药物分离与纯化

4彥奥李考试科目： 天然药物的分离与纯化 考生姓名： 邱诗春 学院： 生物工程学院 专业： 生物学 考生成绩： 任课老师（签名） 考试日期：2011年11月5日午时至时姜黄中天然药物的分离与纯化摘要：姜黄素是姜黄属植物中的主要活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用，有较好的临床应用价值和研发潜力。随着提取分离纯化技术的发展，目前有多种方法从植物中提取并分离姜黄素。本文对近年来研究姜黄素的酶法、渗漉法、水杨酸钠法、超临界CO2萃取法、超声提取法及微波提取法等提取方法；大孔树脂吸附法、聚酰胺吸附法、活性炭色谱法、硅胶柱色谱法、乙酸沉淀法等分离纯化方法进行综述，为进一步开发利用姜黄素提供依据。关键字：姜黄素；提取；分离Abstract:CurcuminisoneofthemajoractiveingredientsinplantsofCurcumaL.andhasmanypharmacologicaleffects,suchas:anti-cancer,anti-oxidant,anti-inflammatory,freeradicalscavenging,andanti-microbialeffectinthecardiovascularsystemanddigestivesystem,andsoon.Ithasbetterclinicalapplicationanddeveloppingpotentialofnewdrug.Withthedevelopmentofextractionandisolationtechnology,therearemanywaystoextractandisolatecurcuminfromplants.Therecentstudiesofcurcuminextractionmethods,i.e.enzymemethod,percolationmethod,sodiumsalicylatemethod,supercriticalCO2,ultrasonicextractionandmicrowaveextraction.Separationmethods,i.e.polyamideadsorption,macroporousresinadsorption,polyamideadsorption,activatedcarbonchromatography,silicagelcolumnchromatographyandacid-precipitationmethodarereviewedtoprovidethebasisevidenceforfurtherutilizationofcurcumin.Keywords：curcumin;extraction;separation姜黄(Curcumalonga)为多年生草本植物，其性味辛、苦、温，入心、肝、脾经，可行气破瘀，通经止痛，并且还有助消化特性，可以作为调味品、天然色素、天然染料，近年来因其具抗肿瘤、抗炎、抗氧化[1,2]等活性而倍受关注．姜黄中的活性成分主要为姜黄色素类及姜黄挥发油类化合物．姜黄色素是以姜黄素为主的一种黄色略带酸性的二苯基庚烃物质的统称，是自然界中极为稀少的二酮类有色物质，主要包括姜黄素（C21H20O6,分子量368，约占70%）、脱甲氧基姜黄素（C20H18O5，分子量338,约占15%）和双脱甲氧基姜黄素（C19H16O4，分子量308，约占10%），及四氢姜黄素、脱甲氧基四氢姜黄素、双脱甲氧基四氢姜黄素．由于姜黄素分子中含有多个双键、酚羟基及羰基等，故其化学反应较强［3］.姜黄色素的热稳定性较好，不受Zn2+、Cu2+等金属离子影响，苯甲酸钠、碳酸钠可使姜黄色素的吸收峰有一定程度的增加，对其稳定性具有保护作用．但遇Fe3+等金属离子可氧化破坏姜黄色素分子中的双键，且可与苯环上的酚羟基作用而变性.研究表明，姜黄素对人畜几乎无毒［4］，其着色力比所有合成色素、天然色素都强.它的着色力是柠檬黄、日落黄的3~4倍，但姜黄色素耐光性较差，见光易分解姜黄为姜科植物姜黄的干燥根茎。姜黄及其种植分布姜科（Zingiberaceae）姜黄属（CurcumaL.）植物约有60余种，分布较广，盛产于东南亚和澳大利亚北部，喜马拉雅海拔4000米的高山亦有分布。我国有16种，主产于四川、广东、广西、云南、福建、贵州、湖南、台湾等地［5］，其中主要有5种：温郁金、姜黄、莪术、桂莪术和川郁金，其根茎作为中药材莪术、郁金或姜黄应用于临床。入药部位郁金多为块根，莪术主要为主根茎，而姜黄主要为侧根茎和块根。均具有破疲、行气、消积和止痛的功效;还有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等活性。姜黄为多年生草本植物，不耐寒，喜冬季温暖、夏季湿润环境，抗旱能力差，生长初期宜半阴，生长旺盛期需充足阳光。土壤宜肥沃，保湿力强。株高可达1米，根茎具多数圆状或指状分枝，形似姜，红黄色，断面鲜黄色。冬季或早春挖取根苹，洗净煮或蒸至透心晒干。姜黄的成分及理化性质根据药典的记载，姜黄的化学成分主要为姜黄色素和姜黄挥发油类化合物，另外还有油树脂、糖类、甾醇类、多肽类、脂肪酸等。姜黄色素是以姜黄素为主的一种黄色略带酸性的二苯基庚烃物质的统称,是大自然中极为稀少的二酮类有色物质。主要包括姜黄素（约占70%）、脱甲氧基姜黄素（约占15%）和双脱甲氧基姜黄素（约占10%）,及四氢姜黄素、脱甲氧基四氢姜黄素、双脱甲氧基四氢姜黄素等。姜黄色素的结晶是橙黄色粉末，有特殊的芳香气味，熔点为179〜182°C,易溶于冰醋酸、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙二醇和碱性溶液，微溶于水。在酸性和中性溶液中显黄色,在pH值大于9的碱性溶液中显红色。姜黄色素的热稳定性较好,不受Zn2+、Cu2+等金属离子影响,苯甲酸钠、碳酸钠可使姜黄色素的吸收峰有一定程度地增加,对其稳定性具有保护作用。但姜黄色素耐光性较差,见光易分解,Fe3+等金属离子可氧化破坏姜黄色素分子中的双键,且可与苯环上的酚羟基作用而使其变性。因此姜黄色素应避免与铁器接触,同时在运输贮存和使用过程中注意避光、避高温。姜黄油主要成分为姜黄酮、去氢姜黄酮、水芹烯、柠檬烯、樟脑、莪术酮、莪术醇、莪术二酮、莪术烯醇、姜黄烯、姜烯及按油精等［6］。经研究发现，挥发油中的活性成分我术醇与羲二酮具有抗癌活性［7］。挥发性成分主要为单菇类及倍半菇类化合物及其衍生物，倍半菇类化合物的百分含量高于单菇类化合物的百分含量［8］。现代药理作用目前世界上许多国家在新药开发方面都希望于天然药物，将其作为药物发现和发展的先导来源［9］，天然植物药己成为世界药物市场上一个重要的组成部分。姜黄的药用研究突破了中医破气、行血、止痛的传统功效，其药用价值进一步拓展到现代医学的各个领域。大量研究证明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基、抗微生物以及保护心脑血管系统、调节消化系统功能等多方面药理作用［10-14］，尤其在抗癌、抗感染和抗病毒等方面，姜黄已经表现出巨大的发展潜力。姜黄素的提取提取姜黄素的方法多种多样，在工艺流程上各有特色，主要有酶法、渗漉法、酸碱提取法、水杨酸钠法、超临界CO2萃取法等。4.1酶法董海丽等［15］应用纤维素酶、果胶酶组成的复合酶将姜黄细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解，引起细胞壁及细胞间质结构发生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，从而提高有效成分提取率；然后升温，用碱水提取姜黄素。该法与传统浸提工艺相比,姜黄素的收率提高了8.1%。实验确定的提取工艺为：酶解温度50°C、pH值4.5、提取时间120min,酶的质量浓度0.35mg/ml。但是在目前情况下，酶的反应条件及碱提取条件控制都制约了本法在生产中的推广应用。4.2渗漉法在常温或中高温条件下，用70%〜80%的乙醇提取姜黄素，采用浸提法、渗漉法等，并可使用超声波、微波、表面活性剂等辅助萃取。尤本明等［16］进行了渗漉法提取姜黄素及正交试验优化大孔树脂分离工艺研究。用9倍体积的70%乙醇，以3ml/min渗漉为最佳提取工艺；利用D-101大孔树脂纯化姜黄素工序中调节液pH值为7.0，用80%乙醇以4ml/min洗脱为最佳分离工艺。渗漉法提取和大孔树脂分离获得姜黄素的工艺简便、实用、经济，适用于小量生产。醇提法提取率较高、工艺简单，反应条件易于控制，容易在生产中推广应用。4.3酸碱法宋长生等［17］利用姜黄素中的酚羟基易溶于碱的原理，用一定浓度的NaOH溶液从姜黄中提取姜黄素，然后用稀盐酸调节pH值，使姜黄素析出，得粗品。并通过正交试验对提取工艺进行了研究，重点考察了投料量、浸取温度、浸取时间、NaOH溶液的质量浓度对姜黄素提取率的影响。最佳工艺条件为：投料量10g、浸取温度20°C、浸取时间28h、NaOH溶液的质量浓度10mg/ml，姜黄素的提取率为3.13%，总姜黄素的质量分数为95.44%。4.4水杨酸钠法刘新桥等［18］用分光光度法，以总姜黄素的量为指标，考察了从姜黄中提纯总姜黄素的3种不同方法。结果水杨酸钠法所得样品中姜黄素的量最高为92.5%，其次为酸碱法74.0%，最低为活性炭法51.2%。酸碱法虽然成本较低，但总姜黄素容易在碱性条件下分解，分解速度从pH值7.45开始随着碱性的增强急剧上升，pH值到10.2时达到最大，故在生产过程中难解决总姜黄素的分解问题。活性炭吸附法提取的总姜黄素的量和转移率都较低，因为活性炭对总姜黄素吸附能力太强不易洗脱。采用水杨酸钠法提取总姜黄素所得产品质量分数最高，为较优纯化方法。水杨酸钠法操作简单，对设备要求不高，水杨酸钠可重复使用，生产成本低廉，而且制备的总姜黄素质量较好，是一种值得推广的方法。4.5超临界CO2萃取法张丽等［19］通过单因素试验和正交试验相结合的方法对超临界CO2流体萃取姜黄中姜黄素的工艺条件进行了研究，并采用高效液相色谱（HPLC）法测定姜黄素的量，筛选出超临界CO2萃取姜黄素的最佳条件为：萃取压力25MPa，萃取温度55C，采用无水乙醇作为夹带剂、用量为35%，萃取时间为5h，CO2流量3.5L/min。该工艺条件稳定可行，适于推广。4.6微波提取法微波萃取的原理就是在微波场中利用不同结构的物质吸收微波能力的差异,使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使被萃取物质更易从基体或体系中分离。从细胞破碎的微观角度看,微波加热导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能产生大量的热量,使胞内温度迅速上升,液态水气化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破,从而使胞外溶剂容易进入细胞内溶解并释放出胞内物质。王平等［20］利用微波萃取技术提取姜黄色素,在溶剂比1：50、温度60°C、萃取时间30min、微波功率200W的条件下，微波萃取工艺的姜黄色素得率优于传统的提取工艺。4.7超声提取法超声提取是一种利用外场介入强化提取过程的技术。与常规溶剂提取法相比,超声提取不需加热,耗时短,提出率高,不影响活性成分的生理活性,适于热敏性物质的提取。秦炜等［21］考察了超声场对姜黄色素提取的影响,研究发现超声场的介入显著缩短了浸提时间,加快了传质速率,提高了姜黄色素的浸出率,同时保证了姜黄色素的稳定性。刘树兴等用95%的食用乙醇作溶剂,超声场辅助提取姜黄色素,试验结果表明:超声场介入的提取工艺的姜黄色素提取率比传统提取工艺提高35%。姜黄素的分离纯化姜黄素粗品中常含有姜黄脂肪油、姜黄树脂等，使其质量分数较低，不易干燥。姜黄素纯度也影响其在食品、医药领域的应用。姜黄素的精制方法有聚酰胺吸附法、大孔树脂吸附法、活性炭色谱法、硅胶柱色谱法、乙酸沉淀法、甲醇-水重结晶法、正丙醇重结晶法等。5.1大孔树脂吸附法根据类似物吸附类似物的原则，一般来说非极性树脂易于从极性溶剂中吸附非极性有机物，强极性树脂易于从非极性溶剂中吸附极性溶质，而中等极性吸附树脂不但能从非水介质中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。彭永芳等［22］采用大孔树脂吸附和分离水溶性姜黄素，比较了5种树脂对姜黄素的吸附情况。结果，选用X-5树脂作吸附剂，洗脱剂用80%乙醇时产品质量好；X-5树脂非常稳定，吸附率为73.59%，使用18次后，其吸附率仅降低3.69%，该工艺对水溶性姜黄素的提取效果较好。5.2聚酰胺吸附法刘硕谦等［23］比较了聚酰胺树脂和5种大孔树脂吸附法制备姜黄素的分离效果。结果显示，当料液比为1：4时，吸附量达到最大值，料液比分别为1：4、1:6对吸附量影响不大，因此在实际操作中应将料液比控制在1：6。实验的各种树脂中，聚酰胺树脂的吸附量最大，达71.60g/L，而大孔树脂NKA-II、S-8、NKA-9、AB-8、D4020的吸附量依次为65.21、56.83、47.25、33.17、21.47g/L，说明大孔树脂对姜黄素的吸附有强的选择性，极性强的树脂对姜黄素的吸附能力强。在考察的5种大孔树脂中AB-8最容易被解吸，其次是NKA-9，解吸率达96.87%。聚酰胺的解吸性能也较好，为93.43%。综合考虑吸附量与解吸率，宜选用聚酰胺树脂为柱色谱填料。5.3活性炭色谱法王贤纯［24］利用75%乙醇从姜黄原料中提取姜黄素，提取率为91.37%，提取液直接流经活性炭柱色谱分离后测得活性炭对姜黄素的吸附容量约为8%，分别利用碱性水、碱性乙醇和碱性丙酮洗脱被吸附的姜黄素，发现碱性丙酮的洗脱效果明显优于其余2种洗脱剂（P<0.01），最终结果显示，姜黄素的收率为2.36%，产品质量分数92.33%，姜黄素总收率79.62%。5.4硅胶柱色谱法王平等［25］利用硅胶的极性吸附原理来分离姜黄素，粗品中的物质由弱到强依次被洗脱下来，用一定比例的二氯甲烷与丙酮的混合液（3：1，9：1，95：5）进行梯度洗脱，发现二氯甲烷-丙酮（95：5）洗脱效果较好，得到姜黄素样品质量分数79.4%。5.5乙酸沉淀法唐课文等［26］利用75%乙醇浸提姜黄得到姜黄素粗提物，然后采用沉淀法对粗提物进一步分离精制得到质量分数较高的姜黄素产品。考察了不同pH值条件下的姜黄素沉淀量，发现pH值为7.0时姜黄素沉淀量最大，产率可达3.3%。5.6甲醇-水重结晶法刘保启等［27］用甲醇-水对姜黄素进行重结晶，与一般重结晶法的不同之处在于热的姜黄素甲醇浓溶液冷却后并没有姜黄素的结晶析出。只有向热的姜黄素甲醇溶液中滴加热蒸馏水到刚出现混浊时，再滴加甲醇使混浊液变清，溶液冷却后才逐渐析出橙黄的细小针状晶体，这种晶体晾干后变为橙色的晶体，即是精制的姜黄素。用HPLC进行定量检测，色谱柱Bondpak-C18（100mmX8mm），流动相为四氢呋喃-冰醋酸（34：66），254nm紫外检测，测得精制姜黄素的质量分数为99.3%。5.7正丙醇重结晶法戴汉松等［28用醇提碱沉法得到的姜黄素粗品4.6g，再用正丙醇重结晶2次，得橙色针状的姜黄素纯品1.05g，HPLC测定显示其质量分数在95%以上，收率约2.1%。6.小结目前有关姜黄色素提取分离纯化、生物活性应用、药理作用等研究报道不断增多．姜黄中有效成分的提取分离纯化和生物活性应用，不仅能够有效利用我国特有而宝贵的姜黄资源，开发出一系列具有医疗和保健作用的药品、食品，而且可以推进我国姜黄产业由资源优势向技术和经济优势的转化，这对加速我国中草药国际化进程，增强我国植物提取物在国际国内市场上的竞争力具有重要的社会效益和经济效益．同时，姜黄生长过程中基本无病虫害发生，同时还可与果树、玉米等间作，获取较高的经济效益．姜黄每年都可采挖，但姜黄根系发达，且在雨季植株就已经覆盖土地，可以改善种植地区的小气候环境，减少水土流失，生态效益好，可获得经济、生态、社会效益三赢，前景广阔．参考文献：AratanechemugeiY，KomiyaiT，MotekiH，eta1．Selectiveinductionofapoptosisbyar-turmeroneisolatedfromturmeric(CurcumalongsL)intwohumanleukemiacelllines，butnotinhumanstomachcancercellline[J．]Intern．J．ofMoLMed．2002，(9)：481—484．SelvamC，JachakSM，ThilagavathiR，eta1．Design，synthesis，biologicalevaluationandmoleculardockingofcurcuminanaloguesasantioxidant，cyclooxygenaseinhibitoryandanti—intlamttsatotyagents[J]．Bioorg，Medic．Chem．Letters，2005，15(3)，525--531．MasudaT．Chemicalstudiesonantioxidantmechanismofeurcuminoid：analysisofradicalreactionproductsfromeurcumin[J].FoodChem.1999,47：71—77.[4]李侠，陈炳卿，宋其林.姜黄素对大鼠肝eycraso系统及谷脱甘肚一S—转移醉活性的影响口].卫生毒理学杂志，1999，11(a)：293-295.⑸肖小河，苏中武，乔传卓，等，姜黄属药用植物研究进展[[J]。中草药，199728(2):114-119:⑹汤敏燕，汪洪武，孙凌峰•中药姜黄挥发油化学成分研究[[J]•江西师范大学学报(自然科学版)，2000,24(3):274-276.中国医学科学院药物研究所编辑.中草药现代研究[M].北京:中国医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992.周欣，李章万，王道平，等•姜科姜黄属植物有效成分的研究[LJI•分析测试学报，2004,23:53-56.魏铎，马双成，金红军，等。天然产物化学研究现状[J].国外医药，植物药；1999,14(3):93狄建彬，顾振纶，赵笑东，等.姜黄素防治大鼠高脂性脂肪肝的研究[J].中草药，2010,41(8):1322-1326.雷宇，李森，林霖，等.活血化瘀类中药逆转多药耐药作用的研究概况[J].药物评价研究，2010,33(2):135-138.狄建彬，顾振纶，赵笑东，等.姜黄素的抗氧化和抗炎作用研究进展[J].中草药，2010,41(5):附18-附21.余美荣，蒋福升，丁