广泛耐药肺炎克雷伯菌耐药表型分析及耐药机制研究

广泛耐药肺炎克雷伯菌耐药表型分析及耐药机制研究肺炎克雷伯菌是临床常见的机会致病菌，在免疫抑制及住院患者中，引发多种感染性疾病，包括呼吸系统感染、泌尿系统感染、血流感染等，继而延长住院时间，增加死亡率和医疗开支［1,

2］。碳青霉烯类药物是治疗这类感染的重要抗菌药物，但近年来，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant

Klebsiellapneumoniae，CRKP）分离率逐渐上升，已占临床碳青霉烯耐药肠杆菌感染的70%~90%［3］。CRKP对大部分β内酰胺类抗菌药物耐药，但部分CRKP同时也对其他多种非β内酰胺类抗菌药物耐药，如喹诺酮类和氨基糖苷类［4］。这种对多类抗菌药物耐药，仅对一两类抗菌药物敏感的肺炎克雷伯菌被称为广泛耐药肺炎克雷伯菌（extensivelydrug-resistant

Klebsiellapneumoniae，XDRKP）［5,

6］。XDRKP耐药谱多变，极大地限制了抗菌药物选择。细菌耐药表型的产生有多种原因，包括抗菌药物水解酶或抗菌药物耐药相关蛋白表达、抗菌药物作用靶位改变、细胞膜通透性降低、细菌外排泵激活等［7］。抗菌药物水解酶及抗菌药物耐药相关蛋白的表达是导致细菌耐药最主要且最常见的原因［7］。本研究收集山西白求恩医院2018年1月至2020年12月分离自临床样本的116株广泛耐药肺炎克雷伯菌，通过耐药表型筛选、药敏结果分析、PCR扩增相关耐药基因，研究本地区XDRKP耐药特点和耐药基因的排列组合规律，以期为耐药基因流行趋势及相关耐药机制研究提供参考。材料与方法一、材料1.菌株来源：收集山西白求恩医院2018年1月至2020年12月分离的3201株肺炎克雷伯菌，结合临床资料综合判断各菌株是否为感染性疾病病原菌。判断标准为：有感染性症状（如发热、寒战、肌肉酸痛等）、存在明确的感染病灶或影像学改变、炎症标志物较平常升高2倍以上；按照美国临床和实验室标准化委员会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）2020版［8］和欧洲药敏试验委员会［9］判读标准对各菌株已有药敏结果进行重新判读，筛选广泛耐药肺炎克雷伯菌116株纳入研究。同一患者不同部位分离的XDRKP同时保留；同一患者同一部位多次分离的XDRKP，仅保留最后1株。分离自痰标本的菌株须保证标本合格（显微镜检：上皮细胞<10>25/每低倍视野）。所有研究对象均签署科研伦理知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会批准（YXLL-2019-76）。

2.仪器与试剂：哥伦比亚血琼脂购自郑州AUTOBIO股份有限公司；M-H琼脂购自天津市金章科技发展有限公司；ASTGN16药敏卡购自法国Biomerieux有限公司；K-B法药敏纸片购自英国Oxoid公司、替加环素微量肉汤稀释法药敏试剂购自温州康泰生物有限公司；各耐药基因PCR引物、2XSanTaqPCRMix预混液、DNA分子量标准（100~2000bp）、50XTAEBUFFER均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；其他为常用试剂。微生物药敏分析仪（VITEK-compact2）、浓度比浊仪购自法国Biomerieux公司；基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS）微生物快速鉴定系统购自美国BrukerDaltonics；PCR扩增仪购自德国艾本德有限公司；水平电泳装置购自美国Majorscience公司；凝胶成像系统购自珠海赛乐奇生物技术有限公司。二、方法1.菌株鉴定和及药敏试验：入选菌株复苏后接种于哥伦比亚血琼脂，37℃过夜培养，挑取对数生长期菌落进行细菌鉴定及药敏试验。细菌鉴定使用MALDI-TOFMS和VITEK-compact2完成。药敏试验使用VITEK-compact2并ASTGN16药敏卡完成，药敏结果K-B法或微量肉汤稀释法复核。结果判读参考CLSI标准，替加环素判读参考欧洲药敏试验委员会标准。质控菌株ATCC25922、ATCC1705及ATCC1706由山西省临检中心提供。

2.碳青霉烯酶表型筛选试验：根据CLSIM100-S28［8］文件推荐方法，采用mCIM联合eCIM检测XDRKP碳青霉烯酶表型，并与碳青霉烯酶基因扩增结果进行比对。

3.耐药基因检测：加热煮沸法提取细菌DNA作为模板，PCR扩增各耐药基因：碳青霉烯酶基因：blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA；氨基糖苷耐药基因：16SrRNA甲基化酶基因：rmtA、rmtC、rmtD、rmtG、rmtH、armA、npmA、rmtB、rmtE和rmtF，氨基聚糖苷修饰酶变体：aac（6′）-Ib-cr；喹诺酮耐药基因：DNA解旋酶保护蛋白qnr家族：qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS，外排泵蛋白：oqxAB、qepA，氨基聚糖苷修饰酶变体：aac（6′）-Ib-cr；替加环素耐药Tet蛋白基因：外排泵蛋白：tet（A）和tet（L），核糖体保护蛋白：tet（M），替加环素修饰酶：tet（X）。各耐药基因具体引物序列及扩增条件见参考文献［10,

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17］。对扩增后样本行琼脂糖凝胶电泳（1.0%琼脂糖、100V、80A、30min）检测，根据条带位置初步判断有无阳性扩增产物及产物大小。将疑似阳性扩增产物送至北京赛默飞公司进行基因测序，测序结果与BLAST程序内序列进行比对，对阳性扩增产物进行最终确认。

4.耐药表型与耐药基因型比对：将各菌株的耐药表型与基因型一一进行比对，分析各菌株耐药表型产生的可能原因。结果一、XDRKP基本临床信息2018—2020年共分离XDRKP116株，总分离率3.62%（116/3201），其中113株分离自住院患者标本，占97.41%（113/116），3株分离自急诊科。耐药菌株主要分离于神经外科、重症监护室（ICU）和普通外科，分离率分别为：18.10%（21/116）、16.38%（19/116）、12.93%（15/116）。痰液及肺泡灌洗液、尿液、血液标本的XDRKP分离率分别为41.38%（48/116）、24.14%（28/116）、10.34%（12/116），其他标本类型XDRKP分离率均低于10%。二、XDRKP药敏试验结果116株XDRKP中，头孢菌素和喹诺酮类抗菌药物耐药率均为100%（116/116）。碳青霉烯类抗菌药物耐药率99.14%（115/116）、氨基糖苷类抗菌药物中庆大霉素耐药率96.55%（112/116）、妥布霉素耐药率94.83%（110/116），阿米卡星耐药率88.79%（103/116）。磺胺类抗菌药物复方磺胺甲唑耐药率37.93%（44/116）。替加环素耐药率2.59%（3/116）。具体结果见表1。三、碳青霉烯酶表型筛选试验116株XDRKP中115株为CRKP。mCIM联合eCIM检测碳青霉烯酶表型，结果显示丝氨酸酶阳性108株，检出率93.91%；金属酶阳性7株，阳性率为6.09%。与PCR结果比对：5株XDRKP同时携带blaKPC和blaNDM，此5株菌碳青霉烯酶表型为丝氨酸酶阳性金属酶阴性。另有3株XDRKP碳青霉烯酶表型为丝氨酸酶阳性金属酶阴性，但碳青霉烯酶耐药基因未检出。碳青霉烯酶表型筛选试验与碳青霉烯酶耐药基因扩增结果一致率为93.04%（107/115）。四、耐药基因检测碳青霉烯耐药基因blaKPC阳性率86.21%（100/116），blaNDM阳性率6.03%（7/116）。5株XDRKP同时携带blaKPC和blaNDM，4株XDRKP未检出任何碳青霉烯酶基因。所有菌株未检出blaVIM、blaIMP、blaOXA；氨基糖苷耐药基因rmtB阳性率78.45%（91/116），armA阳性率0.86%（1/116）、aac（6′）-Ib-cr阳性率2.59%（3/116）。2株XDRKP同时携带armA和aac（6′）-Ib-cr，4株XDRKP同时携带rmtB和aac（6′）-Ib-cr，15株XDRKP未检出任何氨基糖苷类耐药基因。所有菌株未检出rmtA、rmtC、rmtD、rmtG、rmtH、npmA、rmtE、rmtF；喹诺酮耐药基因oqxAB阳性率52.59%（61/116），qnrS阳性率5.17%（6/116），未检出单独携带qnrB及aac（6′）-Ib-cr的XDRKP。16株XDRKP携带2~4种喹诺酮类耐药基因，33株XDRKP未检出喹诺酮耐药基因。所有菌株未检出qnrA、qnrC、qnrS和qepA；替加环素耐药Tet蛋白基因tet（A）阳性率21.55%（25/116），所有菌株未检出tet（L）、tet（M）和tet（X）。

与其他3类抗菌药物耐药基因组合相比，喹诺酮耐药基因组合更加复杂且存在多种组合方式。qnrS+oxqAB（6/116）与qnrB+oxqAB+aac（6′）-Ib-cr（4/116）是最常见的多基因组合方式。所有XDRKP未检出单独携带qnrB或aac（6′）-Ib-cr，提示这两种基因可能与其他耐药基因共同存在介导喹诺酮耐药。基因扩增结果见表2，部分基因扩增产物电泳图见图1,

2,

3。

图1

琼脂糖凝胶电泳分离各耐药基因扩增产物

图2

琼脂糖凝胶电泳分离喹诺酮类各耐药基因

图3

琼脂糖凝胶电泳分离替加环素耐药基因tet（A）扩增产物五、耐药表型与耐药基因型比对对116株XDRKP药敏结果与耐药基因携带情况进行匹配，尝试性分析各XDRKP耐药表型的产生与相应耐药基因携带之间的关系。结果发现，耐药表型与耐药基因型间匹配度为43.97%（51/116），即51株XDRKP抗菌药物耐药表型可以用携带有相应耐药基因来进行初步解释。同时发现以下两种现象：（1）有45株XDRKP表现为某一类抗菌药物耐药但未检出相应耐药基因。（2）有21株XDRKP检出某类抗菌药物耐药基因但未表现为相应门类抗菌药物耐药。具体情况见表3。讨论116株XDRKP中113株来自住院患者，表明除考虑送检率外，医院环境与XDRKP检出具有相关性。神经外科和重症监护室是XDRKP分离的主要科室，也说明XDRKP的产生与医院中普遍的抗菌药物使用有关。115株XDRKP表现为碳青霉烯类联合其他多种抗菌药物耐药，这与Avgoulea等［4］的观点一致，即CRKP中存在同时对其他多种抗菌药物耐药的菌株，碳青霉烯耐药也是引发其他抗菌药物耐药的潜在危险因素。从各类抗菌药物耐药情况来看，XDRKP对多种抗菌药物的耐药率均高于90%，耐药形势严峻。而复方磺胺甲唑与替加环素敏感性相对较高，可以作为备选药物治疗XDRKP。CLSI推荐使用mCIM联合eCIM检测CRKP碳青霉烯酶表型。与PCR结果相比，mCIM联合eCIM一致性高（93.04%）。当菌株同时表达丝氨酸酶和金属酶时，丝氨酸酶阳性会掩盖eCIM对金属酶的检测，这也是该试验出现偏差的主要原因。部分XDRKP碳青霉烯酶表型筛选试验阳性但耐药基因扩增结果阴性，表明此类分离菌株碳青霉烯耐药表型与其他耐药机制相关，如ampC酶高表达、细菌膜通透性降低、外排泵激活等。氨基糖苷类抗菌药物耐药，主要与16SrRNA甲基化酶及氨基聚糖苷修饰酶的产生有关［18］。PCR扩增得到rmtB、armA及aac（6′）-Ib-cr3种阳性产物，其中rmtB阳性率为78.45%，表明rmtB是本地区主要流行的16SrRNA甲基化酶基因，少量XDRKP携带有armA甲基化酶基因。有3株XDRKP仅携带有aac（6′）-Ib-cr氨基糖苷修饰酶，通过对药物的修饰作用介导细菌耐药。值得注意的是，有6株XDRKP耐药表型阳性而未检测出耐药基因，提示存在其他耐药机制导致耐药表型的产生，如抗菌药物作用靶位改变、外排泵的激活等。同时还有4株XDRKP携带有氨基糖苷类耐药基因但对这类抗菌药物未表现出耐药，可能是由于耐药基因未表达或低表达所致。喹诺酮类抗菌药物通过与解旋酶及拓扑异构酶Ⅳ结合，阻断细菌DNA复制和转录过程而发挥作用［19］。本研究中，65.52%的XDRKP携带有oqxAB外排泵基因（单独携带或与其他耐药基因共存），表明oqxAB为本地区最常见喹诺酮类抗菌药物耐药基因。另外还检出少量qnrB、qnrS及aac（6′）-Ib-cr耐药基因，提示XDRKP可以通过多种耐药基因介导耐药表型的产生。有趣的是，有33株XDRKP未检出任何喹诺酮耐药基因而耐药表型阳性，提示存在其他耐药机制，如作用靶位基因突变、抗菌药物摄入减少等。在耐药基因组合模式方面，喹诺酮耐药基因存在明显差异性：oqxAB、qnrS可以单独存在并介导XDRKP对于喹诺酮类抗菌药物的耐药，未发现单独携带qnrB、aac（6′）-Ib-cr的XDRKP，两种耐药基因通常与oqxAB同时存在。这一发现也与Robicsek等［20］的报道相似，即aac（6′）-Ib-cr通常仅能降低环丙沙星的活性，而对莫西沙星与左氧氟沙星无效，细菌