皮肤科-细胞培养及临床应用课件

皮肤病学相关研究中

所涉及的细胞培养问题中国医学科学院皮肤病研究所李新宇2004年2月12/11/20221细胞培养涉及的基本知识12/11/20222最常见的两种生长型细胞贴壁依赖性细胞(Anchorage-dependentcells)

贴附于不起化学作用的物质(玻璃、或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持。悬浮培养细胞(Suspensionculture)细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。12/11/20223细胞株(Cellstrain):由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系。细胞周期(Cellcycle)细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。

4个时期：S期：DNA合成期M期：有丝分裂期G1期：有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期G2期：DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期

G0期：某种原因导致细胞不再沿周期进行，进入休眠状态12/11/20225细胞一代时间(Cellgenerationtime)

单个细胞两次连续分裂的时间间隔。群体倍增时间(Populationdoublingtime)

在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需要的时间。12/11/20226克隆(Clone)单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。细胞融合(Cellfusion)体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞(Hybrid)。细胞汇合(Confluence)器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层。12/11/20227原代培养(Primaryculture)

从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。传代培养(Passage)(Subculture)

细胞从一个培养器皿转移至另一个培养器皿中培养。再培养(Reculture)单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基中的过程。12/11/20228培养基培养基天然培养基合成培养基基本培养基(通用培养基)(MEM)无血清培养基无蛋白培养基血清基本培养基(通用培养基)完全培养基12/11/202210常用基本培养基RPMI1640应用最广泛DMEM高糖型4500g/L葡萄糖，低糖型1000g/L葡萄糖HamF12无血清培养基常用的基础培养基199……12/11/202212培养基配制时的注意事项

严格按说明书要求添加必要成分NaHCO3谷氨酰胺HEPES------各成分顺序溶解配制培养基用水、器皿灭菌分装、保存

12/11/202214培养基添加成分NaHCO3一般按说明书要求添加封闭式培养用5.6%或7.4%液调节谷氨酰胺易降解，使用前添加使用终浓度0.002mol/LHEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)主要作用为防止培养基pH迅速变动使用终浓度0.01-0.015mol/L12/11/202215完全培养基的添加成分牛血清

小牛血清：取自出生10～30天的小牛。新生牛血清：取自出生24小时之内的新生牛。胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿刺方法获得。

12/11/202216血清的主要作用

提供细胞生长所需的基本营养物质。(激素、生长因子、结合蛋白)提供贴壁和扩展因子(纤连蛋白,层粘连蛋白)。对培养中的细胞提供保护作用。

抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作用终止贴壁细胞消化传代中所用胰蛋白酶的作用血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所受的机械损伤12/11/202217使用血清的缺点

改变细胞在体内的正常状态促进某些细胞生长同时抑制另一类细胞生长。所含物质对细胞生长的影响或毒性作用批间成分的一致性支原体、病毒的潜在污染性12/11/202218血清的使用与贮存

灭活处理:56℃水浴,30分钟(去除补体)贮存条件:分装-20℃长期贮存,避免反复冻融4℃,<1个月融化步骤:-20℃4℃室温使用浓度:5%～20%,常用10%临用前添加于培养基中

12/11/202220无血清培养基用途观察生长因子对细胞的作用,需排除其它生长因子的干扰作用

测定细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力

大规模培养细胞，获得分泌产物

12/11/202221更换无血清培养基的注意事项针对性强直接适应连续适应逐步降低血清浓度

12/11/202223无蛋白培养基(PFM)

不含动物蛋白的培养基，以添加植物水解物替代动物激素、生长因子。

用途

生物技术产品生产12/11/202224

细胞培养中的其它用液平衡盐溶液

PBSHank’s液D-Hank’s液------12/11/202226消化液

胰酶溶液(0.1～0.25%)D-Hank’s液配制最佳pH值：8～9

EDTA溶液(0.02%)

用于解离细胞(破坏细胞间的连接)与胰酶混合用于消化贴壁牢的细胞

胶原酶溶液(0.1～0.3mg/L)

不易损伤细胞，不受Ca2+、Mg2+及血清抑制12/11/202227细胞培养的生长测定血细胞计数法

细胞密度(个/ml)=平均细胞数×104×稀释倍数

影响方法精确性的因素

贴壁细胞消化的时间细胞悬液的均匀性细胞浓度合适12/11/202228MTT比色法

活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于酶标仪上测定光吸收值。紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。

细胞存活率=试验组光吸收值÷对照组光吸收值×100%

MTT法特点高浓度血清的影响简便迅速。不接触同位素，敏感性与同位素法接近。

12/11/202230细胞生长曲线法

可观察同一代细胞的增殖过程。根据生长曲线分析细胞增殖速度，确定具体实验﹑细胞传代的最佳时间。

方法总培养时间7天计数每24小时细胞数目绘制细胞生长曲线

潜伏期原代细胞24-96h传代细胞6-24h

对数生长期3-5d倍增时间

停滞期

12/11/2022313H-TdR掺入法3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞新合成的DNA中，通过测定3H放射性脉冲数，计算细胞的增殖活性。

特点被标记的细胞为S期细胞，3H-TdR掺入量放映DNA合成的快慢。放射性损害。需要特殊实验室和特殊设备。12/11/202232细胞培养中的传代换液问题原代培养后的第一次传代原代培养方法细胞活性细胞类型和特点接种密度培养条件常规传代传代时间对数生长期传代比例原瓶细胞分于2-4瓶贴壁细胞酶充分消化12/11/202233二.角质形成细胞培养问题12/11/202234角质形成细胞培养方法

组织块培养法3T3细胞为滋养层培养法胶原为滋养层培养法气—液交界面培养法无血清培养法12/11/202235组织块培养法

将表皮块贴附在培养瓶壁上,角质形成细胞逐渐从组织块边缘爬行长出。特点

稳定可靠获得的细胞数量有限细胞生长周期长成纤维细胞污染12/11/2022363T3细胞滋养层培养法

3T3细胞经丝裂霉素C或γ-射线预处理(失去分裂增殖功能)后,低密度接种在培养瓶壁上,再将角质形成细胞种植在此细胞滋养层上。

3T3细胞

小鼠胚胎瘤成纤维细胞株滋养层作用促使角质形成细胞的贴附和生长,并形成集落,最后融合成复层鳞状上皮接触性抑制成纤维细胞生长

12/11/2022373T3细胞促进角质形成细胞粘附和生长的途径:

产生基质成分,促进角质形成细胞贴壁。分泌促进角质形成细胞有丝分裂的活性因子。通过细胞间相互作用,调节与角质形成细胞增殖相关的生物因子。

12/11/2022383T3细胞滋养层培养法特点

细胞接种密度低、增殖速度快且细胞生长稳定。3T3细胞逐渐被挤压,随着角质形成细胞集落不断扩大形成冠状,然后被压缩成条索状,最后脱落且消失。3T3细胞培养过程中会分泌异种蛋白和抗原,用它作为滋养层培养的人角质形成细胞或人工表皮,移植后可能引起异种排斥反应。培养过程中角质形成细胞角化明显。

改进法：向培养基中加入表皮生长因子、能增加细胞内cAMP水平的试剂（霍乱毒素等）。12/11/202239胶原滋养层培养法

角质形成细胞的贴壁率玻璃培养瓶2.8%～7%,塑料培养瓶14%预铺胶原的塑料培养瓶70%～80%12/11/202240胶原促进角质形成细胞粘附、生长的机制细胞外基质的主要成分,促进细胞贴壁。覆盖培养瓶壁上不利于角质形成细胞粘附、生长的化学基团。为角质形成细胞提供粘附所需的特异性化学基团。为角质形成细胞的生长提供必要营养。12/11/202241气—液界面培养法

使表皮细胞在更接近正常人体的生理状态下生长和分化。培养皿内加上一层铺垫,再将皮肤角质形成细胞接种其上,加入的培养液不超过铺垫水平,细胞通过铺垫吸收营养维持其生长发育。(接种在铺垫上的细胞先进行浸泡性培养，一定时间后铺垫支架升到气-液界面继续培养，使角质形成细胞完成终末分化。)

12/11/202242铺垫动物或人的尸体的皮肤真皮玻璃纤维片胶原膜或尼龙网胶原膜和尼龙网的贴合物。Transwell培养皿特点

能培养出多层类似正常皮肤的细胞层次，与正常皮肤非常接近。12/11/202243无血清培养法

含血清的传统培养方法特点

必须在培养液中加入一定比例的血清以利于细胞生长,但所含因素变化大,不明因素多,成份复杂。影响角质形成细胞生理和病理生理等的精细研究(对表皮细胞的生长调节机制,培养表皮细胞因子的释放,特殊抗原和受体的表达研究等)。

12/11/202244无血清培养法特点

技术要求较高。培养基中需添加牛脑垂体提取物(WBPE)或猪脑垂体提取物(PWPE)。排除了复杂的血清成分对人角质形成细胞的不利因素影响。为角质形成细胞培养的发展趋势。12/11/202245MCDB153无血清培养基角质形成细胞培养基。适用于低密度接种的传代表皮细胞的生长,但原代培养时细胞克隆形成率较低,不能满足较高密度细胞生长的需要。细胞以单层方式向外生长,但细胞之间缺乏桥粒连接,不能形成表皮皮片。培养液中的牛脑垂体提取物或猪脑垂体提取物价格昂贵，疯牛病的危险。12/11/202246角质形成细胞无血清培养基(DKSFM,Gibco

)去除牛脑垂体提取物。保留对角质形成细胞的促生长作用,同时抑制成纤维细胞生长。角质形成细胞贴壁快,增殖迅速,细胞长满单层后,呈现出典型的铺路石状,细胞呈多角形。细胞免疫组化染色抗角蛋白抗体染色阳性。整个培养周期中,角质细胞呈现出基底细胞形状,细胞表面没有分泌物。操作简便易行,安全适用,避免了以胶原或3T3细胞为滋养层法的缺点。12/11/202247影响角质形成细胞培养的因素皮肤标本的来源

正常人外科包皮环切手术弃之皮肤标本运输和保存

无菌容器

短时间存放于平衡盐溶液,长时间存放于营养液中。标本预处理

清洗、去除组织、剪切12/11/202248表皮和真皮的分离

胰蛋白酶

分离基底细胞和上面的细胞。既破坏桥粒又破坏半桥粒结构。消化时间过长,丢失部分基底细胞。消化时间过短,表皮和真皮分离不完全,混有成纤维细胞。12/11/202249中性蛋白酶

主要分解IV型胶原和纤维粘连蛋白。作用于表皮和真皮的结合处。只破坏半桥粒结构。获得的角质形成细胞活力较高,增殖迅速,融合成片的速度快。减少成纤维细胞污染。可获得含有完整基底层细胞的表皮。

Dispase(GIBCO)中性蛋白酶分离表皮和真皮,再用胰蛋白酶消化表皮成为单个的细胞。12/11/202250培养液中主要的添加物

胰岛素氢化可的松三碘甲状腺原氨酸霍乱毒素转铁蛋白表皮生长因子……12/11/202251主要添加物的作用促进细胞的葡萄糖和氨基酸的吸收。促进细胞的粘附和增殖。促进细胞的合成代谢。提高细胞内第二信使cAMP水平。降低铁离子对细胞的毒性。促进角质形成细胞的有丝分裂。12/11/202252钙离子浓度

与表皮细胞体外培养的多层化有关,钙离子浓度低至一定浓度时,细胞的分层现象消失。低钙(0.05～0.15mM)时角质形成细胞不分化,细胞增殖最佳;当钙离子浓度上升到1.0mM时,角质形成细胞发生分化,显示生长。12/11/202253角质形成细胞株(系)应用

COLO-16株

来自于鳞状上皮癌的人角质形成细胞。

HaCaT株

永生化的正常人皮肤角质形成细胞(>140代)。12/11/202254三.细胞培养技术在皮肤病相关领域中的应用

12/11/202255微载体培养细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。

特点不增加培养容器表面积或培养基容积的前提下提高培养表面积。

省却了容器等的清洗和准备工作。细胞与培养液的分离简单。减少繁复的操作步骤,降低污染率。提高产率。

微载体制作材料的进展

葡聚糖纤维素

聚乙烯和二氧化硅,聚苯乙烯明胶12/11/202256在化妆品功效研究中的应用

传统皮肤细胞培养方法的应用

单层ＫＣ的培养技术---皮肤组织获取和化妆品研发

培养黑素细胞---美白化妆品活性成分筛选朗格罕细胞、ＫＣ和Ｔ淋巴细胞共同培养---体外筛选化妆品过敏作用

富含Merkel细胞的表皮细胞悬液培养---局部应用药物的耐受机制研究12/11/202257成纤维细胞的培养---抗衰老化妆品活性成分开发中应用(筛选中草药有效成分的抗衰老活性)---化妆品生理功效研究中应用

12/11/202258皮肤细胞的“三维培养”

器官型培养(气-液体交界面ＫＣ培养)

分离、培养皮肤的ＫＣ,使其在体外扩增,然后将其接种于真皮类似物上,暴露于空气中,使表皮正常分化,形成类似天然表皮的复层组织(体外重建表皮)。真皮类似物去表皮真皮胶原基质惰性材料

应用

真皮类似物和重建表皮的组合形成具有表皮和真皮的简化的人皮肤。用成纤维细胞研究从表皮透过的化妆品活性物质的生物学效应,了解表、真皮之间的相互作用。将其他细胞(内皮细胞、白细胞)引入真皮类似层,扩大测试系统的使用范围。12/11/202259皮肤器官培养

活体皮肤于体外培养，并使其保持其一定的结构和功能。

培养方法

液体浸没的皮肤器官培养气-液面交界的皮肤器官培养

应用化妆品对皮肤急性刺激毒性研究12/11/202260

在化妆品研发中的应用

延缓皮肤衰老化妆品

以皮肤ＫＣ和成纤维细胞为受试对象,寻找或筛选具有抗衰老活性物质,确定该物质基本毒性情况。(观察对两种细胞增殖能力及活性的影响)

研究外界因素对皮肤的药理学或毒理学作用。(如ＵＶ、药物及化妆品等)将损伤作用作为模型进行化妆品的干预研究

12/11/202261皮肤美白产品

将活的黑色素细胞引入重建真皮类似环境，作为体外皮肤美白剂的初筛模型。光生物学研究,如防晒剂的效果评价。

12/11/202262化妆品配方及成品的毒理学研究

单层皮肤细胞培养外来化学物的代谢及最初的刺激和过敏反应。

皮肤三维培养化妆品的细胞毒性、有效性研究及局部应用化合物(药用化妆品、表面活性剂、渗透剂和杀菌剂等)效果评价。

12/11/202263毛发用化妆品

以毛根鞘上皮细胞为对象,进行护发活性物质的筛选以及毛发用化妆品毒性测试研究。12/11/202264基础研究

皮肤三维培养(重建表皮、真皮类似物)---化妆品和洗护发产品对人体皮肤的刺激性研究---重建表皮可用于研究表皮终末分化以及研究表皮细胞分化调节物、表皮对刺激反应机制；化妆品经皮吸收和化妆品对屏障功能的保护作用---真皮类似物用来研究真皮层的组成及生理功能---重建表皮+真皮类似物共培养系统用来研究皮肤生理代谢、化合物的光毒性、ＵＶ效应和防晒剂的作用12/11/202265体外细胞培养模型

角质形成细胞黑色素细胞朗罕氏细胞成纤维细胞皮脂细胞12/11/202266细胞培养评估方法及指标

评估目的细胞模型评估指标

毒性2,3-Ｄ细胞培养细胞形态,细胞活性(中性红MTT,LDH,PEG2)美白黑素细胞培养黑素的生成黑素细胞和酪氨到酶活性角朊细胞共培养3-Ｄ细胞培养抗衰老成纤维细胞培养细胞增殖,胶原蛋白,角朊细胞培养弹性蛋白,3-Ｄ细胞培养粘多糖等的生成12/11/202267在基因工程药物血药

浓度测定中的应用

特定依赖细胞株培养法

以药物对特定依赖细胞的增殖或抑制、细胞数目的增减为量效指标。细胞增殖法:促进特定依赖细胞株增殖,抑制增殖法:抑制细胞增殖

12/11/202268细胞培养量效指标的测定方法

[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(3H-TdR)59Fe核素标记法四氮唑盐法(MTT)直接计数法其他间接法12/11/202269细胞毒性的观察方法

放射性同位素摄入法

3H-胸腺嘧啶--

3H-亮氨酸--培养基中掺入3H-亮氨酸，根据3H-亮氨酸在细胞内含量测定细胞内蛋白质合成情况。

同位素法特点揭示细胞分子水平的动态变化,是研究细胞代谢状态的重要手段。放射性损害。需要特殊实验室和特殊设备。

四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)

12/11/202270

荧光染色法

乙酰乙酸荧光素法

当细胞受到损伤时,细胞膜的选择通透性屏障作用消失,利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在荧光显微镜下迅速区分受损细胞。12/11/202271发光细胞活力测试

采用一种独特的、稳定性荧光素酶来检测有活力细胞。荧光素酶利用荧光素、氧和ATP作为反应底物，产生氧化荧光