分子克隆工具酶课件

第一篇基因操作原理12/10/20221第一篇基因操作原理12/10/20221

A.用于核酸操作的工具酶B.用于基因克隆的载体C.用于基因转移的受体菌或细胞用于核酸操作的工具酶有哪些？体外重组DNA技术所需的基本条件？12/10/20222A.用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶有哪些？第二章分子克隆工具酶12/10/20223第二章分子克隆工具酶12/10/2022312/10/2022412/10/20224基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

基因工程工具酶12/10/20225基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性

自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程工具酶12/10/20226自然界的许多微生物体内存在着一些具有

限制性内切酶

甲基化酶

DNA连接酶

DNA聚合酶

RNA聚合酶

磷酸激酶和磷酸酶

核酸酶

核酶

基因工程工具酶12/10/20227

限制性内切酶基因工程工具酶12/10/20227限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。12/10/20228限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割12/10/2限制性内切酶的发现

限制性内切酶的分类

限制性内切酶的命名

限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用第一节限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)12/10/20229限制性内切酶的发现第一节限制性核酸内切酶12/10/20一、限制与修饰

细菌的限制—修饰作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle发现细菌的限制（restriction）现象：E.colikE.coli

B【E.coliB限制

λ（k）】感染不感染1、限制与修饰现象phageλ(K)寄主控制的专一性12/10/202210一、限制与修饰

细菌的限制—修饰作用1952年，Lur噬菌体侵染细菌12/10/202211噬菌体侵染细菌12/10/202211噬菌体侵染细菌

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对λ(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)修饰的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）12/10/202212噬菌体侵染细菌仍有少量phageλ(K)可

细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系统12/10/202213细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。

个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。R-M系统12/10/202214R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌限制性核酸内切酶(restrictionendonuelease)

是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

2、限制性核酸内切酶的发现12/10/202215限制性核酸内切酶(restrictionendonuele

限制性内切酶的发现1968Linn和Arber从

E.coliB中发现限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。12/10/202216

限制性内切酶的发现1968Linn和Arber限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。

限制性内切酶的发现12/10/202217限制性核酸内切酶（限制酶）：

限制性内切酶的发现12/1EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。

限制性核酸内切酶的命名12/10/202218EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株

HindIII

HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶12/10/202219限制性核酸内切酶的命名12/10/202219特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修饰活性双功能单一功能双功能识别与切割位点分别，随机切割，相距较远同一位点相距5-10bp对基因工程中意义无用非常有用意义不大3、限制与修饰系统的种类12/10/202220特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修饰活性双功能单一功能双功能识别与切割二、限制性核酸内切酶识别的序列绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。12/10/202221二、限制性核酸内切酶识别的序列绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。二、限制性核酸内切酶识别的序列12/10/202222在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子限制酶识别序列的长度一般为

4-8个碱基，最常见的为

6个碱基

4个碱基识别位点：Sau3AⅠ↓GATC

5个碱基识别位点：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG1、限制酶识别序列的长度12/10/202223限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为

6个碱基识别位点：

EcoRⅠG↓AATTC

HindⅢ

A↓AGCTT

7个碱基识别位点：

BbvCⅠ

CC↓TCAGC

PpuMⅠ

RG↓GWCCY

8个碱基识别位点：

NotⅠ

GC↓GGCCGC

SfiⅠGGCCNNNN↓NGGCC12/10/202224

6个碱基识别位点：12/10/202224

当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。12/10/202225当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。2、限制酶识别序列的结构12/10/202226II型限制性核酸内切酶的基本特性2、限制酶识别序列的结构识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

ABB’A’

ABB’A’

或或12/10/202227识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用↓或／表示。

3、限制酶切割的位置12/10/202228DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二切割的位点：一般在识别序列内部，如G↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓GG、AGCGC↓T等。

少数在识别序列的两侧，如↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等3、限制酶切割的位置12/10/202229切割的位点：一般在识别序列内部，如G↓GATCC、AT↓CGEcoRⅠ5‘……GAATTC……3’

3’……CTTAAG……5’

不同核酸内切酶的特异识别位点PstⅠ5’……CTGCAG……3’

3’……GACGTC...…5’

3、限制酶切割的位置12/10/202230EcoRⅠ5‘……GAATTC……AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用12/10/202231AAGCTTTTCGAAA三、限制酶产生的末端1、限制酶产生匹配粘端若在对称轴5′侧切割底物，DNA双链交错断开产生5′突出粘性末端。

5′－GAATTC－3′EcoRl5′－G－OHP－AATTC－3′

3‘—CTTAAG－5’3‘—CTTAA－P+OH－G－5'12/10/202232三、限制酶产生的末端1、限制酶产生匹配粘端若在对称轴5

若在3‘-侧切割，则产生3’突出粘性末端，如PstⅠ：5'—CTGCAG－3'Pstl5'—CTGCA-3'5'—G－3'3'－GACGTC-5'3'—G-5'十3'-ACGT－5'12/10/202233若在3‘-侧切割，则产生3’突出粘性末端，如在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端，如

HaeⅢ（GG↓CC）和

EcoRV（GAT↓ATC）。

2、限制酶产生平末端12/10/202234在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端，12/10/20223512/10/202235粘性末端、平整末端200多种限制性内切酶，切点各不相同。12/10/202236粘性末端、平整末端12/10/202236许多限制酶切割DNA产生非对称突出末端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如

BbcⅠ,它的识别切割位点如下：

CC↓TCAGCGGAGTCG3、限制酶产生非对称突出末端12/10/202237许多限制酶切割DNA产生非对称突出末端。3、限制酶产生非

平齐末端（如

SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’

5’粘性末端（如

EcoRⅠ）

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’

3’粘性末端（如Pst

Ⅰ）三种酶切末端12/10/202238

平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）54、同裂酶同裂酶来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。同序同切酶、同序异切酶、同功多位等。12/10/2022394、同裂酶同裂酶12/10/202239同尾酶来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。5、同尾酶12/10/202240同尾酶5、同尾酶12/10/2022405’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡBamHⅠ

BclⅠ

BglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。12/10/2022415’-GGATCC-3’BamHⅠ5’-TGATCA-3’

限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶难以发挥切割活性。四、DNA末端长度对限制酶切割的影响12/10/202242限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的限制性核酸内切酶的活性单位20μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巯基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白)12/10/202243限制性核酸内切酶的活性单位20μLBuff

对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。五、位点偏爱（Sitepreference）

12/10/202244对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称酶切反应系统应组成：

酶、底物和反应缓冲液，并且还需要合适的反应温度。

六、酶切反应条件12/10/202245酶切反应系统应组成：六、酶切反应条件12/10/202245II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20-100mlTT37℃1-1.5hr0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量12/10/202246II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切1、缓冲液常规缓冲液一般包括提供稳定PH的缓冲剂、Mg2+、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)。六、酶切反应条件12/10/2022471、缓冲液六、酶切反应条件12/10/2022472、反应温度

大多数酶的标准反应温度37度。3、反应时间通常是小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶量。4、终止酶切的方法

EDTA可螯合Mg2+，从而可终止酶切反应；加热。12/10/2022482、反应温度12/10/202248限制性内切酶识别特异性放宽

EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性，用

EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。

七、星星活性

（Staractivity

）

12/10/202249限制性内切酶识别特异性放宽七、星星活性（Staract影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。七、星星活性

（Staractivity

）

12/10/202250影响因素：七、星星活性（Staractivity）抑制星星活性的措施：如减少酶的用量（可避免过份酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到100～150mM（如果不会抑制酶的活性的话），降低反应pH至pH7.0，以及保证使用Mg2+作为二价阳离子。12/10/202251抑制星星活性的措施：12/10/202251限制性核酸内切酶反应影响因素：温度、缓冲液、时间、反应体积和甘油浓度、DNA纯度和结构等。八、影响酶活性的因素12/10/202252限制性核酸内切酶反应影响因素：八、影响酶活性的因素12/101、底物DNA

（1）DNA纯度

RNA与E结合影响有效酶浓度；

八、影响酶活性的因素12/10/2022531、底物DNA八、影响酶活性的因素12（1）DNA样品的纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间12/10/202254（1）DNA样品的纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、S（2）DNA浓度

[DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

12/10/202255（2）DNA浓度12/10/202255（3）DNA样品的甲基化程度

大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等。哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。12/10/202256（3）DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam（4）识别位点及邻近位点特异性序列

如：pBR322DNA有4个

NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。

XmaⅢ

切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。12/10/202257（4）识别位点及邻近位点特异性序列12/10/202257（5）DNA二级/三级结构

如：超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需酶多（6）提取时混入杂质可改变识别特异性

如：

高浓度Hg2+、酚、

氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。12/10/202258（5）DNA二级/三级结构12/10/2022582、反应系统因素

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity（星号活性）现象。Example：

EcoRI

在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。12/10/2022592、反应系统因素高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、（1）缓冲液（无菌、无污染）（2）金属离子

如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+

代替Mg2+

（如HindⅢ，EcoRI）则特异性改变。

离子浓度不合适会抑制酶活。12/10/202260（1）缓冲液（无菌、无污染）12/10/202260（3）牛血清蛋白(BSA)BSA是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。12/10/202261（3）牛血清蛋白(BSA)12/10/202261二硫苏糖醇(DTT)或β—巯基乙醇：维持酶活性的稳定。

Tris-HCl或Tris-Ac：维持酶活性适合的PH环境。12/10/202262二硫苏糖醇(DTT)或β—巯基乙醇：12/10/202262重组DNA前的切割

构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交

用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针

亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸内切酶的应用12/10/202263重组DNA前的切割限制性核酸内切酶的应用12/10/202甲基化酶的种类依赖甲基化酶的限制系统甲基化酶对限制性酶的影响第二节甲基化酶

(methylase)12/10/202264第二节甲基化酶(methylase)12/10/2022甲基化酶(methylase)Ⅱ类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。甲基化酶也称修饰酶(modificationenzyme)，用来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶（C）5-氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。

12/10/202265甲基化酶(methylase)Ⅱ类R-M系统由限制性核1、Dam甲基化酶

Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。2、Dcm甲基化酶

Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。一、甲基化酶的种类12/10/2022661、Dam甲基化酶一、甲基化酶的种类12/10/202266

甲基化酶分两类：维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。

用甲基化酶进行甲基化的作用封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。构建新的酶切位点12/10/202267

甲基化酶分两类：12/10/2022671、修饰酶切位点2、产生新的酶切位点3、对基因组作图的影响二、甲基化对限制酶切的影响12/10/2022681、修饰酶切位点二、甲基化对限制酶切的影响12/10/202大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenowDNA聚合酶T４噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶耐热DNA聚合酶第三节DNA聚合酶（DNApolymerase）12/10/202269大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ第三节DNA聚合酶（DNADNA聚合酶

指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’–OH末端聚合DNA链的一类酶。

DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

（DNApolymerase）12/10/202270DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolDNA聚合酶DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ（polⅠ），聚合酶Ⅱ(polⅡ)，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。12/10/202271DNA聚合酶12/10/202271DNA聚合酶Ⅰ和

Ⅲ的比较12/10/202272DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较12/10/202272DNA聚合酶的特点：

①

需模板(DNA或RNA)；

②

需引物；

③

具有三种酶活性，即5′

→3′聚合酶活性；5′

→3′外切酶活性和3′

→5′外切外切酶活性。12/10/202273DNA聚合酶的特点：12/10/202273来源E.coli，由染色体DNA基因编码。商品上用的此酶来源于PhageNM964整合的溶源性

E.coli。结构

单链多肽链，MW=109，000D。一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

（DNApolymerase）12/10/202274来源一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeras大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性交换（置换）反应1、大肠杆菌DNA聚合酶I的活性12/10/202275大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：5‘→3‘的DNA聚合酶CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGGGATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′5′→3′聚合酶活性5′→3′外切酶活性

12/10/202276CCGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCTCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′3′→5′外切酶活性

交换反应如果只有一种dNTP存在，5′→3′外切核酸酶活性将从3′－OH端降解DNA，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。12/10/202277TCGATAGCCE.coliDNApolIMg2+T2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途切口平移（Nicktranslation）法标记DNA制备32P标记的探针

DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。此时，DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’聚合酶活性同时发生。12/10/2022782、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途切口平移（Nicktr5‘3’5‘↓3’

3‘5’

5‘3’5‘↓3’3‘5’

5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未经标记的核苷酸经标记的核苷酸12/10/2022795‘3’5‘↓32P标记的DNA杂交探针的制备5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

********(a)(b)(c)(d)(e)(a)双链的DNA分子。(b)带有3’-OH末端的单链缺口。(c)polⅠ从5‘-P移去一个核苷酸。(d)polⅠ将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸。(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5’-3‘方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链。12/10/20228032P标记的DNA杂交探针的制备5‘3‘5‘3‘5探针（probe）

探针：用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。

标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。

分子杂交：探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecularhybridization）。12/10/202281探针（probe）探针：用来探知被测物存在的小DNA或来源

E.coliDNAPolymeraseⅠ经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970）DNApolⅠ枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶N端(76kd)+C

端（36kd）

Klenow

5′→3′聚合3′→5′外切5′→3′外切二、Klenow

DNA聚合酶无5′→3′外切酶活性12/10/202282来源DNApolⅠ枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶N端(76kdKlenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5′粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列

12/10/202283Klenow酶的基本用途：12/10/2022835‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…5’

KlenowdATPdTTP补平由核酸内切酶产生的5′粘性末端12/10/2022845‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T5‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…5’

Klenowa-32P-pppdAdTTPDNA片段的同位素末端标记Klenow在无底物时只进行3′→5′外切；有底物存在时则聚合。这种标记也称作交换标记，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。12/10/2022855‘…G-C-T-G-OHP-A-A-TT4DNA聚合酶

来源：T4Phage感染的

E.coli

结构：MW=114,000d

活性：

5′→3′聚合活性；

3′→5′外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比Klenow大200倍

用途

填补或标记限制酶切后产生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同Klenow）3′-粘性末端的标记制备DNA探针,同Klenow末端标记。

12/10/202286T4DNA聚合酶

来源：T4Phage感染的E.cT7DNA聚合酶（测序酶）

来源：T7Phage感染的

E.coli

结构：由2个蛋白亚基组成：T7phagegene5蛋白+宿主硫氧蛋白

活性：5′→3′聚合，持续反应时间最长，所以合成的DNA链长。故在DNA测序中很优越。3′→5′外切，是DNA聚合酶Ⅰ的1000倍。12/10/202287T7DNA聚合酶（测序酶）

来源：T7Phage感染用途复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列用填补或交换反应快速进行末端标记。

与T４DNApol一样，平齐粘性末端。定点突变中互补链的合成。5′3′3′5′12/10/202288用途5′3′3′5′12/10/202288修饰的T7DNA聚合酶(测序酶)

来源：

天然T７DNA聚合酶经修饰处理

结构：

同T７聚合酶。

用还原剂、分子氧、低浓度Fe２+与酶保温几天，可使PhageT7gene5蛋白N-端3′→5′外切酶活性中心失活(O-修饰)。

即：5′→3′聚合酶作用提高，持续性长。3′→5′外切作用下降99%以上。12/10/202289修饰的T7DNA聚合酶(测序酶)

来源：12/10/五、TaqDNA

聚合酶(Thermusaqraticus)

来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。

结构：单亚基MW=94,000d。

活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性

。12/10/202290五、TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus

用途：PCR

反应。测序，高温下进行

DNA

合成可减少模板二级结构。12/10/202291

用途：12/10/202291六、反转录酶

(reversetranscriptase)

依赖于RNA的DNA聚合酶来源：商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒

(AMV)。

来自能表达

Moloney

鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的

E.coli。

12/10/202292六、反转录酶

(reversetranscriptase酶类别肽链5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，000β94，000

++++M-MLV84，000++结构和活性：12/10/202293酶类别肽链5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，00活性：六、反转录酶

(reversetranscriptase)

依赖于RNA的DNA聚合酶5‘→3‘的DNA聚合酶活性（需要Mg2+

）5‘→3‘RNA核酸外切酶活性（RNAseH）3‘→5‘RNA核酸外切酶活性（RNAseH）产生含5′磷酸及3′羟基的长4~20个碱基的核苷酸。12/10/202294活性：六、反转录酶

(reversetranscript反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链。反转录酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA12/10/202295反转录酶的基本特性：反转录酶Mg2+dNTP3’AAAA反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。反转录酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反转录酶5’DNA3’12/10/202296反转录酶的基本特性：反转录酶3’RNA5’DNA3’对RNA:DNA

杂交体中的RNA

特异性地降解，免除了在反转录完成后再用

NaOH

降解RNA

模板的步骤。反转录酶用途：12/10/202297对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了七、末端转移酶(terminaltransferase)

(末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）)来自小牛胸腺，只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的

DNA聚合酶

(Chang和Bollum,1986)。来源：MW=60,000d.结构：12/10/202298七、末端转移酶(terminaltransferase)七、末端转移酶(terminaltransferase)

(不依赖模板的DNA聚合酶)催化dNTP掺入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端；反应不需模板

DNA，需Co2+或Mg2+

。活性：12/10/202299七、末端转移酶(terminaltransferase)七、末端转移酶(terminaltransferase)

(不依赖模板的DNA聚合酶)用途：

克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。

末端标记12/10/2022100七、末端转移酶(terminaltransferase)来TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAOH3‘p5‘12/10/2022101来TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNT5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HO

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH

3‘

p5‘

AAAAAAAAA12/10/20221025‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+依赖于DNA的RNA聚合酶连接酶T4多核苷酸激酶咸性磷酸酶第四节其他分子克隆工具酶核酸酶核酸酶抑制剂琼脂糖酶DNA结合蛋白其他酶12/10/2022103依赖于DNA的RNA聚合酶第四节其他分子克隆工具酶核酸酶来源T7、T4噬菌体RNA聚合酶在

E.coli

（或细菌）中的克隆表达。

E.coliRNA聚合酶。SP6噬菌体RNA聚合酶

一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）12/10/2022104来源一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdependen活性在DNA指导下合成RNA，结合于启动子部位，转录无意义链(-)产生与有意义链相似(以U代替模板中T)的链。

转录链为无意义链，负链(-)。

不转录链为有意义链，正链(+)。一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）12/10/2022105活性一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdependen3´

启动子（promoter)

终止子(terminator)模板链（templattestrand）反意义链(antisensestrand)有意义链(sensestrand)非信息区DNA5´5´3´编码链12/10/20221063´启动子（promoter)终止12/10/202210712/10/2022107用途体外合成RNA分子用于表达外源基因（详见表达载体一章）一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）12/10/2022108用途一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdepende二、DNA连接酶（ligase）

DNA连接酶的发现1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。12/10/2022109二、DNA连接酶（ligase）DNA连接酶的发现12/1

DNA连接酶的作用特点：

能够催化DNA中相邻的3’-羟基和5’-磷酸基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键;吸能反应。二、DNA连接酶（ligase）12/10/2022110DNA连接酶的作用特点：二、DNA连接酶（ligase）12/10/202211112/10/2022111二、DNA连接酶（ligase）

种类

T4DNA连接酶

大肠杆菌DNA连接酶

12/10/2022112二、DNA连接酶（ligase）种类12/10/2022二、DNA连接酶（ligase）T4DNA连接酶

可连接带匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。

反应底物为黏端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。反应系统中必须加有辅助因子ATP

12/10/2022113二、DNA连接酶（ligase）T4DNA连接酶12/1AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5´

5´5´5´(1)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5´5´(a)分子间连接(b)分子内连接AATTC······GG······CTTAA5´

5´ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶(2)(1)(2)12/10/2022114AATTC······GG······二、DNA连接酶（ligase）大肠杆菌DNA连接酶

只能连接带匹配粘末端的DNA分子。反应系统中必须含NAD作为辅助因子。12/10/2022115二、DNA连接酶（ligase）大肠杆菌DNA连接酶112/10/202211612/10/2022116

磷酸激酶催化5′-OH加P（标记）

咸性磷酸酶去除5′-P（防止自身环化）

三、T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶12/10/2022117

磷酸激酶催化5′-OH加P（标记）三、T4多核三、T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶（标记）

在分子克隆中呈两种反应，其一是正反应，指将ATP的γ－磷酸基团转移至无磷酸的DNA5´末端，用于对缺乏5´磷酸的DNA进行磷酸化。其二是交换反应，在过量ATP存在的情况下，该酶可将DNA的5´端磷酸转移给ADP，然后DNA从ATP中获得γ－磷酸而重新磷酸化。12/10/2022118三、T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶（标记）1三、T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶碱性磷酸酶（防止自身环化）

来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNAOH3‘

5‘HO5‘pppdN5‘pppNBAP/CIP5‘HOdN5‘HON12/10/2022119三、T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶碱性磷酸酶（防止自身环化）PNKasePMase

5′HOATTAGC………CCGTAATCG………GGCOH5′多核苷酸激酶磷酸甲酯酶Phosphomonoesterase5′pATTAGC………CCGTAATCG………GGCp5′12/10/2022120PNKasePMase5′HOATTAGC五、核酸酶（nuclease）Bal13核酸酶单链内切双链外切的核酸酶来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）从DNA末端同时降解两条链。

用于基因表达调控序列的研究。12/10/2022121五、核酸酶（nuclease）Bal13核酸酶12/10Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+12/10/2022122Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNA五、核酸酶（nuclease）S1核酸酶

降解单链核酸。来自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）

用于把具粘性末端的

DNA

变为平齐末端

的

DNA。

在

DNA

部分变性条件下，能在富含AT

区切断

DNA。12/10/2022123五、核酸酶（nuclease）S1核酸酶12/10/2六、核酶（ribozyme）

具有酶活性的RNA片段。

是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。1981Cech和Altman首次发现，并因此获得1989年的诺贝尔奖。

核酶可以作为RNA的限制性内切酶用于基因操作。12/10/2022124六、核酶（ribozyme）具有酶活性的RNA片段。1（一）思考与探究1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)…CTGCA

(2)…AC

(3)GC…

…G

…TG

CG…（4）…G

(5)

G…

(6)…GC

…CTTAA

ACGTC…

…CG(7)GT…

(8)AATTC…

CA…

G…你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？

12/10/2022125（一）思考与探究1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开答：2和7能连接形成…ACGT…

…TGCA…；4和8能连接形成…GAATTC…

…CTTAAG…；3和6能连接形成…GCGC…

…CGCG…；1和5能连接形成…CTGCAG…

…GACGTC…。12/10/2022126答：12/10/20221262.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。12/10/20221272.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本3.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。12/10/20221283.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？提示：提问与解答环节QuestionsAndAnswers提问与解答环节谢谢聆听·学习就是为了达到一定目的而努力去干,是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折LearningIsToAchieveACertainGoalAndWorkHard,IsAProcessToOvercomeVariousDifficultiesForAGoal谢谢聆听LearningIsToAchieveAC第一篇基因操作原理12/10/2022131第一篇基因操作原理12/10/20221

A.用于核酸操作的工具酶B.用于基因克隆的载体C.用于基因转移的受体菌或细胞用于核酸操作的工具酶有哪些？体外重组DNA技术所需的基本条件？12/10/2022132A.用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶有哪些？第二章分子克隆工具酶12/10/2022133第二章分子克隆工具酶12/10/2022312/10/202213412/10/20224基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

基因工程工具酶12/10/2022135基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性

自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程工具酶12/10/2022136自然界的许多微生物体内存在着一些具有

限制性内切酶

甲基化酶

DNA连接酶

DNA聚合酶

RNA聚合酶

磷酸激酶和磷酸酶

核酸酶

核酶

基因工程工具酶12/10/2022137

限制性内切酶基因工程工具酶12/10/20227限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。12/10/2022138限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割12/10/2限制性内切酶的发现

限制性内切酶的分类

限制性内切酶的命名

限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用第一节限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)12/10/2022139限制性内切酶的发现第一节限制性核酸内切酶12/10/20一、限制与修饰

细菌的限制—修饰作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle发现细菌的限制（restriction）现象：E.colikE.coli

B【E.coliB限制

λ（k）】感染不感染1、限制与修饰现象phageλ(K)寄主控制的专一性12/10/2022140一、限制与修饰

细菌的限制—修饰作用1952年，Lur噬菌体侵染细菌12/10/2022141噬菌体侵染细菌12/10/202211噬菌体侵染细菌

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对λ(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)修饰的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）12/10/2022142噬菌体侵染细菌仍有少量phageλ(K)可

细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系统12/10/2022143细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。

个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。R-M系统12/10/2022144R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌限制性核酸内切酶(restrictionendonuelease)

是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

2、限制性核酸内切酶的发现12/10/2022145限制性核酸内切酶(restrictionendonuele

限制性内切酶的发现1968Linn和Arber从

E.coliB中发现限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。12/10/2022146

限制性内切酶的发现1968Linn和Arber限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。

限制性内切酶的发现12/10/2022147限制性核酸内切酶（限制酶）：

限制性内切酶的发现12/1EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。

限制性核酸内切酶的命名12/10/2022148EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株

HindIII

HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶12/10/2022149限制性核酸内切酶的命名12/10/202219特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修饰活性双功能单一功能双功能识别与切割位点分别，随机切割，相距较远同一位点相距5-10bp对基因工程中意义无用非常有用意义不大3、限制与修饰系统的种类12/10/2022150特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修饰活性双功能单一功能双功能识别与切割二、限制性核酸内切酶识别的序列绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。12/10/2022151二、限制性核酸内切酶识别的序列绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。二、限制性核酸内切酶识别的序列12/10/2022152在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切