最新基因结构与表达分析的基本策略课件

基因结构与表达分析的基本策略基因结构与表达分析的基本策略12分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，1977聚合酶链式反应—DNA扩增，1985DNA重组技术—基因克隆，197322分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，197最新基因结构与表达分析的基本策略课件3最新基因结构与表达分析的基本策略课件4最新基因结构与表达分析的基本策略课件5最新基因结构与表达分析的基本策略课件6最新基因结构与表达分析的基本策略课件7最新基因结构与表达分析的基本策略课件8掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图9掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图9DNA单链模板引物掺入ddNTP延伸的新合成链

末端终止10DNA单链模板引物掺入ddNTP延伸的新合成链末端1.双脱氧末端终止法原理

DNA合成反应中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP

。111.双脱氧末端终止法原理DNA合成反应中，ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdT2.DNA测序主要步骤132.DNA测序主要步骤13A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管14A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管141515GATC16GATC16●变性聚丙烯酰胺凝胶电泳●单链DNA模板的制备●DNA模板与测序引物退火●掺入法标记反应●延伸-终止反应●放射自显影●阅读测序结果测序步骤17●变性聚丙烯酰胺凝胶电泳●单链DNA模板的制备●（二）DNA测序自动化原理

采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。18（二）DNA测序自动化原理采用4种不ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdT2020表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型21表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和DNA自动测序步骤

4种不同荧光染料标记终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物同一泳道电泳分离

激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光

荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序22DNA自动测序步骤4种不同荧光染料标记终止物ddNTPsSDyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries

23Dyelabeleddideoxyterminators

与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。

（三）化学降解法24与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化

将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。化学降解法原理25将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记

化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet26化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMe最新测序技术454技术(Roche)焦磷酸测序（Pyrosequencing）

Solexa测序技术(Illumina)SOLiD技术(ABI)连接法测序27最新测序技术454技术(Roche)27举例：Solexa测序HiSeq200028举例：Solexa测序HiSeq200028Solexa测序：在一个反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人类基因组草图不同测序仪的比较图29Solexa测序：在一个反应中同时加入4种核苷的标签，二、核酸分子杂交（NucleicAcidHybridization）（一）Southern印迹杂交：检测DNA

(Southernblothybridization)

SouthernEM

,1975（二）Northern印迹杂交：检测RNA

(Northernblothybridization)

StarkGR，197730二、核酸分子杂交（NucleicAcidHybridiz核酸分子杂交原理

标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链。

应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。31核酸分子杂交原理标记的单链核酸探针323233印迹技术

利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”,译为印迹技术。3333印迹技术3334探针技术

用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”。探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

3434探针技术34Southern印迹杂交原理

将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。（一）Southern印迹杂交应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定量分析。35Southern印迹杂交原理

将电泳分离1.制备基因组DNA2.用限制性内切核酸酶消化基因组DNA3.琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段4.凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链）

5.Southern印迹转移6.标记核酸探针、探针与DNA片段杂交7.杂交结果显示Southern印迹杂交基本过程361.制备基因组DNASouthern印迹杂交基本过程36Southern印迹杂交示意图37Southern印迹杂交示意图37将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。38将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固3939地中海贫血的Southernblot基因诊断（1）仅一条染色体上的一个α基因缺失或缺陷，则α链的合成部分受抑制，称为α+地贫；（2）每条染色体上的2个α基因均缺失或缺陷，称为α0地贫；

(3)α1、α2序列基本一致；基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。α1α2αααα+α+α+αα0α+α0α0α040地中海贫血的Southernblot基因诊断（1）仅一BamHIBamHIα2α1α2

10kb14kbprobe地中海贫血的直接基因诊断41BamHIBamHIα2α1α210kb14kbpro

αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb42αα/αααα/α-α（二）Northern印迹杂交

(Northernblothybridization)指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。用于mRNA进行定性和定量分析。43（二）Northern印迹杂交

(NorthernblRNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S应用举例44RNA琼脂糖凝胶电泳3kbNtNorthernblothGAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot杂交分析mRNA的表达靶mRNA3-磷酸甘油醛脱氢酶

450d2d4d6d8dNo46三、其他杂交技术1.斑点杂交(dotblothybridization）将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。4646三、其他杂交技术1.斑点杂交(dotblothy472.原位杂交

（insituhybridization）用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对定量分析。

47472.原位杂交

（insituhybridizatio3．核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay）单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则受到保护而不被降解。483．核酸酶S1保护分析法484．RNA酶保护分析法

（RNaseprotectionassay，RPA）494．RNA酶保护分析法49RPA基本程序：●待测RNA的分离●体外转录标记RNA探针●待测RNA与探针RNA进行液相杂交●RNA酶消化●不同大小杂交片段凝胶电泳分离50RPA基本程序：●待测RNA的分离50三、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)（一）PCR技术原理（二）耐热DNA聚合酶（三）PCR引物及设计原则（四）PCR条件的优化

（五）PCR改进技术（六）其它PCR技术51三、聚合酶链式反应(PolymeraseChainRea聚合酶链式反应(PCR):（一）PCR技术原理

Mullis

K.

1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。

TheNobelPrizeinChemistry199352聚合酶链式反应(PCR):（一）PCR技术原理ThereplicationofDNA53ThereplicationofDNA53

原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。54原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合1.PCR循环由三步组成：①变性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）高温合适温度合适温度551.PCR循环由三步组成：①变性（denaturatio565657572.PCR扩增终产物大小:介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段。循环一582.PCR扩增终产物大小:介于两条退火引物5′末循环二59循环二59循环三60循环三60一对引物：正向和反向

限制了PCR扩增的片段的范围5/——5/—3/3/—5/——5/—3/3/—61一对引物：正向和反向

限制了PCR扩增的片段的范围5/——5

5′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC

AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG

AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT

3.引物设计实例625′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCY=A（1+E）n

Y:扩增产物的量

A:

最初靶DNA分子数

E:PCR扩增效率

n:

循环次数

3.PCR产量

当E＝100％,A=1时

Y=2n>>2n(引物延伸产物的量）63Y=A（1+E）n3.PCR产量当E＝1（二）平台期与平台效应

1.平台效应（plateaueffect）：

PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。影响因素：①引物及dNTP底物浓度降低。②酶与模板比例下降。64（二）平台期与平台效应

1.平台效应（plateauefPCR平台效应65PCR平台效应65（二）耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动化）

从嗜热水生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分离出来。●

95℃的半衰期:40min●最适温度:72℃～80℃

●催化反应速率:150～300核苷酸/秒/酶分子66（二）耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动6767TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；●较弱的非模板依赖性；●缺乏3′→5′外切酶活性。68TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；68PCRthermalcycler69PCRthermalcycler69PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物70PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp无机离子及抑制剂的影响

TaqDNA聚合酶的活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。最适Mg2+浓度：2mmol/L

K+浓度：50mmol/L71无机离子及抑制剂的影响TaqDN几种高保真的耐热DNA聚合酶1.TthDNA聚合酶

2.VentDNA聚合酶

3.PfuDNA聚合酶72几种高保真的耐热DNA聚合酶1.TthDNA（三）PCR引物设计原则引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA复制引物：单链RNA片段PCR引物：单链DNA片段73（三）PCR引物设计原则引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DPCR引物设计原则：1.引物与模板的序列要完全互补2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配)74PCR引物设计原则：745′CACTGAACGTAGGCCT3′

3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特异扩增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′错误引发1.引物与模板的序列要紧密互补2.引物不能在模板的非目的位点引发

DNA聚合反应(错配)75特异扩增错误引发1.引物与模板的序列要紧密互补2.引引物之间应避免3′端互补3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构76引物之间应避免3′端互补3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚引物自身不应形成发夹结构77引物自身不应形成发夹结构774.其它原则:①引物长度:10～30nt②碱基分布:A、T、G、C随机分布③G+C含量：40～60%Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物3′末端碱基：最好选T、C、G，不选A避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC⑤引物5′末端碱基可不与模板DNA互补784.其它原则:①引物长度:10～30nt②碱基分布1A260oligoDNA≈33μgN:引物碱基数X：合成的oligoDNAA260单位Y：引物的pmol数

106Y（pmol）=X·33×──330.NX=──×105

N2.引物用量计算791A260oligoDNA≈33μg

模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+退火变性延伸PCR反应80模板退火变性延伸PCR反应80（四）PCR条件的优化1.TaqDNA聚合酶浓度：

1.0～2.5U/100μl反应液

2.dNTP浓度：20～200μmol/L

3.Mg2+浓度：0.5～2.5mmol/L

4.

引物浓度：0.1～0.5μmol/L81（四）PCR条件的优化1.TaqDNA聚合酶浓度：2（五）PCR改进技术1.RT-PCR(reversetranscriptionPCR)以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。82（五）PCR改进技术1.RT-PCR以mRNART-PCR原理83RT-PCR原理83逆转录酶①

AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性最适温度42℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最适温度37℃84逆转录酶①AMV（avianmyeloblastosis2.

定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量RT-PCR

以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导下共同PCR扩增“看家”基因和目的基因cDNA。852.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量RT-PCR

①

选择内对照基因

组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。②

半定量标准

计算PCR产物：

靶cDNA/GAPDHcDNA86①选择内对照基因②半定量标准86

③KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析87③KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分88883.

实时荧光定量RT-PCR

Real-timefluorescentquantitative–PCR，FQ-PCRPCR扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。

893.实时荧光定量RT-PCR

Real-timefluo①荧光染料90①荧光染料909191每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。92每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去②

TaqManProbe一种水解式荧光标记探针。寡核苷酸探针的5′端标记一个荧光报告基团（reporter），3′端标记一个荧光淬灭基团（quencher）。93②TaqManProbe一每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，

信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。94每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探。③

分子信标探针（MolecularBeaconProbe）该探针具有发夹结构，5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。95。③分子信标探针（MolecularBeaconPro探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。96探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。④实时荧光定量PCR计算原理PCR扩增效率的差异使相同的样品最终产量有很大差异97④实时荧光定量PCR计算原理PCR扩增效率的差异使相同的样品9898CT或Tc或Ct值：临界点循环（Thresholdcycle），即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数99CT或Tc或Ct值：临界点循环（Threshold100100

●传染病诊断、监测与疗效预后评估：

●揭示疾病发病机制101●传染病诊断、监测与疗效预后评估：101⑤

荧光定量PCR仪带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，配有电脑系统及分析软件。102⑤荧光定量PCR仪102（六）其它PCR技术1.反向PCR（inversePCR）原理

103（六）其它PCR技术1.反向PCR（inversePCR2.Alu-PCR

1042.Alu-PCR1043.原位PCR(in-situPCR)4.巢式PCR（nestedPCR）5.不对称PCR（asymmetricPCR）1053.原位PCR(in-situPCR)105

DNAChipandMicroarray

四、

基因芯片和微阵列

●

基因芯片上的阵列是由有规则排列的cDNA或寡核苷酸等样本所组成的。106DNAChipandMicroarray四、基宏阵列

(Macroarray)高密度微阵列(Microarray)举例：HPV诊断芯片107宏阵列

(Macroarray)高密度微阵列(MicroaDNA微阵列：●寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）●cDNA微阵列（cDNAmicroarray）在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子识别探针，能够平行分析大量基因转录表达，因此又被称为cDNA芯片。

108DNA微阵列：108DNA芯片（cDNA芯片）主要技术流程：样品荧光标记及芯片制备杂交反应及过程控制杂交信号检测信号分析与解读109DNA芯片（cDNA芯片）主要技术流程：样品荧光标记及芯片制CBACy5-标记cDNACy3-标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品1样品2Cy5/Cy3荧光标记RNA提取竞争性杂交显示基因表达量差异二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理110CBACy5-标记Cy3-标记CBACBACBACBACBADNA芯片技术的主要应用基因组分析及发现新的基因基因表达的研究DNA序列分析基因诊断和基因药物设计111DNA芯片技术的主要应用基因组分析及发现新的基因111五、Western免疫印迹Westernblotting原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。112五、Western免疫印迹WesteWestern免疫印迹信号检测原理113Western免疫印迹信号检测原理113蛋白质样品制备

SDS分离

蛋白质转膜Westernblot程序114蛋白质样品制备Westernblot程序114抗体与抗原杂交信号检测分析115抗体与抗原杂交115谢谢大家！116谢谢大家！116最新基因结构与表达分析的基本策略课件117基因结构与表达分析的基本策略基因结构与表达分析的基本策略118119分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，1977聚合酶链式反应—DNA扩增，1985DNA重组技术—基因克隆，19731192分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，197最新基因结构与表达分析的基本策略课件120最新基因结构与表达分析的基本策略课件121最新基因结构与表达分析的基本策略课件122最新基因结构与表达分析的基本策略课件123最新基因结构与表达分析的基本策略课件124最新基因结构与表达分析的基本策略课件125掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图126掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图9DNA单链模板引物掺入ddNTP延伸的新合成链

末端终止127DNA单链模板引物掺入ddNTP延伸的新合成链末端1.双脱氧末端终止法原理

DNA合成反应中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP

。1281.双脱氧末端终止法原理DNA合成反应中，ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT129ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdT2.DNA测序主要步骤1302.DNA测序主要步骤13A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管131A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管1413215GATC133GATC16●变性聚丙烯酰胺凝胶电泳●单链DNA模板的制备●DNA模板与测序引物退火●掺入法标记反应●延伸-终止反应●放射自显影●阅读测序结果测序步骤134●变性聚丙烯酰胺凝胶电泳●单链DNA模板的制备●（二）DNA测序自动化原理

采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。135（二）DNA测序自动化原理采用4种不ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT136ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdT13720表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型138表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和DNA自动测序步骤

4种不同荧光染料标记终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物同一泳道电泳分离

激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光

荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序139DNA自动测序步骤4种不同荧光染料标记终止物ddNTPsSDyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries

140Dyelabeleddideoxyterminators

与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。

（三）化学降解法141与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化

将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。化学降解法原理142将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记

化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet143化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMe最新测序技术454技术(Roche)焦磷酸测序（Pyrosequencing）

Solexa测序技术(Illumina)SOLiD技术(ABI)连接法测序144最新测序技术454技术(Roche)27举例：Solexa测序HiSeq2000145举例：Solexa测序HiSeq200028Solexa测序：在一个反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人类基因组草图不同测序仪的比较图146Solexa测序：在一个反应中同时加入4种核苷的标签，二、核酸分子杂交（NucleicAcidHybridization）（一）Southern印迹杂交：检测DNA

(Southernblothybridization)

SouthernEM

,1975（二）Northern印迹杂交：检测RNA

(Northernblothybridization)

StarkGR，1977147二、核酸分子杂交（NucleicAcidHybridiz核酸分子杂交原理

标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链。

应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。148核酸分子杂交原理标记的单链核酸探针14932150印迹技术

利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”,译为印迹技术。15033印迹技术33151探针技术

用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”。探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

15134探针技术34Southern印迹杂交原理

将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。（一）Southern印迹杂交应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定量分析。152Southern印迹杂交原理

将电泳分离1.制备基因组DNA2.用限制性内切核酸酶消化基因组DNA3.琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段4.凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链）

5.Southern印迹转移6.标记核酸探针、探针与DNA片段杂交7.杂交结果显示Southern印迹杂交基本过程1531.制备基因组DNASouthern印迹杂交基本过程36Southern印迹杂交示意图154Southern印迹杂交示意图37将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。155将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固15639地中海贫血的Southernblot基因诊断（1）仅一条染色体上的一个α基因缺失或缺陷，则α链的合成部分受抑制，称为α+地贫；（2）每条染色体上的2个α基因均缺失或缺陷，称为α0地贫；

(3)α1、α2序列基本一致；基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。α1α2αααα+α+α+αα0α+α0α0α0157地中海贫血的Southernblot基因诊断（1）仅一BamHIBamHIα2α1α2

10kb14kbprobe地中海贫血的直接基因诊断158BamHIBamHIα2α1α210kb14kbpro

αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb159αα/αααα/α-α（二）Northern印迹杂交

(Northernblothybridization)指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。用于mRNA进行定性和定量分析。160（二）Northern印迹杂交

(NorthernblRNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S应用举例161RNA琼脂糖凝胶电泳3kbNtNorthernblothGAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot杂交分析mRNA的表达靶mRNA3-磷酸甘油醛脱氢酶

1620d2d4d6d8dNo163三、其他杂交技术1.斑点杂交(dotblothybridization）将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。16346三、其他杂交技术1.斑点杂交(dotblothy1642.原位杂交

（insituhybridization）用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对定量分析。

164472.原位杂交

（insituhybridizatio3．核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay）单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则受到保护而不被降解。1653．核酸酶S1保护分析法484．RNA酶保护分析法

（RNaseprotectionassay，RPA）1664．RNA酶保护分析法49RPA基本程序：●待测RNA的分离●体外转录标记RNA探针●待测RNA与探针RNA进行液相杂交●RNA酶消化●不同大小杂交片段凝胶电泳分离167RPA基本程序：●待测RNA的分离50三、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)（一）PCR技术原理（二）耐热DNA聚合酶（三）PCR引物及设计原则（四）PCR条件的优化

（五）PCR改进技术（六）其它PCR技术168三、聚合酶链式反应(PolymeraseChainRea聚合酶链式反应(PCR):（一）PCR技术原理

Mullis

K.

1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。

TheNobelPrizeinChemistry1993169聚合酶链式反应(PCR):（一）PCR技术原理ThereplicationofDNA170ThereplicationofDNA53

原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。171原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合1.PCR循环由三步组成：①变性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）高温合适温度合适温度1721.PCR循环由三步组成：①变性（denaturatiPCR扩增终产物大小:介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段。循环一1752.PCR扩增终产物大小:介于两条退火引物5′末循环二176循环二59循环三177循环三60一对引物：正向和反向

限制了PCR扩增的片段的范围5/——5/—3/3/—5/——5/—3/3/—178一对引物：正向和反向

限制了PCR扩增的片段的范围5/——5

5′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC

AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG

AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT

3.引物设计实例1795′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCY=A（1+E）n

Y:扩增产物的量

A:

最初靶DNA分子数

E:PCR扩增效率

n:

循环次数

3.PCR产量

当E＝100％,A=1时

Y=2n>>2n(引物延伸产物的量）180Y=A（1+E）n3.PCR产量当E＝1（二）平台期与平台效应

1.平台效应（plateaueffect）：

PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。影响因素：①引物及dNTP底物浓度降低。②酶与模板比例下降。181（二）平台期与平台效应

1.平台效应（plateauefPCR平台效应182PCR平台效应65（二）耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动化）

从嗜热水生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分离出来。●

95℃的半衰期:40min●最适温度:72℃～80℃

●催化反应速率:150～300核苷酸/秒/酶分子183（二）耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动18467TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；●较弱的非模板依赖性；●缺乏3′→5′外切酶活性。185TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；68PCRthermalcycler186PCRthermalcycler69PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物187PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp无机离子及抑制剂的影响

TaqDNA聚合酶的活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。最适Mg2+浓度：2mmol/L

K+浓度：50mmol/L188无机离子及抑制剂的影响TaqDN几种高保真的耐热DNA聚合酶1.TthDNA聚合酶

2.VentDNA聚合酶

3.PfuDNA聚合酶189几种高保真的耐热DNA聚合酶1.TthDNA（三）PCR引物设计原则引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA复制引物：单链RNA片段PCR引物：单链DNA片段190（三）PCR引物设计原则引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DPCR引物设计原则：1.引物与模板的序列要完全互补2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配)191PCR引物设计原则：745′CACTGAACGTAGGCCT3′

3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特异扩增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′错误引发1.引物与模板的序列要紧密互补2.引物不能在模板的非目的位点引发

DNA聚合反应(错配)192特异扩增错误引发1.引物与模板的序列要紧密互补2.引引物之间应避免3′端互补3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构193引物之间应避免3′端互补3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚引物自身不应形成发夹结构194引物自身不应形成发夹结构774.其它原则:①引物长度:10～30nt②碱基分布:A、T、G、C随机分布③G+C含量：40～60%Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物3′末端碱基：最好选T、C、G，不选A避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC⑤引物5′末端碱基可不与模板DNA互补1954.其它原则:①引物长度:10～30nt②碱基分布1A260oligoDNA≈33μgN:引物碱基数X：合成的oligoDNAA260单位Y：引物的pmol数

106Y（pmol）=X·33×──330.NX=──×105

N2.引物用量计算1961A260oligoDNA≈33μg

模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+退火变性延伸PCR反应197模板退火变性延伸PCR反应80（四）PCR条件的优化1.TaqDNA聚合酶浓度：

1.0～2.5U/100μl反应液

2.dNTP浓度：20～200μmol/L

3.Mg2+浓度：0.5～2.5mmol/L

4.

引物浓度：0.1～0.5μmol/L198（四）PCR条件的优化1.TaqDNA聚合酶浓度：2（五）PCR改进技术1.RT-PCR(reversetranscriptionPCR)以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。199（五）PCR改进技术1.RT-PCR以mRNART-PCR原理200RT-PCR原理83逆转录酶①

AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性最适温度42℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最适温度37℃201逆转录酶①AMV（avianmyeloblastosis2.

定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量RT-PCR

以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导下共同PCR扩增“看家”基因和目的基因cDNA。2022.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量RT-PCR

①

选择内对照基因

组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。②

半定量标准

计算PCR产物：

靶cDNA/GAPDHcDNA203①选择内对照基因②半定量标准86

③KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析20