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第十三章

细胞的衰老

与凋亡人类自出生总要经过生长、发育、成熟、衰老直至死亡的几个阶段，这是生命的必然规律。有机体是由无数个细胞组成，因此，在探讨衰老与死亡时离不开细胞，对多细胞生物而言，细胞的衰老死亡和机体的衰老死亡是两个概念。细胞的衰老死亡并不等于机体的衰老死亡，因为在有机体发育的不同阶段，机体内总是有细胞在不断衰老与死亡。但细胞的衰老与机体的衰老却又是密切相关的，大多数机体细胞都要经未分化、分化到衰老直至死亡的历程。因此，机体的衰老是以细胞总体的衰老为基础的。细胞是生命活动的基本单位，对细胞衰老过程的研究必然为老年学，甚至为肿瘤生物学的研究提供依据。第一节细胞衰老细胞衰老（cellsenescence)也称细胞老化（cellaging),一般指细胞在形态与生化成分上的改变，进而发生生理功能障碍的现象。这是一个缓慢行进，随细胞年龄增高而加剧的过程。现代人类面临着三种衰老：第一种是生理性衰老，这是一切生物的普遍规律。第二是病理性衰老，使衰老现象提前发生，这种衰老又称为早衰。第三种是心理性衰老，是由于各种原因，所产生未老先衰的心理状态而影响机体的整体功能。对多细胞生物而言，细胞的衰老和死亡是两个不同的概念，机体的衰老并不等于所有细胞衰老，但细胞的衰老是同机体的衰老紧密相关。正常人的成纤维细胞，在体外培养条件下，即使条件适宜，其分裂次数也是有限的，并最终停止分裂而死亡。

Hayflick界限1961年Hayflick等报道，体外培养的人成纤维细胞具有增殖分裂的极限。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代50次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细胞只能培养15-30代就开始死亡。体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态只分裂了几代的年轻成纤维细胞，呈现薄层、细长的形态分离了50次的老的成纤维细胞，开始衰退，并很快死亡细胞体外衰老实验

Hayflick等还发现，动物体细胞在体外可传代的次数与物种的寿命有关。例如寿命为3年的小鼠，其培养细胞在体外的传代次数只有12次；而龟的寿命可达200年，细胞可以传140代。

胎儿肺成纤维细胞可在体外条件下传代50次，而成人肺成纤维细胞只能传代20次，可见细胞的增殖能力与供体的年龄有关。早老症(Hayflick—Guilford综合症)及Werner氏综合症患者的成纤维细胞在体外只能传代2—4次，其DNA合成亦较少，且细胞表面不具有正常成纤维细胞所具有的HLA（人白细胞抗原）抗原标记。早老症儿童与正常儿童的比较左边是正常健康的9岁儿童，右边是一个患早老症的8岁儿童Hayflick的工作表明：细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的；他们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是著名的Hayflick界限。细胞衰老的决定Hayflick为了确定培养的二倍体细胞的衰老是细胞本身决定的还是由于培养环境的恶化造成的。他又设计了巧妙的试验。将取自老年年男性细胞胞(无巴氏氏小体）和和年轻女性个个体细胞(间期可见见巴氏小体)进行单独或或混合培养养，结果混合合培养中中的两类类细胞的的倍增次次数与各各自单独独培养时时相同。即在同同一培养养基中，，当年轻轻的细胞胞旺盛增增殖时的的同时，，年老的的细胞就就停止生生长了。。结果说明明:决定细胞胞衰老的的因素在在细胞内内部，而而不是外外部的环环境。年轻的细细胞质与与年老的的完整细细胞融合合时，得得到的杂杂种细胞胞不能分分裂；而年老的的细胞质质与年轻轻的完整整细胞融融合时，，杂种细细胞的分分裂能力力与年轻轻细胞几几乎相同同。结果说明明:是细胞核核而不是是细胞质质决定了了细胞衰衰老的表表达。至此，Hayflick界限限为广大大的研究究者所接接受，认认为适用用于很多多种类型型的细胞胞，对于于这些细细胞来说说，衰老是不不可避免免的，衰衰老的原原因在于于细胞本本身。为了更进进一步的的探究体体外培养养的二倍倍体细胞胞衰老的的控制机机理，他他们又作作了一个个试验，，就是用用细胞松松弛素B处理细细胞，然然后离心心除去细细胞核，，得到胞胞质体，，在用胞胞质体与与完整细细胞进行行杂交观观察杂种种细胞衰衰老的表表达。细胞在体体内条件件下的衰衰老在机体内内，细胞胞的衰老老和死亡亡是常见见的现象象，甚至至在个体体发育的的早期也也会发生生。正常情况况下终生生保持分分裂的细细胞，其其分裂能能力是否否随着有有机体年年龄的增增高而下下降？它它们会不不会衰老老？通过研究究发现，，终生保保持分裂裂的小鼠鼠上皮细细胞，随随着年龄龄的增高高，细胞胞周期长长度明显显延长，，究其原原因，衰老动物物体内，，细胞分分裂速度度显著减减慢，其其原因主主要主要是G1期明明显延长长，分裂裂速度减减慢，而而S期的的长度变变化不大大。◆衰老个个体内的的环境因因素影响响了细胞胞的增殖殖和衰老老当用近交系小鼠进行行系列皮皮肤移植植实验时时（即当当F1变变老时，，移植到到F2身身上，依依次进行行延续移移植），，发现移移植的皮皮肤可生生活7-8年，，远远超超过其原原来供体体的寿命命，这表明衰衰老个体体内的环环境因素素影响了了上皮细细胞的增增殖和衰衰老。骨髓干细细胞移植植实验说说明随着着年龄的的增加，，干细胞胞增殖速速度也趋趋缓慢另外，如如果将老老年动物物进行强强辐射处处理，破破坏其免免疫干细细胞，然然后植入入年轻动动物的骨骨髓干细细胞，可可观察到到年老受受体动物物细胞免免疫功能能复壮。。而如果果移植的的骨髓干干细胞是是来自年年老的动动物，那那么免疫疫反应就就仍然保保持在较较低的水水平上，，不会复复壮。其其关键在在于供体体与受体体的年龄龄组合。。如此得得出的结结论是：：老年年动动物物干干细细胞胞的的免免疫疫缺缺陷陷只只是是在在老老年年受受体体中中才才表表达达。。老老年年动动物物体体内内似似乎乎存存在在有有阻阻抑抑细细胞胞或或阻阻抑抑因因子子，，抑抑制制了了免免疫疫反反应应。。衰老老细细胞胞结结构构的的变变化化细胞胞在在衰衰老老过过程程中中大大致致有有以以下下主主要要特特征征。。细胞胞核核结结构构的的衰衰老老变变化化中中最最明明显显的的是是核核膜膜的的内内折折和和染染色色质质固固缩缩化化；；染染色色体体端端粒粒缩缩短短。。糙面面内内质质网网的的总总量量减减少少；；致密密体体的的生生成成;线粒粒体体的的数数量量减减少少，，而而体体积积增增大大;与与衰衰老老关关系系紧紧密密的的是是线线粒粒体体DNA突突变变（（主主要要是是缺缺失失突突变变）），，线线粒粒体体DNA突突变变随随年年龄龄增增大大,并并与与衰衰老老呈呈正正相相关关。。蛋白白质质合合成成速速率率降降低低，，原原因因是是由由于于核核糖糖体体的的效效率率和和准准确确性性降降低低以以及及蛋蛋白白质质合合成成的的延延伸伸因因子子的的数数量量和和活活性性降降低低所所致致。。细胞质质膜的的粘性性增加加，流流动性性降低低。膜膜系统统通常常处于于凝胶胶相或或固相相；磷磷脂含含量逐逐步下下降。。细胞的的间隙隙连接接明显显减少少，组组成间间隙连连接的的膜内内颗粒粒聚集集体变变小。。细胞衰衰老的的机理理细胞衰衰老是是一个个非常常复杂杂的生生理过过程，，许多多学者者在这这方面面作过过广泛泛的研研究。。近几几十年年来，，有关关细胞胞衰老老的机机制，，提出出了许许多假假说，，但这些些假说说只是是从不不同侧侧面和和深度度探索索细胞胞衰老老的原原因，，各自自虽都都有一一定的的科学学依据据，但但大都都不能能解释释衰老老的全全部机机理。。(一））遗传传程序序论该学说说认为为衰老老是遗遗传的的程序序化过过程，，衰老老是特特定基基因控控制的的。1.DNA修复复能力力下降降表现为为不同物物种的的DNA修修复能能力与与物种种各自自的平平均寿寿命呈呈正相相关，，即高高寿命命的物物种比比低寿寿命的的物种种具有有更大大的DNA修复复能力力；同同一物物种内内，个个体的的DNA修修复能能力与与其所所处的的年龄龄呈负负相关关，即即高龄龄个体体的DNA修复复能力力小于于低龄龄个体体。认为，，这种DNA修复复能力力下降降是由由于基因因因受损损而表表达异异常，，细胞胞功能能失常常，衰衰老逐逐渐形形成。。并认认为修修复能能力是是生物物体长长期进进化的的结果果，由由遗传传因素素决定定。2.端端粒丢丢失说说Herley等等人对对染色色体端端粒进进行研研究发发现，，每个个端粒粒都是是由250-1500个个TTAGGG重复复顺序序组成成，是是由端端粒酶酶催化化合成成的。。在正常体体细胞胞中无端粒粒酶活活性，，不论论何时时进行行细胞胞分裂裂，总总有5-20个个碱基基对片片段丧丧失，，染色色体将将逐渐渐缩短短，这样还还有多多少可可利用用的端端粒碱碱基对对数量量，似似乎就就能预预示细细胞还还能分分裂多多久，，就象象细胞胞的衰衰老钟钟一样样，端端粒记记录着着细胞胞的年年龄并并预言言它的的死亡亡。他他们还还发现现癌细胞胞可产产生端端粒酶酶，合合成端端粒片片段，，以取取代那那些丢丢失的的片段段。Herley也也提示示，分分裂着着的细细胞中中端粒粒的不不断丢丢失可可促进进动脉脉粥样样硬化化、骨骨关节节炎、、骨质质疏松松症和和糖尿尿病的的发生生。3、衰衰老基基因学学说统计学学资料料表明明，子子女的的寿命命与双双亲的的寿命命有关关，各各种动动物都都有相相当恒恒定的的平均均寿命命和最最高寿寿命，，成人人早衰衰症病病人平平均39岁岁时出出现衰衰老，，47岁生生命结结束，，婴幼幼儿早早衰症症的小小孩在在1岁岁时出出现明明显的的衰老老，12〜〜18岁即即过早早夭折折。由由此来来看物物种的的寿命命主要要取决决于遗遗传物物质，，DNA链链上可可能存存在一一些““长寿寿基因因”或或“衰衰老基基因””来决决定个个体的的寿限限。研究表表明,当细细胞衰衰老时时，一一些衰衰老相相关基基因（（SAG））表达达特别别活跃跃，其其表达达水平平大大大高于于年轻轻细胞胞，已已在人人1号号染色色体、、4号号染色色体及及ⅹ染染色体体上发发现SAG。在对线线虫的的研究究中，，发现现基因因确可可影响响衰老老及寿寿限，，Caenrhabditiselegans的平均均寿命命仅3.5天，，该虫虫age-1单单基基因突突变，，可提提高平平均寿寿命65%，提提高最最大寿寿命110%，，age-1突突变型型有较较强的的抗氧氧化酶酶活性性，对对H2O2、农农药药、、紫紫外外线线和和高高温温的的耐耐受受性性均均高高于于野野生生型型。。在对对早早老老综综合合症症的的研研究究中中，，发发现现体体内内解解旋旋酶酶存存在在突突变变，，该该酶酶基基因因位位于于８８号号染染色色体体短短臂臂，，称称为为Wrn基基因因。。也有有很很多多例例子子不不符符合合甚甚至至反反对对基基因因程程序序论论，，最最突突出出的的例例子子是是饮饮食食对对蜜蜜蜂蜂的的影影响响，，蜂蜂王王吃吃王王浆浆可可活活六六年年之之久久，，而而工工蜂蜂3-6个个月月，，蜂蜂王王浆浆可可是是蜜蜜蜂蜂的的寿寿命命提提高高了了20倍倍。。他他们们的的寿寿命命不不同同不不是是由由于于昆昆虫虫遗遗传传基基因因不不同同，，他他们们的的基基因因组组是是相相同同的的，，只只是是由由于于饮饮食食的的不不同同。。（二二））自自由由基基理理论论(free-radicaltheory)自由由基基指指带带有有未未配配对对电电子子的的粒粒子子，，因因为为带带有有单单数数电电子子，，所所以以极极不不稳稳定定，，具具有有高高度度的的化化学学反反应应性性，，很很容容易易和和周周围围的的分分子子发发生生反反应应，，从从而而生生成成新新的的自自由由基基。。自自由由基基种种类类繁繁多多，，其其中中以以超超氧氧阴阴离离子子自自由由基基(··O2-)、、羟羟自自由由基基(··OH)等等活活性性氧氧簇簇自自由由基基(reactiveoxygenspecies,ROS)的的研研究究最最为为深深入入。。氧自自由由基基的的损损伤伤作作用用研究表明明，自由由基对生生物体内内大分子子产生极极大的危危害作用用，攻击击的主要要目标是是质膜、、细胞内内膜系统统、核内内的DNA以及及胞内的的蛋白质质。使质膜中中的不饱饱和脂肪肪酸氧化化；使蛋白质质中的羧羧基氧化化造成蛋蛋白质交交联、变变性、酶酶钝化；；使糖类化化合物降降解；使DNA链断裂裂、交联联、碱基基切除等等，抑制蛋白白质、核核苷酸和和脂肪酸酸的生物物合成。。细胞内清清除过多多的自由由基的机机制通过细胞胞内部自自身隔离离，使产产生自由由基的物物质或位位点与细细胞其它它组分分分开；保护性酶酶：主要要有超氧氧化物歧歧化酶(SOD)和过过氧化氢氢酶(CAT)，两者者协同起起保护性性作用。。其它抗氧氧化物分分子，如如维生素素E和维维生素C，它们们都是自自由基反反应的有有效终止止剂。随着年龄龄的增长长，机体体内产生生自由基基以及防防御自由由基的系系统之间间的平衡衡被打破破，自由由基的累累积增多多，清除除效率下下降，同同时伴随随着衰老老的发生生。关于人人类的的衰老老和寿寿命问问题人类寿寿命有有无极极限？？极限限是多多少？？抗衰衰老，，求长长寿，，古往往今来来，人人之常常情，，时至至今日日，更更为人人们所所关注注。研研究表表明：：哺乳动动物自自然寿寿命为为生长长发育育期的的5——7倍倍，借借此推推论，，人类类完成成生长长发育育约在在20~22周周岁，，自然然寿命命应是是100——150岁岁。哺乳动动物的的自然然寿命命为性性成熟熟的8—10倍倍。海弗里里克（（Hayflick）：：人体体细胞胞可进进行50次次左右右有丝丝分裂裂，每每次细细胞周周期为为2——4年年，这这样推推论，，人的的寿命命应在在120岁岁左右右。1.遗遗传传与人人类寿寿命：：先天天性，，父辈辈主宰宰。父父、母母享有有高寿寿，其其子女女往往往也是是高寿寿者。。2.寿寿命命与性性别有有关：：人寿寿保险险公司司统计计说明明，♀♀性动动物＞＞♂性性动物物，女女人＞＞男人人，为为什么么？众众说纷纷纭。。3.环环境境与人人类寿寿命：：后天天因素素多样样错综综复杂杂。体体魄、、环境境、心心理、、社会会、营营养、、疾病病等。。其中中营养养及体体力活活动较较为重重要。。4.职职业业与人人类寿寿命：：职职业作作为一一种重重要的的社会会因素素，对对人类类寿命命有一一定的的影响响。日日本统统计，，从事事管理理工作作人员员，平平均寿寿命最最长，，依次次为国国家机机关工工作人人员、、专业业技术术人员员、商商业工工作人人员、、农业业工作作人员员、一一般生生产工工人、、体力力劳动动者、、矿工工。总得得说说来来，，近近20年年来来，，细细胞胞衰衰老老的的研研究究取取得得了了长长足足的的进进步步，，但但离离开开真真正正揭揭示示细细胞胞衰衰老老的的本本质质，，还还要要走走很很长长的的路路。。一一旦旦揭揭开开了了细细胞胞衰衰老老的的秘秘密密，，那那么么延延缓缓衰衰老老，，延延长长寿寿命命将将成成为为可可能能，，但但辩辩证证唯唯物物主主义义告告诉诉我我们们，，真真正正的的长长生生不不老老是是不不可可能能的的。。我我们们研研究究了了解解细细胞胞衰衰老老死死亡亡规规律律，，目目的的并并不不是是为为了了避避免免死死亡亡，，而而是是要要延延缓缓细细胞胞衰衰老老的的到到来来。。我们们讴讴歌歌生生命命，，也也不不必必诅诅咒咒死死亡亡，，有有生生必必有有死死，，无无死死亦亦无无生生，，我我们们不不赞赞成成死死亡亡，，但但长长生生不不死死是是进进化化和和发发展展的的敌敌人人。。但但愿愿我我们们每每个个人人都都能能较较长长时时间间生生活活在在这这个个美美好好的的世世界界，，为为人人类类的的进进步步与与文文明明做做更更多多的的贡贡献献。。第二二节节细细胞胞凋凋亡亡细胞胞凋凋亡亡（（cellapoptosis））是是借借用用古古希希腊腊语语，，表表示示细细胞胞象象秋秋天天的的树树叶叶一一样样凋凋落落的的死死亡亡方方式式。。1972年年Kerr最最先先提提出出这这一一概概念念，，他他发发现现结结扎扎大大鼠鼠肝肝的的左左、、中中叶叶门门静静脉脉后后，，其其周周围围细细胞胞发发生生缺缺血血性性坏坏死死，，但但由由肝肝动动脉脉供供应应区区的的实实质质细细胞胞仍仍存存活活，，只只是是范范围围逐逐渐渐缩缩小小，，其其间间一一些些细细胞胞不不断断转转变变成成细细胞胞质质小小块块，，不不伴伴有有炎炎症症，，后后在在正正常常鼠鼠肝肝中中也也偶偶然然见见到到这这一一现现象象。。在细胞凋亡亡一词出现现之前，胚胚胎学家已已观察到动动物发育过过程中存在在着细胞程程序性死亡亡（programmeddeath，PCD）现象象，近年来来PCD和和细胞凋亡亡常被做为为同义词使使用，但两两者实质上上是有差异异的。首首先，PCD是一个个功能性概概念，描述述在一个多多细胞生物物体中，某某些细胞的的死亡是个个体发育中中一个预定定的，并受受到严格控控制的正常常组成部分分，而凋凋亡是一个个形态学概概念，指与与细胞坏死死不同的受受到基因控控制的细胞胞死亡形式式；其次，，PCD的的最终结果果是细胞凋凋亡，但细细胞凋亡并并非都是程程序化的。。2002年年诺贝尔生生理与医学学奖获得者者2002年年10月7日英国人人悉尼·布布雷诺尔、、美国人罗罗伯特·霍霍维茨和英英国人约翰翰·苏尔斯斯顿，因在在器官发育育的遗传调调控和细胞胞程序性死死亡方面的的研究获诺诺贝尔诺贝贝尔生理与与医学奖。。线虫Caenorhabditiselegans是研究个体体发育和细细胞程序性性死亡的理理想材料。。其生命周周期短，细细胞数量少少，有1031个-131个=959(cells)神经系统由由302个个细胞组成成。这些细细胞来自于于407个个前体细胞胞。这些前前体细胞中中有131个发生了了程序死亡亡。控制线线虫细细胞凋凋亡的的基因因主要要有3个Ced-3、Ced-4和Ced-9，Ced-3和Ced-4的的作用用是诱诱发凋凋亡。。在缺乏乏Ced-3、、Ced-4的的突变变体中中不发发生凋凋亡。。有多多余细细胞存存在。。Ced-9抑制制Ced-3、、Ced-4的的作用用。使使凋亡亡不能能发生生、Ced-9功功能不不足导导致胚胚胎因因细胞胞过度度凋亡亡而死死亡。。●概念：：细胞凋凋亡是一个个主动动的由由基因因决定定的自自动结结束生生命的的过程程，也也常常常被称称为细细胞程程序死死亡（（programmedcelldeath，，PCD）。。凋亡亡细胞胞将被被吞噬噬细胞胞吞噬噬。一、细细胞凋凋亡的生物学学意义义在发育育过程程中和和成熟熟组织织中，，细胞胞发生生凋亡亡的数数量是是惊人人的。。健康康人体体内，，每小小时约约有10亿亿个细细胞凋凋亡。。通过过凋亡亡，保保持机机体的的自稳稳平衡衡，使使有机机体得得以清清除不不再需需要的的细胞胞，而而不引引起炎炎症反反映。。鼠发育过过程中中足的的成形形过程程发育过过程中中手和和足的的形成成过程程就伴伴随着着细胞胞的凋凋亡。。胚胎胎时期期，他他们呈呈铲状状，以以后指指或趾趾之间间的细细胞凋凋亡，，才逐逐步发发育为为成形形的手手和足足。蝌蚪尾尾的消消失当蝌蚪蚪变态态成蛙蛙时，，蝌蚪蚪尾内内的的的细胞胞发生生编程程性细细胞死死亡，，其结结果是是尾消消失。。变态态期间间出现现的全全部变变化包包括尾尾内编编程性性细胞胞死亡亡的诱诱导都都是被被血液液中胸胸腺激激素含含量升升高所所促进进的。。脊椎动动物的的神经经系统统的发发育脊椎动动物的的神经经系统统在发发育过过程中中，约约有50%的细细胞凋凋亡，，通过过细胞胞凋亡亡来调调节神神经细细胞的的数量量，使使之与与需要要神经经支配配的靶靶细胞胞的数数量相相适应应。胚胚胎发发育过过程中中产生生了过过量的的神经经细胞胞，它它们竞竞争靶靶细胞胞所分分泌的的生存因因子，只有有接受受了足足够量量的生生存因因子的的神经经细胞胞才能能存活活。细胞调调亡的生物学学意义义：生物发发育过过程中中及成成体组组织中中正常常的细细胞凋凋亡有有助于于保证证细胞胞只在在需要要它们们的时时候和和需要要它们们活的的地方方存活活。这这对于于多细细胞生生物个个体发发育的的正常常进行行，自自稳平平衡的的保持持以及及抵御御外外界各各种因因素的的干干扰方方面都都起着着非常常关键键的作作用。。二、细胞凋凋亡的的形态态学和和生物物化学学特征征坏死细细胞凋凋亡细细胞细胞坏坏死是细胞胞受到到急性性强力力伤害害时立立即出出现的的早期期反应应。包包括胞胞膜直直接破破坏，，大量量水进进入细细胞，，线粒粒体外外膜肿肿胀而而密度度增加加。核核染色色质呈呈絮状状，蛋蛋白质质合成成减慢慢。如如及时时去除除伤害害因素素，以以上早早期反反应尚尚可逆逆转。。若伤害害外因因持续续存在在，则则发生生不可可逆的的变化化。Ca2+升高、、引起起一系系列变变化，，如细细胞骨骨架破破坏，，溶酶酶体释释放，，pH下降降，最最后细细胞膜膜和细细胞器器破裂裂，DNA降解解，细细胞内内容物物流出出，引引起周周围组组织炎炎症反反应.细胞凋凋亡与与坏死死的区区别是是：①染色色质聚聚集、、分块块、位位于核核膜上上，胞胞质凝凝缩，，最后后核断断裂，，细胞胞通过过出芽芽的方方式形形成许许多凋凋亡小小体；②凋亡小小体内有有结构完完整的细细胞器，，还有凝凝缩的染染色体，，可被邻邻近细胞胞吞噬消消化，因因始终有有膜封闭闭，没有有内溶物物释放，，故不会会引起炎炎症；③线粒体体无变化化，溶酶酶体活性性不增加加；④内切酶酶活化，，DNA有控降降解，凝凝胶电泳泳图谱呈呈梯状；；⑤凋亡通通常是生生理性变变化，而而细胞坏坏死是病病理性变变化。细胞凋亡亡的形态态学特征征细胞质缓缓慢收缩缩染色质质包装和和分离，，细胞质质凝集核片段化化发芽、、起泡细细胞裂成成小片成成为凋亡亡小体凋亡小体体吞噬细胞胞吞噬细胞凋亡亡的生化化特征细胞凋亡亡的最主主要特征征是DNA发生生核小体体间的断断裂，结结果产生生含有不不同数量量核小体体单位的的片段，，在进行行琼脂糖糖凝胶电电泳时，，形成了了特征性性的梯状状条带(DNAladders)，其大大小为180——200bp的的整数倍倍。到目目前为止止，梯状状条带仍仍然是鉴鉴定细胞胞凋亡最最可靠的的方法。。诱导细胞胞凋亡的的因子◆物理性因因子，包包括射线线（紫外外线，射线等）），较温温和的温温度刺激激（如热热激，冷冷激）等等◆化学及及生物因因子：包包括活性性氧基团团和分子子，DNA和和蛋白质质合成的的抑制剂剂，激素素，细胞胞生长因因子，肿肿瘤坏死死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体体等.细胞凋亡亡的检测测◆形态学学观测：：染色法法、透射射和扫描描电镜观观察应用各种种染色法法可观察察到凋亡亡细胞的的各种形形态学特特征，有有些染料料如台盼盼蓝(trypanblue)为为活细胞胞排斥，，但可使使死细胞胞着色。。DAPI是常常用的一一种与DNA结结合的荧荧光染料料。借助助DAPI染色色，可以以观察到到细胞核核的形态态变化。。Giemsa染色法法可以观观察到染染色质固固缩、趋趋边、凋凋亡小体体的形成成等形态态。此外外，使用用透视和和扫描电电镜则可可观察凋凋亡细胞胞核的形形态、结结构变化化如染色色质因缩缩、凋亡亡小体的的形成、、细胞发发泡等现现象。有时也有有用两种种染料进进行复染染，以便便更可靠靠地确定定细胞凋凋亡的变变化。例例如用吖吖啶橙(AO)和溴乙乙锭(EB)进进行复染染，AO只进入入活细胞胞，正常常的细胞胞核及处处于凋亡亡早期的的细胞核核呈现绿绿色；EB只能能进入死死细胞，，将死细细胞及凋凋亡晚期期细胞的的核染成成橙红色色。◆DNA电泳：：细胞发生生凋亡时时，DNA发生生特征性性的核小小体间的的断裂，，产生大大小不同同的片段段，但都都是180-200bp的整整数倍。。凋亡细细胞中提提取的DNA在在进行常常规的琼琼脂糖凝凝胶电泳泳，并用用溴乙锭锭进行染染色时，，这些大大小不同同的DNA片段段就呈现现出梯状状条带。。绝大多多数凋亡亡细胞中中DNA的断裂裂都表现现出这种种特征.◆TUNEL测测定法，，即DNA断裂裂的原位位末端标标记法TUNEL测定定法(是是terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)–mediateddUTPnickendlabeling的缩写写)，意意指末端端脱氧核核苷酸移移换酶介介导的dUTP缺口末末端标记记测定法法。这一一方法能能对DNA分子子中3’’-OH断裂缺缺口进行行原位标标记。凋凋亡细胞胞的核DNA中中产生的的3’-OH末末端，可可借助一一种可观观测的标标记物，，如荧光光素进行行原位标标记，并并用荧光光显微镜镜进行观观察。◆彗星电电泳法（（cometassay））彗星电泳泳法(cometassay)的的原理是是将单个个细胞悬悬浮于琼琼脂糖凝凝胶中，，经裂解解处理后后，再在在电场中中进行短短时间的的电泳，，并用荧荧光染料料染色，，凋亡细细胞中形形成的DNA降降解片段段，在电电场中泳泳动速度度较快，，使细胞胞核呈现现出一种种彗星式式的图案案；而正正常的无无DNA断裂的的核在泳泳动时保保持圆球球形，这这是一种种快速简简便的凋凋亡检测测法。◆流式细胞胞分析最常用来来分析细细胞凋亡亡的流式式细胞技技术是根根据凋亡亡细胞DNA断断裂和丢丢失，采采用碘化化丙锭使使DNA产生激激发荧光光，用流流式细胞胞仪检出出凋亡的的亚二倍倍体细胞胞，同时时又能观观察细胞胞的周期期状态。。三、细胞胞凋亡的的分子调调控机理理●线虫(C.elegans)凋亡研研究发现现ced3,ced4基因促促进细胞胞凋亡，，ced9基因因阻止ced3/ced4的的激活，，抑制细细胞凋亡亡。Ced3哺哺乳类同同源物是是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1Caspase家族与与凋亡Caspase家族Caspase活性位位点是半半胱氨酸酸(Cysteine)，裂裂解靶蛋蛋白位点点是天冬冬氨酸残残基后的的肽键，，因此称称为Cysteineasparticacicspecificprotease，，即Caspase这种高度度的特异异性在蛋蛋白酶中中是很少少见的。。由于这这种特异异性，使使caspase能够够高度选选择性地地切割某某些蛋白白质，这这种切割割只发生生在少数数(通常常只有1个)位位点上，，主要是是在结构构域间的的位点上上，切割割的结果果或是活活化某种种蛋白，，或是使使某种蛋蛋白失活活，但从从不完全全降解一一种蛋白白质。caspase的研究究源于线线虫(C.elegans)细胞程程序化死死亡的研研究。研研究发现现有11个基因因与线虫虫PCD有关，，其中ced3和ced4基基因是决决定细胞胞凋亡所所必需的的，ced9基基因抑制制PCD。线虫虫细胞程程序化死死亡的研研究促进进了其他他动物特特别是哺哺乳类动动物中细细胞凋亡亡的研究究。人们们发现哺哺乳类细细胞中存存在着Ced3的同源源物ICE(interleukin1convertingenzyme)，，Ced4的哺乳乳类同源源物是Apaf1(即即一种细细胞凋亡亡蛋白酶酶活化因因子apoptosisproteaseactivatingfactor)，，而Ced9的的哺乳类类对应物物是BCL2.现已确定定至少存存在11种caspase：：这些caspases中，caspase1、、11、4被被认为不不直接参参与凋亡亡信号的的转导，，它们主主要参与与白介素素前体的的活化；而caspase2、8、9、、10参与细细胞凋亡亡的起始始；参与细胞胞凋亡执执行的则则是caspase3、、、6、7，其其中caspase3和7具有相相近的底底物和抑抑制剂特特异性，，它们降降解PARP、、DFF-45(DNAfragmentationfactor45)，导致致DNA修复的的抑制并并启动DNA的的降解。。而caspase6的底物物是laminA和和keratin18，它它们的降降解导致致核纤层层和细胞胞骨架的的崩解。。caspase超家家族成员员及其相相应底物物Caspase活化Caspase自身以以非活化化的Procaspase存存在，其其激活依依赖于其其他的Caspase在它的的天冬氨氨酸位点点裂解活活化或自自身活化化，即在在两个亚亚基的连连接区的的天冬氨氨酸位点点进行切切割而产产生有两两个亚基基组成的的异二聚聚体。目前认为为细胞凋凋亡的起起始者（（Caspase2、8、、9、10）和和执行者者（Caspase3、6、7））之间存存在着上上下游关关系，即即起始者者活化执执行者。。凋亡的起起始者（（Caspase2、8、、10））的活化化要求下下列成员员参与：：(1)配配体/受受体对，，如FasL/Fas受体.(2)连连接器或或接头蛋蛋白FADD(3)修修饰子蛋蛋白(4)Caspase2、8、、10的的酶原。。当Fas受体为为其天然然配体FasL所启动动时，就就形成了了Fas受体、、连接器器蛋白FADD和Caspase2、8、10的酶原原组成的的死亡诱诱导信号号复合物物。胞外信号号分子诱诱导的细细胞凋亡亡途径当细胞接接受凋亡亡信号分分子(Fas,TNF等)后后，凋亡亡细胞表表面信号号分子受受体相互互聚集并并与细胞胞内的衔衔接蛋白白(Adaptorprotein)结结合，这这些衔接接蛋白又又募集Procaspases聚集集在受体体部Procaspase相相互活化化并产生生级联反反应，使使细胞凋凋亡.下游Caspases活化后后，作用用于底物物，裂解解核纤层层蛋白，，导致细细胞核形形成凋亡亡小体；；裂解DNase结合合蛋白，，使DNase释放，，降解DNA形形成DNALadder;裂解参参与细胞胞连接或或附着的的骨架和和其他蛋蛋白，使使凋亡细细胞皱缩缩、脱落落，便于于细胞吞吞噬；导导致膜脂脂PS重重排，便便于吞噬噬细胞识识别并吞吞噬。Bcl-2家族族、线粒粒体与细细胞凋亡亡◆Bcl-2是是一种原原癌基因因，是ced-9在哺哺乳类中中的同源源物，能能抑制细细胞凋亡亡；与线线粒体及及内质网网膜相结结合；Bcl-2蛋白白的羧基基末端有有一穿膜膜的结构构域；Bcl-2家族族成员的的基因中中，常常常含有三三个保守守的Bcl-2同源区区，即BH1，，BH2和BH3。BCL-2家族族成员二、细胞胞凋亡的的分子机机理（一）、、细胞凋凋亡相关关基因对哺乳动动物细胞胞凋亡的的基因凋凋控过程程目前还还不十分分清楚，，研究表表明与细细胞增殖殖有关的的原癌基基因和抑抑癌基都都参于对对细胞凋凋亡的凋凋控。其其中研究究较多的的有bcl-2c-myc、p53、Ice、、Fas/APO-1等。1、myc在许多人人类恶性性肿瘤细细胞中都都发现有有c-myc的的过度表表达，它它能促进进细胞增增殖、抑抑制分化化。c-myc还参于于细胞调调亡的控控制。在在凋亡细细胞中c-myc也是是高表达达。c-myc对增殖殖和凋亡亡的调节节是一样样的。作作为转录录凋控因因子，一一方面激激活那些些控制细细胞增殖殖的基因因，另一一方面也也激活促促进细胞胞凋亡的的基因，，给细胞胞两种选选择：增增殖或凋凋亡。当当生长因因子存在在，bcl-2基因表表达时，，促进细细胞增殖殖，反之之细胞凋凋亡。2、、bcl-2即即：：细胞胞凋凋亡亡抑抑制制基基因因，，名名称称来来源源于于B细细胞胞淋淋巴巴瘤瘤/白白血血病病-2(B-celllymphoma/Leukemia-2，，bcl-2)，，最最早早由由Tsujimoto（（1985））从从伴伴有有14、、18染染色色体体易易位位的的淋淋巴巴瘤瘤细细胞胞中中发发现现，，在在正正常常人人体体内内位位于于18号号染染色色体体，，在在患患者者易易位位于于14号号染染色色体体。。bcl-2是是目目前前发发现现的的与与凋凋亡亡关关系系密密切切的的原原癌癌基基因因之之一一，，能够够编编码码bcl-2αα（（26KD））和和bcl-2ββ（（22KD））两两种种蛋蛋白白质质，，是是膜膜的的整整合合蛋蛋白白，，主主要要存存在在于于线线粒粒体体外外膜膜、、核核膜膜及及部部分分内内质质网网中中，，它它很很少少与与其其他他生生化化机机制制已已清清楚楚的的蛋蛋白白同同源源。。bcl-2蛋蛋白白在在正正常常组组织织自自身身稳稳定定方方面面起起重重要要作作用用，，bcl-2多多出出现现在在胸胸腺腺髓髓质质细细胞胞、、记记忆忆B淋淋巴巴细细胞胞、、及及寿寿命命长长的的干干细细胞胞群群里里，，如如皮皮肤肤、、结结肠肠、、前前列列腺腺和和子子宫宫内内膜膜中中，，但但很很少少出出现现在在分分化化末末期期的的上上皮皮细细胞胞中中。。bc1-2的功功能相相当于于线虫虫中的的ced9，bc1-2家族族包括括bcl-2、、bax、、bad、、bcl-x等等。bax基因因是bcl-2基因因家族族的一一员，，其产产物是是一种种与bcl-2同源源的相相关蛋蛋白，，能拮拮抗后后者的的生物物学活活性。。bax的主主要作作用是是加速速细胞胞凋亡亡，并并与bcl-2一起起调节节细胞胞凋亡亡。bcl-2家族族的成成员通通常以以二聚聚体的的形式式发挥挥作用用，bcl-2/bcl-2，，bcl-2/bax和和bcl-2/bcl-xL抑制制细胞胞凋亡亡，而而bax/bax，，bax/bad和和bcl-2/bax-xs促进进细胞胞凋亡亡。Bad也属属bcl-2基基因家家族，，是是bcl-2/bcl-xL相关关死亡亡促进进因子子，作作为bcl-2/bcl-xL异异二聚聚体伴伴分子子而促促进细细胞凋凋亡。。bcl-x通通过剪剪切可可形成成bcl-xl和blc-xs两两个产产物。。bcl-xl与bcl-2同源源，抑抑制细细胞凋凋亡，，而bcl-xs作作用类类似bax，诱诱导细细胞凋凋亡。。3、fasfas又称称作APO-1，属属TNF受受体和和NGF受受体家家族。。1993年年人白白细胞胞分型型国际际会议议统一一命名名为CD95。。fas基基因编编码产产物为为分子子量45KD的的跨膜膜蛋白白，分分布于于胸腺腺细胞胞、T淋巴巴细胞胞、B淋巴巴细胞胞、NK细细胞、、内皮皮细胞胞、上上皮细细胞以以及皮皮肤角角质形形成细细胞等等等。。Fas蛋白白与Fas配体体组成成Fas系系统，，二者者的结结合导导致靶靶细胞胞走向向凋亡亡。4、ICE蛋白白酶家家族ICE蛋白白酶参参与Fas和TNFR1诱导导的细细胞凋凋亡，，ICE与线线虫细细胞凋凋亡基基因ced-3同源源，迄迄今已已发现现了11个个同源源基因因，1996年年后这这些家家族成成员统统称为为Caspase，，能选选择性性地切切割蛋蛋白质质使其其失活活或激激活。。ced-4在在哺乳乳动物物中的的同源源体为为Apaf-1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1)，，Apaf-1具具有激激活Caspase3(CPP32)的的作用用，而这一一过程程又需需要其其他两两个蛋蛋白质质因子子的参参与：：细胞胞色素素c(Apaf-2)、、Apaf-3。5、p53是一种种抑癌癌基因因，其生物物学功功能是是在细细胞周周期中中监视视DNA的的完整整性。。如有有损伤伤，则则抑制制细胞胞增殖殖。直直到DNA修复复完成成。如果DNA不能能被修修复，，则诱诱导其其调亡亡