电泳技术的临床应用2011-02课件

现代电泳技术的临床应用Sebia何鹏–

临床应用使用范围和检测原理电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小,形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离,鉴定或提纯的技术.在生化检测中,主要用于分离各类蛋白分子.蛋白电泳检测的不同步骤制备胶片,加样,温度启动电源,开始电泳,染色,脱色,结果检测常用的电泳技术滤纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶适用于蛋白质和核酸的电泳支持介质,成本低,结果易保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳:最常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量,一般用于科研.毛细管电泳:经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物电泳技术的医学应用蛋白质电泳分析是实验室必备的检测手段,可全面精确,描绘出患者蛋白质的全貌.对疾病的早期诊断,疗效观察及预后判断具有非常重要的临床价值.根据使用的染料或者是底物的不同，我们可以检测到不同类型的蛋白:

血清蛋白 脂蛋白(运送脂类)

各种酶类 血红蛋白正确解释电泳结果,为临床对疾病的判断提供可靠参考gba2白蛋白a1:a1酸性糖蛋白,

a1抗胰蛋白酶:结合珠蛋白,

a2

巨球蛋白,

a脂蛋白,

铜蓝蛋白:转铁蛋白,血液结合素,C3补体,b脂蛋白:免疫球蛋白血清蛋白电泳蛋白染色血清蛋白电泳后会呈现出5或者6条带.染色后,每个条带呈现出的不同程度的染色对应着各自的蛋白浓度.如何检测染色程度:

需要使用光密度仪.

出现单克隆免疫球蛋白的电泳图谱什么情况下必须进行电泳检测?总蛋白异常升高或异常下降A/G比例变化血液沉降速度发生异常变化出现恶性疾病征兆在免疫球蛋白定量检测中发现某一种免疫球蛋白出现大量异常增加

双白蛋白,或者一条宽峰,或者在白蛋白条带出现附属条带可能是由以下原因造成:遗传性双白蛋暂时性的双白蛋白血症可能是由于药物刺激导致的急性胰腺炎导致的双白蛋白血症:大量的胰酶的出现可以导致白蛋白降解白蛋白区带双白蛋白血症

双白蛋白血症在下列情况下白蛋白会出现下降:

-

肾病综合症,蛋白流失,胃肠病:检查尿蛋白

-淋巴细胞增生综合征

-营养不良

-肝脏功能不全

-慢性炎症

-严重烧伤

-血液稀释Alpha1globulins(α1球蛋白区带)将会在下列情况下出现下降:

-蛋白流失

-肝功能不全

-先天性抗胰蛋白酶缺乏症出现两个条带:

-抗胰蛋白酶的不同基因型出现增加:

-炎症症状急性炎症电泳图谱溶血的标本下列情况下Alpha2区域会出现增加现象:

-炎症症状 -肾病综合征 -出现游离轻链

Betaglobulins(β球蛋白区带)在下列情况下会出现下降:

-肝功能不全

-C3长期缺乏或者C3代谢过快

(alsoinagingsample,C3denaturation,splittedinupto 4fractions:1betweena2andb, 1onb1,

1

onb2 and1ong)

Beta球蛋白在下列情况下会出现增加现象:

-胆管阻塞

-肾病综合征

-肝硬化

-缺铁性贫血

-血球蛋白异常

-高脂蛋白血症

-大量溶血

酒精性肝硬化中的β-γ

桥免疫球蛋白是机体的正常生理成分，机体保持一定水平。当这种正常水平打破时，则属于疾病，增多或减少则意味着免疫增殖病或免疫缺陷病。

IgG-κ、lgG-λ

IgA-κ、IgA-λ

IgM-κ、IgM-λ

IgD-κ、IgD-λ

IgE-κ、IgE-λ

Gammaglobulins(免疫球蛋白区带)Specificwhitebloodcells(lymphocytesB)turnintoplasmocytes3Plasmocytesproduceantibodyproteins,alsocalledImmunoglobulins.4PlasmocyteImmunoglobulinBoneMarrowproduces3keybloodcells:Redbloodcells:deliverdioxygenethroughoutthebodyviacirculatorysystemsWhitebloodcells:participateinimmunesystemPlatelets:helpbloodcoagulateimmunoglobulinsareusedbytheimmunesystemtoidentifyandneutralizeforeignelementssuchasbacteriaandviruses.52NormalImmunoglobulinsNormalPlasmocytesNormalProteinogramMalignantPlasmocyteorMyelomacellProteinogramshowingMonoclonalpeakNormalImmunoglobulinBonemarrowistheflexibletissuefoundinthehollowinteriorofbones(backbone,skull,pelvis,ribcage)ClonalimmunoglobulinorMproteinofIgAκtype1NormalImmunoglobulinsecretionMonoclonalGammopathyMultipleMyelomaandMonoclonalIg单克隆增殖，是一个细胞在某一分裂阶段发生突变，然后急剧分化、增殖,并大量表达某种单一的Ig,这种恶性增殖具有如下特点:

1，均一型Ig

2，Ig含量大(也可高达10余克)

3，正常Ig成分减少(正常值以下)

4，轻链型比例失调(κ/λ>或<2:1)

5，出现相关临床表现

M蛋白疾病的“M”含义是Myeloma,Macroglobulinemia,Malignantlymphoma和MonoclonalGammapathies均以“M”开头.M蛋白在电泳上表现为高而狭窄的尖峰.MonoclonalIgPolyclonalIgsPolyclonalIgsMonoclonalIgDiscoveryofamonoclonalimmunoglobulinbyserumproteinelectrophoresis多克隆免疫球蛋白的增加:

-炎症

-肝硬化

-亚急性和慢性感染-恶性肿瘤:早期恶性肿瘤有多克隆增殖现象尤其淋巴瘤。

晚期恶性肿由于恶液质出现，Ig反而减少

Ig异常合成-多克隆免疫球蛋白区带血清蛋白021216－狼疮病血清蛋白030127－酒精肝B-r桥与下列各类疾病相关的寡克隆免疫球蛋白(多个条带):-自身免疫病-先天性免疫缺陷症-病毒感染

(CHepatitis,HIVdisease,CMV(巨细胞病毒),EBV,…)-免疫抑制治疗Ig异常合成-寡克隆免疫球蛋白区带Oligoclonalpattern(寡克隆免疫球蛋白)血清蛋白电泳是

M蛋白(MonoclonalProtein)多克隆(polyclonalProtein)

寡克隆(OligoclonalProtein)

的首选检测项目表1646例M蛋白类型分类型别例数%IgG型骨髓瘤20531.73IgA型骨髓瘤9314.40IgM型骨髓瘤568.67IgD型骨髓瘤121.86重链病50.77轻链病21433.13半分子病10.157SIgM20.31BMG497.59双M蛋白病81.24上海新华医院,2005年多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma,MM)MM是造血系统的恶性肿瘤,占整个恶性肿瘤的1%常见于中、老年人(50-70岁居多,40岁以下少见).以往对此病认识不足，漏诊、误诊可达到70%以上.随着寿命的延长对此病认识的提高病例数显著增加.MM临床表现特点骨痛,骨骼肿块与病理性骨折,骨质疏松和溶骨现象贫血免疫功能低下,反复感染肾脏损害高钙,高粘(血浆相对黏度6以上)高尿酸血症表现MM的临床表现多样化,常常因此就诊于骨科、肾脏内科等,延误诊治多发性骨髓瘤的免疫学特征血中出现M蛋白,正常Ig水平明显减低尿中出现M蛋白和轻链蛋白(BJP)骨髓中浆细胞明显增加无免疫活性Ig导致免疫功能低下多发性骨髓瘤病人溶骨报告(骨盆)多发性骨髓瘤病人溶骨报告多发性骨髓瘤病人溶骨报告(颅骨)临床实例意义未明的单克隆免疫球蛋白疾病:BenignMC在法国,在对献血者进行检测时,会检测到0,15%比例的单克隆免疫球蛋白携带者.

在老龄人群中检测到的携带者比例更高(80岁以上人群).在对60到99岁人群的检测显示,出现Ig的比例从2,6%上升至19,2%.(平均值=5%)MGUSMGUS携带者特征:

-未出现临床和影像学特征 -未出现不良反应,未检测到血钙升高,也未出现肾功能衰竭

-未见骨髓瘤的临床特征 -单克隆免疫球蛋白<20g/l-其他免疫球蛋白都是正常的,同时在患者尿液中未检测到本周氏蛋白 -单克隆免疫球蛋白的浓度随着时间的推移未发生增加现象 -其他的免疫球蛋白的浓度也未随时间推移而出现下降

在20%的情况中,MGUS将会转化成恶性疾病(6-10years)Kylereport显示,通过对1384名含有MGUS的患者的20–35(average:22years)年的跟踪监测发现,24%的患者最终演变成恶性的淋巴细胞增生症(multiplemyeloma,macroglobulinemia,amyloidosis,…).从检测到单克隆免疫球蛋白,直到作出多发性骨髓瘤的诊断报告,这段时间是不定的,从2-29年(平均是10年左右).大量报告显示,在下列情况中,发展成为恶性淋巴细胞增生疾病的可能性很小: -单克隆免疫球蛋白: IgG<15g/L IgA<10g/L IgM<5g/L -尿蛋白中未出现本周氏蛋白

-其他类型的免疫球蛋白未出现下降寡克隆免疫球蛋白

由于药物原因导致的免疫缺陷: -在器官或者骨移植之后 -自身免疫病:

(类风湿关节炎,干燥综合征(66%),系统性红斑狼疮….)

由于细菌或病毒感染导致的免疫缺陷:

-病毒:HIV(63%),EBV,CMV,viralhepatitis,… -细菌,寄生虫感染:

(脑膜炎,脑炎,…)在一些肿瘤中:(慢性淋巴细胞性白血病CLL:29%)

在5%正常群体中(MGUS)

在多发性硬化患者中:(CSF90%)检测结果阐述电泳的结果是以%的形式给出的,但是对于临床诊断,结果必须要以浓度的形式给出g/L蛋白浓度出现异常时,必须要进行其它的补充检测患者的随访

首次被发现的患者:

如果检测到的异常M蛋白峰值不多,同时其他免疫球蛋白的含量未发生变化,也没有临床症状,怀疑可能是MGUS,

第一年每4至6个月对患者经性随访,从第二年起,每年进行一次随访.

已确诊的患者:

如果电泳结果和先前检测相同,利用异常峰值进行量化以便于检测异常M蛋白的浓度是否发生变化.

这种情况下的随访检测,一定要选择相同的技术方法.

如果随访结果显示出现异常区带,一定要进行免疫固定电泳确认这些异常蛋白的成分.异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征血清蛋白质的图谱类型

总蛋白Albα1α2βγ1.低蛋白血症↓↓↓↓N↑N↓N↑2.肾病型↓↓↓↓↑↑↑不定3.肝硬化型↓N↑↓↓N↓N↓β-γ↑桥4.急性炎症或急性时相反应症N↓N↑↑N5.慢性炎症型

↓↑↑↑6.弥漫性肝损害型↓N↓↓↑↓↑7.弥漫宽γ球蛋白血症型↑↓N↑↑8.M蛋白血症型

在α-γ区带中出现M蛋白峰-M区带峰9.高α2（β）球蛋白血症↓↑↑↑10.妊娠型（高α型）↓N↓↑↑N11.蛋白质缺陷型个别区带出现特征性缺乏免疫固定电泳

结果分析指南

在血清蛋白电泳时,检测到异常条带的出现,或者是某一个条带的蛋白出现异常增加

电泳结果显示为低免疫球蛋白血症,或者免疫球蛋白定量结果显示可能是游离轻链病

尿蛋白检测结果异常(检测到单克隆游离轻链),查看患者是否做过血清蛋白电泳,如果有必要需要进行血清的免疫固定电泳

什么情况下必须要进行免疫固定电泳检测?加样:同一样品重复加样6次2)电泳:大约9分钟

3)电泳结束后,加不同类型抗血清:ELP:固定液G:antiserumantiIgGheavychainA:antiserumantiIgAheavychainM:antiserumantiIgMheavychainK:antiserumantikappalightchainL:antiserumantilambdalightchainincubationtime

4)终止反应,吸出多余的抗血清,烘干胶片5)清洗胶片,染色传统的单克隆免疫球蛋白检测方法-免疫固定电泳(IF)正常血清标本IgGl单克隆免疫球蛋白(近负极端)IgGl单克隆免疫球蛋白(近正极端)出现在a2区域的IgAl

出现两个异常蛋白带:利用Beta巯基乙醇处理后,结果为IgA

l单克隆免疫球蛋白BME/FluidiltreatmentBME/Fluidiltreatment检测结果显示为3个IgAl:利用Beta巯基乙醇处理后,结果为IgAl单克隆免疫球蛋白IgM

k单克隆免疫球蛋白寡克隆免疫球蛋白IgG(k+l)双克隆免疫球蛋白IgG

k和

IgA

k免疫固定结果显示为单独的

l

成分:需要使用抗

l游离轻链和/或抗

IgD和IgE的抗血清确认

该结果为

l型游离轻链BJassaycharacterizedonHYDRAGELBENCEJONES免疫固定结果显示为2个独立的

l

成分:需要使用抗

l游离轻链和/或抗

IgD和IgE的抗血清确认该结果为单克隆IgDl,并伴随有

l游离轻链BJassaycharacterizedonHYDRAGELBENCEJONES免疫固定结果确认:IgEl单克隆免疫球蛋白免疫固定结果显示为单独的

l成分:需要使用抗

l游离轻链和/或抗

IgD和IgE的抗血清确认特殊病例在免疫球蛋白区域检测到异常条带,但是免疫固定检测结果却为阴性在使用抗-纤维蛋白原的抗血清结果显示为阳性尿蛋白的电泳研究肾单位的生理结构和各类生理蛋白1百万个肾单位每天过滤180升的血浆，同时产生大约1.5升的尿液。肾小管的废弃物排放最后形成的尿液含有1/3的白蛋白和2/3球蛋白肾小管重新吸收白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白肾小球过滤白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白尿蛋白:定义在生理学角度讲，正常的人的尿蛋白量在50至120mg/24

h(大约在100mg/L)

主要的蛋白是白蛋白(少于30mg/L)病理上的肾功能疾病：当尿蛋白量大于150mg/24

h

而此时，尿蛋白的成分也是不定的。导致尿蛋白含量增加的原因生理上的因素:间歇性的(站立过久,正餐以后,运动过后,压力之下)肾前性:高血压,发烧,心脏或肝脏功能衰退,…

蛋白浓度升高(尿蛋白含量过高)肾性:肾小球或肾小管受到损伤(或者两个同时受到损伤)肾后性:泌尿系统出现损伤肾前性的尿蛋白尿蛋白含量增加某一种蛋白含量出现异常升高，超出了肾小管对于这一蛋白的再吸收能力。原因自由轻链,主要是在单克隆免疫球蛋白疾病中beta2微球蛋白,淋巴组织增生综合征溶菌酶,在一些急性髓细胞白血病血红蛋白,在结合珠蛋白饱和后出现的溶血现象中血清粘蛋白,又称为Alpha酸性糖蛋白，在支气管癌患者中肌红蛋白,在横纹肌出现溶解患者中上述各类情况均可导致出现肾病

(尤其是含有自由轻链的本周氏尿蛋白)>67kDa<67kDa尿蛋白含量增加肾性尿蛋白分析在HYDRAGEL5PROTEINURIE

凝胶上主要的尿蛋白的电泳条带区域分析起源于肾小管的各类蛋白(分子量<67kDa)起源于肾小球的各类蛋白(分子量>67kDa)白蛋白(分子量:67kDa)a1-微球蛋白

(MW:33kDa)游离轻链

(MW25kDa)转铁蛋白

(MW:80kDa)Cystatin(MW:11kDda)b2-微球蛋白

(MW:12kDa)溶菌酶

(MW:15kDa)视黄醇结合蛋白(MW:21kDa)游离轻链的二聚体(MW50kDa)IgG(MW:160kDa)IgA(MW:165kDa)结合珠蛋白加样位置a2-巨球蛋白

(MW:900kDa)注:(CystatinC),血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C肾小球过滤小分子蛋白,分子量小于67

kDa,被过滤到尿液中.其他决定各种蛋白被过滤的因素:分析形状,带电量,血浆浓度.还有一些血液动力学因素可影响蛋白的过滤.肾小球损伤经常出现于成人及儿童患者中,表现为尿蛋白含量出现增加现象

(大于1

g/24-h)原因糖尿病感染性损伤(细菌感染,乙肝患者,水痘,梅毒,单核白血球增多症

,…)其他系统性疾病(自动免疫系统,癌症,…)中毒现象(重金属,药物中毒,…)此时,我们可以在尿蛋白中发现白蛋白和其他大分子量蛋白(大于67

kDa)。临床示例肾小管的再次吸收功能在肾小球中被过滤掉的小分子蛋白，分子量小于67

kDa,将会在肾小管内被重新吸收(内吞作用).

99%的在肾小球内被过滤的蛋白,都将会被重新吸收利用.

例如,

18

g/24-h白蛋白将会被过滤掉;

30

mg/L

白蛋白在人的尿液中被发现.

肾小管损伤肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力

(小于67

kDa的蛋白)通常是暂时性的,并且少于0.5

g/24-hours原因遗传原因(Fanconi’ssyndrome)免疫球蛋白单克隆扩增(骨髓瘤)药物作用(抗癌药物)中毒现象(重金属)白蛋白(<30%)及其它小分子蛋白(小于67

kDa)都将会在尿液中被找到.>67kDa<67kDa肾小管损伤<67kDa>67kDa>67kDa<67kDa混合性损伤临床示例肾小球、肾小管均受损伤。临床示例5PROTEINURIE14.3KDa26.6KDa150KDa66KDa轻链病多表现为肾脏损害，极易误诊为慢性肾炎。我们认为轻链有3种形式出现在血清或尿中；一是正常的轻链过剩（Kappa和Lambda同时出现），多出现于慢性肝病，红斑狼疮等多克隆增殖中。二是伴随轻链。三是单一轻链，血和尿中只出现单一增殖的大量轻链。BenceJonesprotein浆细胞增生症影响血液中出现游离轻链尿液中出现起因结果肾小管损伤淀粉样病变轻链沉淀病骨髓瘤巨球蛋白血症CLL慢性白血病MGUS.....HenryBenceJones于1844年在一个骨髓瘤患者尿中发现的一种具有特殊凝溶性质的蛋白该种蛋白40－60℃发生沉淀，加热煮沸时溶解，冷却后又沉淀。后被证明是单克隆的免疫球蛋白轻链二聚体。大多数骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白轻链单体（κ链）2－4小时清除，肾小球滤过率为40％；轻链二聚体（λ链）3－6小时清除，肾小球滤过率为20％；多聚体的清除速率降低；肾功能衰竭的MM患者完全清除需2-3天。正常免疫球蛋白的合成

18分钟10分钟浆细胞一条重链一条轻链组合一分子免疫球蛋白过剩轻链肾小球滤过10%在肾小管分解代谢80%重吸收10%随尿排出BJP检测方法热沉淀反应法：根据其凝溶特性设计的定性分析方法，灵敏度低。免疫固定电泳法：结合免疫沉淀技术的电泳法，特异性好。免疫化学法：免疫比浊法，可对血清游离轻链进行定量，灵敏度高。尿免疫固定电泳浆细胞病的诊断和治疗监测某些情况下，特别是对轻链型的M蛋白，比血清免疫固定电泳更加敏感。因为游离轻链的分子量比较小（25－50KDa）更容易通过肾脏清除进入尿液中，从而在尿中被检测到。下列参数会影响本周氏蛋白的毒性:等电点(pI):

-WhenthepIis>6,theBenceJoneswillinteractstronglywiththeTamm-Horsfallprotein.

-IfthepIislow,therewillbelittleinteractionwithTHP.轻链形成的聚合体:-(polymerscanreachaMWof900kD).

轻链的初级结构:

-Theprimarystructureofthefreelightchainsisalsoinvolvedinthetoxicity.Thisisduetothevariableregionofthelightchain.病例一病人甲，女，29岁，蛋白尿肾内科就诊。尿蛋白电泳：100％球性蛋白；尿总轻链定量：κ5.95mg/dl(0－5.10)

λ70.10mg/dl（0-5.0）；血清蛋白电泳和免疫固定电泳未见单克隆蛋白；尿本周蛋白电泳可见轻链λ型M蛋白病例一血清免疫固定电泳尿本周蛋白电泳病例二病人丙，男，53岁，多发性骨髓瘤治疗中血清免疫固定电泳：M蛋白阴性尿总轻链定量：κ6.29mg/dl(0-5.10)

λ<5.00mg/dl(0-5.00)尿本周蛋白电泳：M蛋白为轻链κ型病例二血清免疫固定电泳尿本周蛋白电泳下列参数会影响本周氏蛋白的毒性:等电点(pI):

-WhenthepIis>6,theBenceJoneswillinteractstronglywiththeTamm-Horsfallprotein.

-IfthepIislow,therewillbelittleinteractionwithTHP.轻链形成的聚合体:-(polymerscanreachaMWof900kD).

轻链的初级结构:

-Theprimarystructureofthefreelightchainsisalsoinvolvedinthetoxicity.Thisisduetothevariableregionofthelightchain.下列参数会影响本周氏蛋白的毒性:等电点(pI):

-WhenthepIis>6,theBenceJoneswillinteractstronglywiththeTamm-Horsfallprotein.

-IfthepIislow,therewillbelittleinteractionwithTHP.轻链形成的聚合体:-(polymerscanreachaMWof900kD).

轻链的初级结构:

-Theprimarystructureofthefreelightchainsisalsoinvolvedinthetoxicity.Thisisduetothevariableregionofthelightchain.尿液的检测原则当血液中检测到M蛋白时: -进行24H尿蛋白检测 -电泳+IF/BJ -对异常峰进行鉴定 -对患者进行随访,目的是确认药后疗效和肾脏损伤程度重点:对患者定期随访检测,便于及时掌握患者肾脏损伤程度

总结电泳技术在同工酶分析方面的应用TheAssayandtheClinicalApplicationofIsoenzymes同工酶的定义同工酶是以多种分子形式存在于机体的催化功能相同分子结构不同检测同工酶的目的检测同工酶活力比单测定酶的总活力更具有脏器特异性和高灵敏性等优点,因而提高了临床诊断价值早期诊断某些疾病,阳性率高,特异性强可以估计病情严重性和判断预后目前广泛应用于临床检测中的同工酶乳酸脱氢酶同工酶(Lactatedehydrogenase,LDH)肌酸激酶同工酶(Creatinekinase,CK)碱性磷酸酶同工酶(Alkalinephosphatase,ALP)天冬氨酸氨基转移酶(Aspartatetransaminase,AST)γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyltransferase,GGT)-淀粉酶同工酶(

-Amylase,AMY)同工酶的分析方法由于同工酶的一级结构(氨基酸序列)及高级结构(构象)的不同,因此,一种酶的各个同工酶在化学,物理化学,生物化学等方面的性质也就有所差异,这些差异就提供了分析和鉴定同工酶的理论基础在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最为广泛。因为此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态乳酸脱氢酶同工酶(LDH)乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶每