实验一：质粒提取实验

实验一质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳分子生物学实验实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第1页!一实验目的掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。

二实验原理实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第2页!

培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒DNA

共价闭环DNA（cccDNA）线状DNA（lcDNA）开环DNA（ocDNA）

三个基本步骤质粒存的形态实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第3页!碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第4页!Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。本实验采用的EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位点分别为

GAATTC和AAGCTTCTTAAGTTCGAA

实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第5页!DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第6页!4℃，10000rpm，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管加700μL的氯仿：异戊醇［V:V＝24:1］（混匀），冰上静置5min4℃，10000rpm，离心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管

加1.0mL无水乙醇（充分混匀），-20℃放置20min4℃，10000rpm，离心10min

，弃上清加入500μL70%乙醇，将沉淀悬起

4℃，5000r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第7页!实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第8页!四实验结果实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第9页!质粒检测：

电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。

吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第10页!DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第11页!接含质粒的单菌落于2mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取2.0mL菌液入2.0ml的dorf管中5000rpm、离心5min，弃上清，收集菌体200uL溶液I+5uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5min

加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min裂解菌体加入300uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性三实验步骤

实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第12页!取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作：实验组对照组(不做）Buffer40EcolⅠ30HindⅢ30质粒XXddH2O10-X20-X总体积2020充分混匀后于37℃保温2-3h。（注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2μg/μL）实验一：质粒提取实验共15页，您现在浏览的是第13页!三实验步骤

制胶

——1.0％琼脂糖凝胶(50ml)

凝胶板的制备

——小心加入2－3μlEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用）

点样——样品20μl，与4μl溴酚兰混匀(DNAmaker3μl加入10μl水与4μl溴酚兰混匀)电泳——稳压80v，DNA向阳极移动,大约50-60min