荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160°C以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、 0.2mol/L（pH7.4）磷酸缓冲溶液（PB）试剂为NaHP0・2H0和NaHP0・12H0。TOC\o"1-5"\h\z2 4 2 2 4 2 0.2M的NaHP0溶液：31.2gNaHP0・2H0,加蒸馏水1000mL溶解2 4 2 4 2 0.2M的NaHP0溶液：71.632gNaHP0・12H0加蒸馏水至1000ml溶解2 4 2 4 2——0.2M（pH7.4）磷酸缓冲溶液（PB）:19ml的NaHP0溶液和81ml的NaHP0溶液充分2 4 2 4混合高压灭菌，常温保存。2、 0.03mol/L磷酸盐缓冲溶液（（PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB 0.03MPBS溶液：22.8gNaCl,150ml磷酸缓冲溶液（PB），加蒸馏水至1000ml,混匀 0.02MPBS溶液:取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml 0.01MPBS溶液:取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。3、 4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作） 将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50C， 40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60C 1滴2mol/LNa0H溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。 1/3体积的PBS溶液， 用Hcl将pH调至7.2，定容， 用孔径为0.22um的滤膜过滤，——4C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20C。（加热时温度不宜过高，为60C-65C，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。4、 1mol/L（pH8.0）Tris-HCl缓冲液的配置―-121.1gTris（三羟基氨基甲烷），加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCl―-用1M的HCl或lM的NaOH将pH调至&0,最后加蒸馏水至1000Ml高压灭菌，4C冰箱保存。5、 10%SDS―-10gSDS（十二烷基硫酸钠）于50ml灭菌水中，加水至100ml,分装后室温保存。灭菌，或用滤膜过滤称取SDS时需戴口罩！6、 0.5MEDTA(pH8.0)溶液的配置——186.1g乙二胺四乙酸二钠加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌(最好使用磁力搅拌机) 用NaOH调节溶液的pH至&0,然后定容至1000mL。7、 杂交缓冲液配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：360uL5MNaCl；40uL1MTris—HClxuL100％甲酰胺(见下表)yuL无菌水(见下表)2uL10％SDS0.22um孔径的滤膜过滤，4°C保存。表1配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积甲酰胺浓度(％) 甲酰胺体积x(uL) 无菌水体积y(uL)TOC\o"1-5"\h\z0 0 15985 100 149810 200 139815 300 129820 400 119825 500 109830600998357008984080079845 900 698501000598551100498甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收)不同甲酰胺杂交液的配制甲酰胺浓度(%)5MNaCl溶液(mL)1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)甲酰胺体积x(mL)无菌水体积y(mL)207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、杂交后洗涤液的配置配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下:ZuL5MNaCl1mL1MTris-HCl(pH7.6)无菌水加至50mL50uL10％SDS500卩LEDTA表2 根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCl体积数甲酰胺浓度％ NaCl体积z(uL) NaCl最终浓度(mM)TOC\o"1-5"\h\z0 9000 9005 6400 64010 4600 46015 3280 32820 2250 22525 1590 15945 400 4050280285520020不同甲酰胺对应的洗涤液的配制甲酰胺浓度(%)1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)0.5MEDTA(mL)5MNaCl溶液(mL)尢菌水体积(mL)2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid(DAPI)常备：1mgM-i需要稀释为：1AgM-i灭菌储存在-20°C(用铝箔覆盖管子)DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。三、实验步骤：1、玻片的预处理：玻片预处理1)玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，在实验室可用超声清洗代替刷洗(4~5次每次10min),然后用清水浸泡过夜；2)硅化处理：第二天换用1%的盐酸浸泡24小时,然后用蒸馏水清洗干净后放入高压灭菌锅灭菌，60°C烘干。盖玻片用锡纸包好4°C保存备用。（盖玻片干净即可，不用处理）（2）黏附剂涂片制备载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约lmin，取出用高压灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4°C保存备用2、 荧光探针的选择和标记（见fish探针的选择表）3、 样品的制备与固定（1） 用已灭菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液1mL，加适量灭菌蒸馏水振荡混匀，并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约0.5ml进行后续处理。（2） 将悬浊液混合均匀后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4C固定24小时，（3） 然后置于12000r/min离心5min去除固定剂，将固定样本加入1ml0.0lmol/LPBS以10000r/min的速度离心漂洗两次，弃去上清液。（4） 采用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于20C保存备用4、 样品的预处理（1） 用微型振荡器将样品混合均匀，取10ul样品在载玻片上涂抹20mmX20mm大小（不要太大），37C的烘箱热固定2h,最高温度不超过60C（2） 风干后于50%、80%、95%的乙醇中各脱水3min，自然风干。（脱水：准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中，50用%乙醇淹没载玻片，脱水3min，取岀放入第二、三个瓷盘，然后用0%乙醇脱水，96%乙醇脱水。脱水后的80%、96%乙醇回收。）脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-20C的条件下保存几个月5、 原位杂交探针浓度为50ng/uL，在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压灭菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一定的湿度。用移液枪分别取24uL的杂交液和1UL探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆盖涂片面积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如下。所有有关探针的操作在处理时都应避光处理！探针种类温度（C）时间（h）甲酰胺浓度％备注EUBMIX46520同步染色法AOBMIX46355重复染色法NOBMIX46540重复染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6、 杂交后洗涤从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48C的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，清洗15〜20分钟后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室温下晾干。7、 DAPI染色

每个玻片用lO^LDAPI（用甲醇稀释至l^g/UL）滴加到载玻片样品上，在冰上染色lOmin,用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。8、荧光显微镜观察经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度修饰EUB338DomainBacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizingbacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3CCTGTGCTCCATGCTCCGFITCNitrite-oxidizingbacteria40%cNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGA0Q989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPA0651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：a探针浓度均为50ng/uL；bcNIT3为硝酸菌探针NIT3的竞争探针。AbbreviationmaximumabsorptionMaximumemissionFiltersetFITC（绿色）492nm528nm10(Zeiss)DAPI（蓝色）365nm418nm02(Zeiss)CY3（橙色/红色）554nm570nm15(Zeiss)CY5（红外线检测）650nm667nm26(Zeiss)HEX探针的选用选用EUBMIX（EUB338、EUB338II、EUB338III）来检测活性污泥中的全部的细菌。选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌，选用AOBMIXNOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria,用PAO651来检测优势菌种Rhodocyclus,杂交后用4©,6-diamidino