定异倍体的存在六、流式细胞分析资料处理的质量控制79正常二倍体细胞组方图的CV值大于8%以上，应放弃细胞周期的分析，但肿瘤细胞CV值大于8%，这与肿瘤细胞DNA异质性增大有关。

对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/1期细胞占85-90%左右，S+G2M细胞占10-15%，但在同一个体的不同正常组织，细胞DNA含量也有漂移，在不同个体的同源组织也会出现10%的漂移正常二倍体细胞组方图的CV值大于8%以80S期细胞可作为评价肿瘤的增殖活性指标。大量报道认为，S期有明显的临床预后意义，但S期计算方面容易产生误差,而造成评价S期在肿瘤生物学行为不确切性S期细胞可作为评价肿瘤的增殖活性指标81

对于S期细胞计算较准确的方法，就是分别作两次样品的检测，加入DNA倍体标准样品检测一次，不加二倍体标准的样品检测一次，G0/1峰应是一个正态分布(或称高斯分布)。但实际测量过程,有部分组方图有时会出现G0/1峰的右偏峰或