实验四PCR及电泳技术

实验4PCR及电泳技术实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第1页!1.PCR的基本原理PCR基本原理类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR的基本步聚1、变性(Denaturation)

：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。2、退火(Annealing)

：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。3、延伸(Extension

)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第2页!PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加热94℃实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第3页!PCRCycle-Step3-

At72℃

TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionasplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第4页!TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第5页!PCR仪实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第6页!1、PCR反应成分1）模板

单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到条cDNA。一般100ngDNA模板/100l。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。PCR反应体系模板引物TaqDNA聚合酶4种dNTP混合物Mg2+10×缓冲液实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第7页!3）TaqDNA聚合酶一般0.5-2.5U/50l；酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第8页!5）10×PCR缓冲液(Mg2+)：500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.4)，150mMMgCl2，1mg/ml明胶。实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第9页!PCR扩增程序:

94℃,300S

94℃,60S

55℃,60S

72℃,60S

72℃,7min30循环实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第10页!电泳分离的原理电泳(electrophoresis)溶液中带电粒子(离子)在电场中移动的现象。1、电荷效应利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。

2、分子筛效应

不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。3、待分离生物大分子的性质一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。4、电场强度

电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第11页!琼脂糖凝胶电泳对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关。实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第12页!琼脂糖浓度（％）DNA有效分离范围（Kb）0.530～10.712～0.81.010～0.51.27～0.41.53～0.2不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第13页!引物酶②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第14页!Endofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2-4min，2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5’3’3’实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第15页!PCR仪实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第16页!PCR仪实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第17页!2）引物

（1）浓度0.1-0.5M浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。引物是PCR特异性反应的关键；PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第18页!4）dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4）

dNTP浓度取决于扩增片段的长度;四种dNTP浓度应相等;

PCR常用的浓度为50-200μM，不能低于10-15μM。浓度过高会抑制Taq酶的活性，易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第19页!PCR反应体系：

10×PCRbuffer2.5μldNTPmix各0.5μl引物10.5μl引物20.5μlDNA模板2μlTaq酶0.5μl加双蒸水至总体积为25μl实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第20页!2.电泳技术电泳槽制胶板梳子电源电泳仪提供稳定的电压或电流电极缓冲液和凝胶的容器形成点样孔制备垂直或水平凝胶实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第21页!电泳技术的种类按支持介质的不同可分为：⑴纸电泳(Paperelectrophorisis)⑵醋酸纤维薄膜电泳(CelluloseAcetateelectrophoresis)⑶琼脂凝胶电泳(AgarGelelectrophoresis)⑷聚丙烯酰胺凝胶电泳(PolyacrylamideGelelectrophoresis)(PAGE)⑸SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)。实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第22页!1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸；2、倒胶时温度要低于60℃且速度要慢；3、拔梳子和点样要小心，以免破坏胶孔；4、电泳仪打开前应检查电压、电流旋纽是否处于零位置，工作电压一般为60-80V，400mA，电泳完毕应将电压、电流旋钮恢复到零位置；5、防止EB污染和紫外灯伤眼。注意事项：实验四PCR及电泳技术共24页，您现在浏览的是第23页!MP