章植物原生质体培养与体细胞杂交示范课件

章植物原生质体培养与体细胞杂交章植物原生质体培养与体细胞杂交1（优选）第九章植物原生质体培养与体细胞杂交（优选）第九章植物原生质体培养与体细胞杂交2二、原生质体的分离1.材料的选取根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤组织和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但要获得高质量的原生质体，应选用生长旺盛、生命力强的组织。材料的生理状态是原生质体质量的决定因素之一，实践证明水肥条件、生长季节、植物年龄、光照等都显著影响原生质体的获得和活力。用悬浮细胞为材料时应每隔35天继代一次，使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天分离原生质体。用叶片作材料时，一般选用刚展开的幼嫩叶片。此外植物生长的湿度、温度等条件对原生质体的分离效果也的明显的影响。如生长在相对湿度为70%，温度为26度的芸苔叶片只能得到少量不能持续分裂的原生质体，而在相对湿度为4045%，温度为1921度条件下生长的叶片可得到理想的原生质体。二、原生质体的分离1.材料的选取3植物细胞壁是由纤维素（25%~50%）、半纤维素（50%左右）、果胶质（5%）组成。因此常用三种相应的酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶酶是必需的，有些材料要加半纤维素酶。商品酶制剂常含有杂质，对原生质体有不良影响，有时要纯化。常用的方法是将酶液在4oC下过BioGelP6或SephadexG25。2、酶的种类植物细胞壁是由纤维素（25%~504常用的商品酶制剂纤维素酶类（主要来源于绿色木霉）纤维素酶EA867（中国）(Tricodermaviride)CellulaseOnzukaR10（Japan）CellulaseOnzukaRS（Japan）Cellulase（Sigma）Cellulysin（USA）果胶酶类（主要来源于黑曲霉）PectolyaseY23（Japan）MacerozymeR10（Japan）Macerozyme（Japan）Pectinase（Sigma）Pectinal（USA）常用的商品酶制剂5

如果溶液的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能被涨破或收缩。因此在酶液、洗涤液和培养液中渗透压应和原生质体内的相等或略大一些。广泛使用的渗透压调节剂是山梨醇和甘露醇，此外还有蔗糖、葡萄糖、和麦芽糖，浓度约在0.40~0.80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能够提高原生质膜的稳定性，增加完整原生质体的数目和活力。3、渗透压的调控如果溶液的渗透压和细胞内的渗透压不同，原64、原生质体的游离（1）材料的预处理有些材料经预处理后可提高原生质体分裂的频率，如暗处理、预培养、低温处理等。（2）材料的灭菌除试管苗、培养细胞等外，材料要进行表面灭菌。（3）酶解处理酶的选择因材料而异，愈伤和悬浮细胞用活性较强的酶，且酶的浓度也要大一些；叶片等材料酶浓度可小一些。pH值一般调在5.6~5.8，酶解处理一般静止暗中进行，悬浮细胞和愈伤组织则要置摇床低速振荡。酶解时间5~24h，温度一般为250C。4、原生质体的游离（1）材料的预处理有些材料经预处理7灭菌试剂浓度（%）去除时间（min）效果次氯酸钠2易5~30很好次氯酸钙9~10易5~30很好过氧化氢10~12最易5~15好二氯化汞0.1~1.0较难5~15最好乙醇70~75易5~30秒好

常用的灭菌试剂灭菌试剂浓度（%）去除时间（mi8

5、原生质体收集与纯化

通常用过滤和离心相结合的方法收集与纯化。（1）

原生质体混合液过筛（40~100m），除去未消化的细胞团、筛管、导管等杂质。（2）滤液离心沉淀原生质体。（3）沉淀重新悬浮，再离心，重复洗三次。（4）用培养基清洗一次，最后用培养基调节原生质体的浓度（104~106/ml）进行培养。5、原生质体收集与纯化9（1）细胞壁染色法荧光增白剂——细胞壁染色剂，既可以鉴定细胞壁是否除净，也可检查原生质体细胞壁的再生情况。染色后在荧光显微镜下观察（360~440nm），染料与细胞壁形成显眼的绿色荧光，无细胞壁处则无荧光反应，略带红色。6、原生质体的活力鉴定（1）细胞壁染色法6、原生质体的活力鉴定10（2）原生质体活力的测定有多种方法，如观察细胞质环流、Evans蓝活性染料染色、测荧光素双醋酸酯（FDA）染色、测定原生质体光合活性等。一般常用的方法是FDA染色，FDA本身无荧光，进入原生质体，在原生质体中受酯酶的分解而产生有荧光的极性荧光物质，积累在有活力的原生质内，便产生荧光。无活力的原生质不能分解FDA，也就无荧光产生。（2）原生质体活力的测定11矮牵牛（Petuniahybrida）叶片原生质体分离的具体操作过程（1）取幼嫩叶片，用自来水洗净，无离子水中浸泡1~2小时，无菌条件下在70%乙醇中浸泡两秒钟，0.1%升汞中浸泡分钟，无菌水洗涤叶片（3~5次）。（2）灭菌后撕去叶片的下表皮，平放于盛有酶液的培养皿中。酶液的组成为2%纤维素酶（75343，上海生化所东风试剂厂）；0.5mol甘露醇，pH5.6，使用前用04.5m微孔滤膜抽滤灭菌。（3）酶液处理260C度，约3小时，将悬浮有原生质体的酶液200目镍丝网过滤，离心（500rpm，3~5min），弃去酶液。收集原生质体，用0.5mol甘露醇洗一次（离心），再用液体培养基洗一次，最后添加培养基，制成密度为1~2104/ml的原生质体悬浮液。（原生质体呈球形，叶绿体分布均匀，呈亮绿色。）矮牵牛（Petuniahybrid12原生质体经分离纯化后，在合适的培养基和培养条件才能正常生长发育，最后再生成完整植株。由于没有细胞壁，原生质体对环境的刺激更敏感，培养基的成分和培养方法的变化都会引起细胞内部生理、生化变化。三、植物原生质体的培养原生质体经分离纯化后，在合适的培养131、原生质体培养基原生质体培养基一般是在组织、细胞培养基的基础上加以改进而制成。如常用的KM8P培养基是以B5培养基为基础，NT培养基是以MS培养基为基础改进而成。（1）渗透压稳定剂常用的是甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等。这些物质既保持培养基的渗透浓度，同时也是原生质体生长的碳源。1、原生质体培养基原生质体培养基一般14（2）无机盐是培养基的主要成分，分大量的微量元素两部分。大量元素中影响最大的是Ca2+和NH4+。较高的Ca2+浓度能提高原生质体的稳定性，同样也有利于原生质体的生长发育。因此常用大量元素减半的MS培养基时，Ca2+浓度不降低；高浓度NH4+对原生质体生长发育不利，很多原生质体培养采用除去铵盐而用有机氮做氮源的方法。其他如有机营养、激素等在组织、细胞培养基的基础上根据培养要求适当改进。（2）无机盐是培养基的主要成分，分大量的微量元素两部分。15常用的灭菌试剂但要获得高质量的原生质体，应选用生长旺盛、生命力强的组织。次氯酸钙9~10易5~30很好前两种为隐性性状，后一种为显性性状，其互补的原理是一致的。酶液的组成为2%纤维素酶（75343，上海生化所东风试剂厂）；PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集，但PEG诱导融合的机理目前还不清楚，有研究发现，将商品PEG纯化后就完全失去了诱导融合的能力，但并不影响原生质体的凝集。250C保温15~45min自养aB+自养Ab自养AaBb15min后加另一滴（约0.部分亲合的杂种细胞；选择融合体或杂种细胞；6%）的培养基等量混合，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。原生质体可按Bergmann的细胞植板法用琼脂平板进行培养。1）化学方法一般常用的方法是FDA染色，FDA本身无荧光，进入原生质体，在原生质体中受酯酶的分解而产生有荧光的极性荧光物质，积累在有活力的原生质内，便产生荧光。常用的PEG和高pH高Ca相结合诱导融合的具体操作程序用不同的生化抑制剂处理亲本原生质体，使其代谢机能受阻，不能在培养基上生长。（3）沉淀重新悬浮，再离心，重复洗三次。根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤组织和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。（1）液体培养法培养基中不加固化剂，原生质体悬浮在液体培养基中。常用的有液体浅层培养法、微滴培养法。液体浅层培养法操作简便，对原生质体伤害小，且便于添加培养基和转移培养物，是广泛应用的方法之一；

2、原生质体的培养方法常用的灭菌试剂（1）液体16

微滴培养法是将悬有原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴接种到无菌清洁干燥培养皿中，培养皿封口防止干燥和污染（如果把培养皿翻转过来则成为悬滴培养）。该法的优点是在一个培养皿中可做很多种培养基的对照实验，且其中一滴发生污染不会殃及整个实验；缺点是原生质体分布不均匀（集中在中央），且易蒸发干燥。

微滴培养法是将悬有原生质体的培养液用17（2）固体培养法该法是将悬浮在液体培养基中的原生质体与热融的含琼脂（0.6%）的培养基等量混合，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。由于原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，因而避免了细胞间有害代谢产物的相互影响，且便于定点观察，追踪单个细胞的发育过程。（2）固体培养法18（3）固液结合培养法即在培养皿的底部先铺一层固体培养基（含或不含原生质体），再在其上进行液体浅层培养。这样固体培养基中的营养成分可缓慢向液体中释放，以补充培养物对营养物的消耗，也可吸收培养物产生的一些有害物质，对培养物的生长更为有利。用上述各方法，一般培养1~2d原生质体体积显著增大，2~3d即可形成新的细胞壁，3~7天后开始分裂，15d左右形成小的细胞团(20~40个细胞)，30~40d发育成肉眼可见的小愈伤组织。（3）固液结合培养法用上述各方19当愈伤组织直径为1~2mm时，可将其转移到固体分化培养基上，一般是先诱导芽分化，再诱导根分化。小愈伤组织在固体分化培养基上生长迅速，约30d后直径可达础0.5cm，同时愈组织变绿（不同来源的材料表现不一），进一步诱导分化形成绿芽。然后转移到生根培养基上或不含任何激素的培养基上诱导分化形成根，再生完整植株。当愈伤组织直径为1~2mm时，可将其转203.原生质体的培养的技术流程

原生质体可按Bergmann的细胞植板法用琼脂平板进行培养。如下图所示。

3.原生质体的培养的技术流程

原生质体可按B21章植物原生质体培养与体细胞杂交示范课件224.植物原生质体培养再生植株实例玉米小偃麦棉花4.植物原生质体培养再生植株实例23玉米原生质体植株再生1、从胚性愈伤组织分离的原生质体。2、培养4天后再生细胞进行第一次分裂。3、培养约三星期的小愈伤组织。4、分化的胚芽鞘。5、分化的小植株。玉米原生质体植株再生1、从胚性愈伤组织分24小偃麦原生质体植株再生小偃麦原生质体植株再生25棉花原生质体植株再生棉花原生质体植株再生26

1、体细胞杂交的概念

凡是两个细胞或原生质体融合成一个细胞的过程称为细胞杂交（cellhybridization）。原生质体可从体细胞和性细胞获得，但植物细胞杂交都用来自叶肉、根尖、茎端、髓部等组织的体细胞原生质体作为杂交亲本，故常称之为体细胞杂交（somatichybridization）。四、植物体细胞杂交1、体细胞杂交的概念四、植物体细胞杂交27通俗地说，细胞杂交（或融合）就是两个不同种的活细胞紧密接触在一起，使接触部位的细胞膜发生融化，这样两个细胞的细胞质、细胞器互相交流，最后完全合并成一个细胞。通过科学的培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物体，即原来两个细胞所属的物种的杂种后代。所形成的杂种后代有可能兼有两个亲本的一些优良性状，因而对改良品种，提高农、林、牧业产品产量和质量具有重要意义。通俗地说，细胞杂交（或融合）就是两个不同种的活28异核质杂种；2、培养4天后再生细胞进行第一次分裂。1mol葡萄糖、10.用不同的生化抑制剂处理亲本原生质体，使其代谢机能受阻，不能在培养基上生长。荧光增白剂——细胞壁染色剂，既可以鉴定细胞壁是否除净，也可检查原生质体细胞壁的再生情况。因而可将原生质体的再生能力看作显性性状，用来淘汰无再生能力的一方亲本。此法准确性优于形态学特征，但也有局限性，因为经过愈伤组织阶段的细胞本来就有染色体变异的可能。如何将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，是体细胞杂交技术的以一重要环节。PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。用叶片作材料时，一般选用刚展开的幼嫩叶片。当非等位隐基因控制的两个突变细胞融合后，由于每一亲本细胞贡献一个功能正常的等位基因，纠正了亲本对方的缺陷，使杂种细胞表现正常。PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集，但PEG诱导融合的机理目前还不清楚，有研究发现，将商品PEG纯化后就完全失去了诱导融合的能力，但并不影响原生质体的凝集。二氯化汞0.用0.用荧光活性染料使不同亲本染上不同颜色进行选择，有单标记和双标记。用悬浮细胞为材料时应每隔35天继代一次，使细胞处于旺盛生长状态。5）加1gPEG1560（或4000、6000，其它浓度）Pectinase（Sigma）（1）诱导原生质体融合选择出的融合细胞经培养再生成植株后，究竟是不是细胞杂种还需进一步鉴定。（1）液体培养法起源细胞细胞壁降解亲本原生质体诱导融合聚集、粘连胞质融合异核体核融合胞壁再生杂种细胞培养选择杂种愈伤组织诱导分化杂种植株2、植物细胞杂交程序异核质杂种；起源细胞细胞壁降解亲本原生质体诱导融合聚集293.植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术包括以下三个环节诱导原生质体融合；选择融合体或杂种细胞；杂种细胞的培养与鉴定。

3.植物体细胞杂交技术30

（1）诱导原生质体融合

诱导原生质体融合是体细胞杂交的基本技术环节，常用的方法有化学方法和电融合方法。

1）化学方法化学方法最早是用硝酸钙溶液作融合剂，但由于它本身对细胞有毒，且诱导融合的频率不高。目前最常用的化学融合剂是聚乙二醇（PEG）。（1）诱导原生质体融合

诱导原生质体融合是体31PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。其缺点是易形成多融合体。在PEG溶液中加入融合促进剂如刀豆球蛋白A、15%的二甲基亚砜、链霉蛋白酶、精胺、亚精胺等，都能明显提高融合频率。PEG毒性低，且没有种、属、科间的32PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集，但PEG诱导融合的机理目前还不清楚，有研究发现，将商品PEG纯化后就完全失去了诱导融合的能力，但并不影响原生质体的凝集。对纯化除去的杂质经鉴定是一些抗氧化剂，如生育酚（Ve）和其它酚类衍生物。如把纯化的PEG与低分子量的脂肪酸结合应用，融合频率比商品PEG高15~20倍。PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集33常用的PEG和高pH高Ca相结合诱导融合的具体操作程序混合双亲原生质体悬液，吸一小滴悬液于小培养皿中，5~15min后原生质体沉到底面形成薄层；每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG溶液的组成2难度ml溶液（内含0.1mol葡萄糖、10.5mmolCaCI2、0.7molKH2PO4，KOH调节pH到5.5）加1gPEG1560（或4000、6000，其它浓度）250C保温15~45min常用的PEG和高pH高Ca相结合诱导融合34用0.5ml高pH高Ca溶液稀释（50mmolCaCl2、0.3mol葡萄糖、50mmol甘氨酸、1000ml蒸馏水，NaOH调pH到10.5）.

15min后加另一滴（约0.5ml）高pH高Ca溶液；

15min后用1~2ml原生质体培养基稀释；用总量为20ml培养基洗涤5次；

在0.5ml左右原生质体培养基中培养。用0.5ml高pH高35该技术从建立（1979）以来发展很快。电融合需要有特制的融合仪和融合板，原生质体放在板上的两电极之间。先给两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向呈串珠状排列，接着给以瞬间高强度电脉冲，使原生质体膜局部损伤而导致融合。处理时原生质体的适宜密度、CaCI2的浓度、

变电流的强度、电脉冲的大小、脉冲期宽度与间隔都影响融合的频率。

2）电融合法：该技术从建立（1979）以来发展很36两亲本原生质体融合后形成异核体，进行有丝分裂过程中发生核融合，形成杂种细胞亲合的杂种细胞；部分亲合的杂种细胞；胞质杂种；异核质杂种；如何将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，是体细胞杂交技术的以一重要环节。（2）异核体或杂种细胞的选择两亲本原生质体融合后形成异核体，进行有37类型细胞核细胞质产物1234A，BA，B（少量）A（少量），BA（或B）A（或B）A，BA，BA，BA，BA（或B）亲和的杂种细胞部分亲和的杂种细胞胞质杂种胞质杂种异核质杂种类型细胞核细胞质产381）利用生长特性的差异进行选择

植物细胞对培养基成分的要求与反应不同可作为选择的依据。如粉蓝烟草和朗氏烟草的原生质都需要外源激素，但它们间的杂种细胞能产生内源激素，用无激素的培养基就可将杂种细胞选出来；又如曼陀罗与烟草的杂种细胞愈伤组织比两亲本的愈伤组织生长得快，这种生长速度上的差异也可作为选择的依据。1）利用生长特性的差异进行选择植391）杂种植株和亲本植株的形态学特征但应注意这些性状是由多基因控制的，未融合的细胞在培养再生过程中也会有不正常的植株出现，因此，此法一般不能单独使用。PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。混合双亲原生质体悬液，吸一小滴悬液于小培养皿中，5~15min后原生质体沉到底面形成薄层；当两个抗性系的原生质体融合时，每个亲本的药物敏感性分别被亲本对方的抗性所掩盖，因而两个单抗的亲本细胞融合后产生双抗的杂种细胞，用相应的选择培养基就将杂种细胞选择出来。即在培养皿的底部先铺一层固体培养基（含或不含原生质体），再在其上进行液体浅层培养。PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。这些物质既保持培养基的渗透浓度，同时也是原生质体生长的碳源。即在培养皿的底部先铺一层固体培养基（含或不含原生质体），再在其上进行液体浅层培养。原生质体再生植株的能力作为选择的依据。化学方法最早是用硝酸钙溶液作融合剂，但由于它本身对细胞有毒，且诱导融合的频率不高。常用的方法是将酶液在4oC下过BioGelP6或SephadexG25。白化aB+白化Ab绿色AaBb0较难5~15最好（1）诱导原生质体融合无活力的原生质不能分解FDA，也就无荧光产生。

原生质体再生植株的能力作为选择的依据。在种内、种间、属间的体细胞杂交实验中，只要亲本一方能再生植株，杂种细胞就能再生植株。因而可将原生质体的再生能力看作显性性状，用来淘汰无再生能力的一方亲本。再与其它方法相结合，将能再生的一方亲本淘汰，选择出杂种植株。

1）杂种植株和亲本植株的形态学特征原生质40

通过人为的方法导致细胞在培养基的生长差异进行选择。用不同的生化抑制剂处理亲本原生质体，使其代谢机能受阻，不能在培养基上生长。如碘乙酸酯处理使原生质体核失活，罗达明6G能抑制氧化磷酸化过程，这些处理都能使原生质体在培养基上不能分裂，而融合后产生的杂种细胞，由于重建了必要的代谢支路，能在培养基上正常生长可将其选择出来。这是最为简便且广泛应用的选择方法。通过人为的方法导致细胞在培养41

突变细胞互补选择是研究的较多的一种选择方法，包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补和抗性互补。前两种为隐性性状，后一种为显性性状，其互补的原理是一致的。

2）利用突变细胞系互补的方法选择：突变细胞互补选择是研究的较多的一种选42选择系统原则自养互补白化互补抗性互补自养aB+自养Ab自养AaBb白化aB+白化Ab绿色AaBb抗aB+抗Ab双抗AaBb选择系统原43

当非等位隐基因控制的两个突变细胞融合后，由于每一亲本细胞贡献一个功能正常的等位基因，纠正了亲本对方的缺陷，使杂种细胞表现正常。当两个抗性系的原生质体融合时，每个亲本的药物敏感性分别被亲本对方的抗性所掩盖，因而两个单抗的亲本细胞融合后产生双抗的杂种细胞，用相应的选择培养基就将杂种细胞选择出来。

当非等位隐基因控制的两个突变细胞融合后，44人们已建立了通用杂交亲本。通过有性杂交将硝酸还原酶缺陷的突变体与抗链霉素突变体综合在一个突变系中，建立了同时具有显、隐性突变的烟草双突变体。它可以与任何一个无选择标记的原生质体融合，利用亲本对方对链霉素敏感及双突变体特殊的营养要求（还原氮），很容易用选择培养基将杂种细胞选择出来。人们已建立了通用杂交亲本。通过有性45目前构建的双突变体的隐性性状都是硝酸还原酶缺陷，显性性状除链霉素抗性外，还有卡那霉素抗、抗5甲基色氨酸等。这类双突变体都可作为通用杂交亲本。由于与双突变体杂交的亲本无须作选择标记，这就大大扩大了体细胞杂交的研究范围，只要与双突变体融合的亲本原生质体有再生能力，也就有可能在融合后获得能再生的杂种植株目前构建的双突变体的隐性性状都是硝酸还原酶缺46原生质体的物理性状，如大小、颜色与漂浮密度等可以作为选择的依据。原生质体再生愈伤组织的形态、颜色作为选择的依据。用荧光活性染料使不同亲本染上不同颜色进行选择，有单标记和双标记。3）利用物理特性的差异选择：原生质体的物理性状，如大小、颜色与漂47如用罗明123染色使原生质体在荧光显微镜下呈绿色，溴化乙锭染色使细胞核在显微镜下呈红色，融合处理后用由计算机控制的自动分类仪器将杂合两种颜色的杂种细胞分离出来。叶肉原生质体与悬浮细胞原生质体融合时，只对后者进行荧光标记，即可选择。如用罗明123染色使原生质体在荧光显48选择出的融合细胞经培养再生成植株后，究竟是不是细胞杂种还需进一步鉴定。常用的方法有以下几种，一般情况下可将几种方法结合起来进行鉴定。

（3）体细胞杂种的鉴定选择出的融合细胞经培养再生成植株后，491）杂种植株和亲本植株的形态学特征如叶片的大小与形状，花的形状与颜色，叶脉、叶柄、花梗及表皮毛状体等都可作为鉴定的指标。但应注意这些性状是由多基因控制的，未融合的细胞在培养再生过程中也会有不正常的植株出现，因此，此法一般不能单独使用。1）杂种植株和亲本植株的形态学特征50

观察细胞杂种的染色体数目、大小、长短、染色反应、染色体配对情况等，并与亲本染色体比较。此法准确性优于形态学特征，但也有局限性，因为经过愈伤组织阶段的细胞本来就有染色体变异的可能。一般情况下，两亲本之间的染色体差异显著，有利于杂种的鉴定。因此远缘杂交组合，由于两亲本之间染色体差异大，通过染色体形态区分和计数能把细胞杂种鉴定出来。

2）杂种和亲本的核型分析：观察细胞杂种的染色体数目、大小、长短、染51章植物原生质体培养与体细胞杂交章植物原生质体培养与体细胞杂交52（优选）第九章植物原生质体培养与体细胞杂交（优选）第九章植物原生质体培养与体细胞杂交53二、原生质体的分离1.材料的选取根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤组织和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但要获得高质量的原生质体，应选用生长旺盛、生命力强的组织。材料的生理状态是原生质体质量的决定因素之一，实践证明水肥条件、生长季节、植物年龄、光照等都显著影响原生质体的获得和活力。用悬浮细胞为材料时应每隔35天继代一次，使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天分离原生质体。用叶片作材料时，一般选用刚展开的幼嫩叶片。此外植物生长的湿度、温度等条件对原生质体的分离效果也的明显的影响。如生长在相对湿度为70%，温度为26度的芸苔叶片只能得到少量不能持续分裂的原生质体，而在相对湿度为4045%，温度为1921度条件下生长的叶片可得到理想的原生质体。二、原生质体的分离1.材料的选取54植物细胞壁是由纤维素（25%~50%）、半纤维素（50%左右）、果胶质（5%）组成。因此常用三种相应的酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶酶是必需的，有些材料要加半纤维素酶。商品酶制剂常含有杂质，对原生质体有不良影响，有时要纯化。常用的方法是将酶液在4oC下过BioGelP6或SephadexG25。2、酶的种类植物细胞壁是由纤维素（25%~5055常用的商品酶制剂纤维素酶类（主要来源于绿色木霉）纤维素酶EA867（中国）(Tricodermaviride)CellulaseOnzukaR10（Japan）CellulaseOnzukaRS（Japan）Cellulase（Sigma）Cellulysin（USA）果胶酶类（主要来源于黑曲霉）PectolyaseY23（Japan）MacerozymeR10（Japan）Macerozyme（Japan）Pectinase（Sigma）Pectinal（USA）常用的商品酶制剂56

如果溶液的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能被涨破或收缩。因此在酶液、洗涤液和培养液中渗透压应和原生质体内的相等或略大一些。广泛使用的渗透压调节剂是山梨醇和甘露醇，此外还有蔗糖、葡萄糖、和麦芽糖，浓度约在0.40~0.80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能够提高原生质膜的稳定性，增加完整原生质体的数目和活力。3、渗透压的调控如果溶液的渗透压和细胞内的渗透压不同，原574、原生质体的游离（1）材料的预处理有些材料经预处理后可提高原生质体分裂的频率，如暗处理、预培养、低温处理等。（2）材料的灭菌除试管苗、培养细胞等外，材料要进行表面灭菌。（3）酶解处理酶的选择因材料而异，愈伤和悬浮细胞用活性较强的酶，且酶的浓度也要大一些；叶片等材料酶浓度可小一些。pH值一般调在5.6~5.8，酶解处理一般静止暗中进行，悬浮细胞和愈伤组织则要置摇床低速振荡。酶解时间5~24h，温度一般为250C。4、原生质体的游离（1）材料的预处理有些材料经预处理58灭菌试剂浓度（%）去除时间（min）效果次氯酸钠2易5~30很好次氯酸钙9~10易5~30很好过氧化氢10~12最易5~15好二氯化汞0.1~1.0较难5~15最好乙醇70~75易5~30秒好

常用的灭菌试剂灭菌试剂浓度（%）去除时间（mi59

5、原生质体收集与纯化

通常用过滤和离心相结合的方法收集与纯化。（1）

原生质体混合液过筛（40~100m），除去未消化的细胞团、筛管、导管等杂质。（2）滤液离心沉淀原生质体。（3）沉淀重新悬浮，再离心，重复洗三次。（4）用培养基清洗一次，最后用培养基调节原生质体的浓度（104~106/ml）进行培养。5、原生质体收集与纯化60（1）细胞壁染色法荧光增白剂——细胞壁染色剂，既可以鉴定细胞壁是否除净，也可检查原生质体细胞壁的再生情况。染色后在荧光显微镜下观察（360~440nm），染料与细胞壁形成显眼的绿色荧光，无细胞壁处则无荧光反应，略带红色。6、原生质体的活力鉴定（1）细胞壁染色法6、原生质体的活力鉴定61（2）原生质体活力的测定有多种方法，如观察细胞质环流、Evans蓝活性染料染色、测荧光素双醋酸酯（FDA）染色、测定原生质体光合活性等。一般常用的方法是FDA染色，FDA本身无荧光，进入原生质体，在原生质体中受酯酶的分解而产生有荧光的极性荧光物质，积累在有活力的原生质内，便产生荧光。无活力的原生质不能分解FDA，也就无荧光产生。（2）原生质体活力的测定62矮牵牛（Petuniahybrida）叶片原生质体分离的具体操作过程（1）取幼嫩叶片，用自来水洗净，无离子水中浸泡1~2小时，无菌条件下在70%乙醇中浸泡两秒钟，0.1%升汞中浸泡分钟，无菌水洗涤叶片（3~5次）。（2）灭菌后撕去叶片的下表皮，平放于盛有酶液的培养皿中。酶液的组成为2%纤维素酶（75343，上海生化所东风试剂厂）；0.5mol甘露醇，pH5.6，使用前用04.5m微孔滤膜抽滤灭菌。（3）酶液处理260C度，约3小时，将悬浮有原生质体的酶液200目镍丝网过滤，离心（500rpm，3~5min），弃去酶液。收集原生质体，用0.5mol甘露醇洗一次（离心），再用液体培养基洗一次，最后添加培养基，制成密度为1~2104/ml的原生质体悬浮液。（原生质体呈球形，叶绿体分布均匀，呈亮绿色。）矮牵牛（Petuniahybrid63原生质体经分离纯化后，在合适的培养基和培养条件才能正常生长发育，最后再生成完整植株。由于没有细胞壁，原生质体对环境的刺激更敏感，培养基的成分和培养方法的变化都会引起细胞内部生理、生化变化。三、植物原生质体的培养原生质体经分离纯化后，在合适的培养641、原生质体培养基原生质体培养基一般是在组织、细胞培养基的基础上加以改进而制成。如常用的KM8P培养基是以B5培养基为基础，NT培养基是以MS培养基为基础改进而成。（1）渗透压稳定剂常用的是甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等。这些物质既保持培养基的渗透浓度，同时也是原生质体生长的碳源。1、原生质体培养基原生质体培养基一般65（2）无机盐是培养基的主要成分，分大量的微量元素两部分。大量元素中影响最大的是Ca2+和NH4+。较高的Ca2+浓度能提高原生质体的稳定性，同样也有利于原生质体的生长发育。因此常用大量元素减半的MS培养基时，Ca2+浓度不降低；高浓度NH4+对原生质体生长发育不利，很多原生质体培养采用除去铵盐而用有机氮做氮源的方法。其他如有机营养、激素等在组织、细胞培养基的基础上根据培养要求适当改进。（2）无机盐是培养基的主要成分，分大量的微量元素两部分。66常用的灭菌试剂但要获得高质量的原生质体，应选用生长旺盛、生命力强的组织。次氯酸钙9~10易5~30很好前两种为隐性性状，后一种为显性性状，其互补的原理是一致的。酶液的组成为2%纤维素酶（75343，上海生化所东风试剂厂）；PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集，但PEG诱导融合的机理目前还不清楚，有研究发现，将商品PEG纯化后就完全失去了诱导融合的能力，但并不影响原生质体的凝集。250C保温15~45min自养aB+自养Ab自养AaBb15min后加另一滴（约0.部分亲合的杂种细胞；选择融合体或杂种细胞；6%）的培养基等量混合，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。原生质体可按Bergmann的细胞植板法用琼脂平板进行培养。1）化学方法一般常用的方法是FDA染色，FDA本身无荧光，进入原生质体，在原生质体中受酯酶的分解而产生有荧光的极性荧光物质，积累在有活力的原生质内，便产生荧光。常用的PEG和高pH高Ca相结合诱导融合的具体操作程序用不同的生化抑制剂处理亲本原生质体，使其代谢机能受阻，不能在培养基上生长。（3）沉淀重新悬浮，再离心，重复洗三次。根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤组织和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。（1）液体培养法培养基中不加固化剂，原生质体悬浮在液体培养基中。常用的有液体浅层培养法、微滴培养法。液体浅层培养法操作简便，对原生质体伤害小，且便于添加培养基和转移培养物，是广泛应用的方法之一；

2、原生质体的培养方法常用的灭菌试剂（1）液体67

微滴培养法是将悬有原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴接种到无菌清洁干燥培养皿中，培养皿封口防止干燥和污染（如果把培养皿翻转过来则成为悬滴培养）。该法的优点是在一个培养皿中可做很多种培养基的对照实验，且其中一滴发生污染不会殃及整个实验；缺点是原生质体分布不均匀（集中在中央），且易蒸发干燥。

微滴培养法是将悬有原生质体的培养液用68（2）固体培养法该法是将悬浮在液体培养基中的原生质体与热融的含琼脂（0.6%）的培养基等量混合，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。由于原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，因而避免了细胞间有害代谢产物的相互影响，且便于定点观察，追踪单个细胞的发育过程。（2）固体培养法69（3）固液结合培养法即在培养皿的底部先铺一层固体培养基（含或不含原生质体），再在其上进行液体浅层培养。这样固体培养基中的营养成分可缓慢向液体中释放，以补充培养物对营养物的消耗，也可吸收培养物产生的一些有害物质，对培养物的生长更为有利。用上述各方法，一般培养1~2d原生质体体积显著增大，2~3d即可形成新的细胞壁，3~7天后开始分裂，15d左右形成小的细胞团(20~40个细胞)，30~40d发育成肉眼可见的小愈伤组织。（3）固液结合培养法用上述各方70当愈伤组织直径为1~2mm时，可将其转移到固体分化培养基上，一般是先诱导芽分化，再诱导根分化。小愈伤组织在固体分化培养基上生长迅速，约30d后直径可达础0.5cm，同时愈组织变绿（不同来源的材料表现不一），进一步诱导分化形成绿芽。然后转移到生根培养基上或不含任何激素的培养基上诱导分化形成根，再生完整植株。当愈伤组织直径为1~2mm时，可将其转713.原生质体的培养的技术流程

原生质体可按Bergmann的细胞植板法用琼脂平板进行培养。如下图所示。

3.原生质体的培养的技术流程

原生质体可按B72章植物原生质体培养与体细胞杂交示范课件734.植物原生质体培养再生植株实例玉米小偃麦棉花4.植物原生质体培养再生植株实例74玉米原生质体植株再生1、从胚性愈伤组织分离的原生质体。2、培养4天后再生细胞进行第一次分裂。3、培养约三星期的小愈伤组织。4、分化的胚芽鞘。5、分化的小植株。玉米原生质体植株再生1、从胚性愈伤组织分75小偃麦原生质体植株再生小偃麦原生质体植株再生76棉花原生质体植株再生棉花原生质体植株再生77

1、体细胞杂交的概念

凡是两个细胞或原生质体融合成一个细胞的过程称为细胞杂交（cellhybridization）。原生质体可从体细胞和性细胞获得，但植物细胞杂交都用来自叶肉、根尖、茎端、髓部等组织的体细胞原生质体作为杂交亲本，故常称之为体细胞杂交（somatichybridization）。四、植物体细胞杂交1、体细胞杂交的概念四、植物体细胞杂交78通俗地说，细胞杂交（或融合）就是两个不同种的活细胞紧密接触在一起，使接触部位的细胞膜发生融化，这样两个细胞的细胞质、细胞器互相交流，最后完全合并成一个细胞。通过科学的培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物体，即原来两个细胞所属的物种的杂种后代。所形成的杂种后代有可能兼有两个亲本的一些优良性状，因而对改良品种，提高农、林、牧业产品产量和质量具有重要意义。通俗地说，细胞杂交（或融合）就是两个不同种的活79异核质杂种；2、培养4天后再生细胞进行第一次分裂。1mol葡萄糖、10.用不同的生化抑制剂处理亲本原生质体，使其代谢机能受阻，不能在培养基上生长。荧光增白剂——细胞壁染色剂，既可以鉴定细胞壁是否除净，也可检查原生质体细胞壁的再生情况。因而可将原生质体的再生能力看作显性性状，用来淘汰无再生能力的一方亲本。此法准确性优于形态学特征，但也有局限性，因为经过愈伤组织阶段的细胞本来就有染色体变异的可能。如何将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，是体细胞杂交技术的以一重要环节。PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。用叶片作材料时，一般选用刚展开的幼嫩叶片。当非等位隐基因控制的两个突变细胞融合后，由于每一亲本细胞贡献一个功能正常的等位基因，纠正了亲本对方的缺陷，使杂种细胞表现正常。PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集，但PEG诱导融合的机理目前还不清楚，有研究发现，将商品PEG纯化后就完全失去了诱导融合的能力，但并不影响原生质体的凝集。二氯化汞0.用0.用荧光活性染料使不同亲本染上不同颜色进行选择，有单标记和双标记。用悬浮细胞为材料时应每隔35天继代一次，使细胞处于旺盛生长状态。5）加1gPEG1560（或4000、6000，其它浓度）Pectinase（Sigma）（1）诱导原生质体融合选择出的融合细胞经培养再生成植株后，究竟是不是细胞杂种还需进一步鉴定。（1）液体培养法起源细胞细胞壁降解亲本原生质体诱导融合聚集、粘连胞质融合异核体核融合胞壁再生杂种细胞培养选择杂种愈伤组织诱导分化杂种植株2、植物细胞杂交程序异核质杂种；起源细胞细胞壁降解亲本原生质体诱导融合聚集803.植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术包括以下三个环节诱导原生质体融合；选择融合体或杂种细胞；杂种细胞的培养与鉴定。

3.植物体细胞杂交技术81

（1）诱导原生质体融合

诱导原生质体融合是体细胞杂交的基本技术环节，常用的方法有化学方法和电融合方法。

1）化学方法化学方法最早是用硝酸钙溶液作融合剂，但由于它本身对细胞有毒，且诱导融合的频率不高。目前最常用的化学融合剂是聚乙二醇（PEG）。（1）诱导原生质体融合

诱导原生质体融合是体82PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。其缺点是易形成多融合体。在PEG溶液中加入融合促进剂如刀豆球蛋白A、15%的二甲基亚砜、链霉蛋白酶、精胺、亚精胺等，都能明显提高融合频率。PEG毒性低，且没有种、属、科间的83PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集，但PEG诱导融合的机理目前还不清楚，有研究发现，将商品PEG纯化后就完全失去了诱导融合的能力，但并不影响原生质体的凝集。对纯化除去的杂质经鉴定是一些抗氧化剂，如生育酚（Ve）和其它酚类衍生物。如把纯化的PEG与低分子量的脂肪酸结合应用，融合频率比商品PEG高15~20倍。PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集84常用的PEG和高pH高Ca相结合诱导融合的具体操作程序混合双亲原生质体悬液，吸一小滴悬液于小培养皿中，5~15min后原生质体沉到底面形成薄层；每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG溶液的组成2难度ml溶液（内含0.1mol葡萄糖、10.5mmolCaCI2、0.7molKH2PO4，KOH调节pH到5.5）加1gPEG1560（或4000、6000，其它浓度）250C保温15~45min常用的PEG和高pH高Ca相结合诱导融合85用0.5ml高pH高Ca溶液稀释（50mmolCaCl2、0.3mol葡萄糖、50mmol甘氨酸、1000ml蒸馏水，NaOH调pH到10.5）.

15min后加另一滴（约0.5ml）高pH高Ca溶液；

15min后用1~2ml原生质体培养基稀释；用总量为20ml培养基洗涤5次；

在0.5ml左右原生质体培养基中培养。用0.5ml高pH高86该技术从建立（1979）以来发展很快。电融合需要有特制的融合仪和融合板，原生质体放在板上的两电极之间。先给两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向呈串珠状排列，接着给以瞬间高强度电脉冲，使原生质体膜局部损伤而导致融合。处理时原生质体的适宜密度、CaCI2的浓度、

变电流的强度、电脉冲的大小、脉冲期宽度与间隔都影响融合的频率。

2）电融合法：该技术从建立（1979）以来发展很87两亲本原生质体融合后形成异核体，进行有丝分裂过程中发生核融合，形成杂种细胞亲合的杂种细胞；部分亲合的杂种细胞；胞质杂种；异核质杂种；如何将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，是体细胞杂交技术的以一重要环节。（2）异核体或杂种细胞的选择两亲本原生质体融合后形成异核体，进行有88类型细胞核细胞质产物1234A，BA，B（少量）A（少量），BA（或B）A（或B）A，BA，BA，BA，BA（或B）亲和的杂种细胞部分亲和的杂种细胞胞质杂种胞质杂种异核质杂种类型细胞核细胞质产891）利用生长特性的差异进行选择

植物细胞对培养基成分的要求与反应不同可作为选择的依据。如粉蓝烟草和朗氏烟草的原生质都需要外源激素，但它们间的杂种细胞能产生内源激素，用无激素的培养基就可将杂种细胞选出来；又如曼陀罗与烟草的杂种细胞愈伤组织比两亲本的愈伤组织生长得快，这种生长速度上的差异也可作为选择的依据。1）利用生长特性的差异进行选择植901）杂种植株和亲本植株的形态学特征但应注意这些性状是由多基因控制的，未融合的细胞在培养再生过程中也会有不正常的植株出现，因此，此法一般不能单独使用。PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。混合双亲原生质体悬液，吸一小滴悬液于小培养皿中，5~15min后原生质体沉到底面形成薄层；当两个抗性系的原生质体融合时，每个亲本的药物敏感性分别被亲本对方的抗性所掩盖，因而两个单抗的亲本细胞融合后产生双抗的杂种细胞，用相应的选择培养基就将杂种细胞选择出来。即在培养皿的底部先铺一层固体培养基（含或不含原生质体），再在其上进行液体浅层培养。PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。这些物质既保持培养基的渗透浓度，同时也是原生质体生长的碳源。即在培养皿的底部先铺一层固体培养基（含或不含原生质体），再在其上进行液体浅层培养。原生质体再生植株的能力作为选择的依据。化学方法最早是用硝酸钙溶液作融合剂，但由于它本身