ELK1结合位点突变的EGR1启动子载体构建和活性测定

ELK1结合位点突变的EGR1启动子载体构建和活性测定梁旭竟、张惠华2,熊毅％陈小佳方L暨南大学附属第一医院感染科2.基因工程药物国家工程研究中心，广东省生物工程药物重点实验室,暨南大学生物工程研究所，广州510632摘要目的构建EGR1启动子片段中ELK1结合位点突变的载体并测定其活性。方法以己构建的人EGR1启动子载体为模板，在引物上引入突变碱基，重叠PCR扩增获得突变启动子序列，T载体亚克隆入pGL3-basic荧光表达载体，获得重组突变载体pGL3-EGRlmt。用Lipofectanune2000^转染293A细胞，化学发光法检测荧光素酶活性。结果经酶切、PCR&测序鉴定显示，成功构建了pGL3-EGRlmt载体，应用双荧光报告系统检测显示转染了重组突变载体的细胞的荧光素酶活性明显低于未突变组，说明ELK1位点突变成功抑制了启动子的活性。结论成功构建了pGL3-EGRlmt载体，为进一步研究EGR1对下游信号通路的影响提供了实验基础。关键词:EGR1启动子；重叠PCR；点突变中图分类号：Q78ConstructionandactivitydeterminationofEGR1promotervectorwithELK1bindingsitemutationLiangXu-Jing\ZhangHui-hua2,XiongYr,ChenXiao-Jia2('DepartmentofInfectiousDiseases,theFiistAffiliatedHospitalofJinanUniversity,

Guangzliou510630：2NationalEngineermgResearchCenterofGeneticMedicine.Guangdong

ProvincialKeyLaboratoiyofBioengineeringMedicine,BioengineeringInstituteof

Jinan,University,Guangzliou510632,China)AbstractObjectiveToconstiuctEGR1promoterreportvectorwithELK!bmdmgsitemutationandevaluateitsactivity.MethodsTheEGR1promotersequencewithELK1bmdmgsitemutationwasobtainedbyoverlapPCRassayusingpomtmutatedpriineis.pGL3-EGRlmtwasobtamedbywliichtlietargetedsequencewassubclonedmtopGL3-basicvectortluoughT-vector.ThentheactivitiesoffluorescenceweredetectedbvchemiluminescencemethodafterthevectorswereJcotransfectedintotlie293AcellswithLipofectanmie2000.ResultsThepGL3-EGRlmtplasnudwasconstmctedsuccessfullybyrestrictionenzymedigestion,PCRandtheanalysisofnucleotidesequence.TheactivitiesoffluorescenceinthegroupofpGL3-EGRlmtwerelowerthanthatofpGL3-EGRlbydoublefluorescentreportersystem,wliichimpliedthatmutationofELK1uiliibitedpromoteractivity.ConclusionThepGL3-EGRlmtplasnudwasconstmctedsuccessfully,wliichprovideanexperimentalbasisfbrfurtherstudyoftheeffectofEGR1ondownstieamsignalingpathways.Keywords:EGR1promoter；oveilappmgPCR:sitemutant'通讯作者：陈小佳电话:(020)85221983,Email:tchenxj@EGR1(earlygrowthresponse1)属于即刻早期基因家族中的一员⑴，位于人类染色体5q31,由533个氨基酸组成的分子量为75kD的蛋白质【习。EGR1在不同细胞类型或刺激卜•，可结合到目的基因DNA上起到激活转录作用，促进细胞的分化、生长、生长抑制和凋亡⑶。有研究报道，EGR1启动子上有多种转录因子结合位点，包括血清反应元件SREs.AP-1结合位点、cAMP调控元件CREs和SP1结合位点等也AhmedPl发现，EGR1作为癌症基因治疗中的应用主要有两个方面：第一，EGR1启动子含有空间和时间表达的信息，可通过离子辐射控制具有凋亡和自杀功能的基因的表达来调控EGR1的表达；第二，EGR1蛋白可■抑制射线诱导的前存活基因(NFkB和bcl-2)和激活前凋亡基因(bax),消除对辐射的抵抗力，从而提高对辐射的敏感程度。ELK1为转录因子，为ETS家族中的重要成员，能与DNA直接结合而起到转录激活作用回。可通过与c-fos启动子的血清应答元件、血清反应因子结合而形成三元复合物从而介导基因表达。其活性受磷酸化与去磷酸化影响，其表达与NIAPK信号通路有关，包括Eikl/2.p3信号途径⑶。根据软件分析和文献报道，在已获得的EGR1启动子(-6697157)中含有3个ELK1结合位点，通过将其中一个结合位点(CCCGCCGGAACAAC)突变，检测下游相关分子的变化，为EGR1在癌症治疗方面的功能和机制研究打下了良好的基础。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂大肠杆菌DH5a、293A细胞为本实验室保存。pGL3-basic载体、pRL-TK载体、内切酶I、HindHRpMD18-T载体均购自Takaia公司，KOD-Neo-Plus高保真酶、LigationHigh购自Toyobo公司，2xLATaqMix、DNAmarker购自广州东盛生物公司，LipofectamineTNI2000转染试剂购自Iiivitrogen,双荧光素酶报告系统购自Promega公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司。1.1.2引物的设计和合成根据UCSC收录的EGR1启动子序列，利用文献报道和软件预测的ELK1结合位点(CGACCCGGAAATGC),用Piuner5.0设计重叠PCR特异性引物。上游引物：5'-ATCGCTCGAGGGGCCCTGGATGACAGCGAT-3'(含有X/?。I酶切位点,划线部分)，上游重叠引物：5'-CCTTATATGGCATTGAAGAGTCGCAGCTGGT-3，，扩增长度为305bp：下游重叠引物：5'-ACCAGCTGCGACTCTTCAATGCCATATAAGG-3',下游引物：5'-ACCCAAGCTTAACACTGAGAAGCGTGCAGGC-3'(含朽HindIII酶切位点，划线部分)，扩增长度为596bp,总长度为846bp°1.2方法1.2.1PCR扩增模板为己构建好的含有EGR1启动子序列(-669〜+157)的pGL3-EGRl载体，由本研究小组构建。PCR反应分为两步，第一步体系为25ul,模板lub1Oxbuffer2.5ul,MgSO41.5ul,dNTP2.5ul,KOD-Neo-Plus0.5ul,上游引物(下游引物)/上游重叠引物(下游重叠引物)分别为0.75ul,3dH=O15.5ul。96°C30s,59°C30s,72°C40s,32循环。扩增产物纯化后，进行第二步。体系为10ul,上、下游纯化产物各0.5ul,2xTaqMix5uL4ul3dH2Oo96°C30s,5TC30s,72°C60s,12循环。反应完成后，各补加2xTaqMix5uLlul3dH2O,上游引物和卜游引物各2uL96'C30s,53.5°C30s,72°C60s,32循环。扩增产物纯化后，根据A-T克隆法，直接跟T载体进行连接。重组质粒转化感受态E.coliDH5a，在LB培养基上选择浅色(接近无色)菌落，液体培养，抽提重组质粒，酶切、PCR验证插入片段的大小，测序。序列正确的重组子抽提质粒，亚克隆到pGL3-basic,酶切、PCR鉴定，获得pGL3-EGRlmto1.2.2脂质体法转染人骨肉瘤细胞对数生长期的293A细胞计数后，按1X"细胞/孔，种于24孔板内，待细胞融合度为60%时，进行质粒转染。以共转染pGL3-EGRl、pRL-TK和pGL3-EGRlmt、pRL-TK为实验组，pGL3、pRL-TK为对照组,按每孔ipgDNA,用川1Lipofectamine™2000介导转染细胞，48h后，收集细胞。1.2.3双荧光素酶报告实验每孔细胞加入150111的PLB,室温轻微振摇30mm,收集细胞裂解液于干净的EP管中；在白色不透光的96孔板中加入50ul的LARII:将细胞裂解液12,000g离心Imin,取上清25ul加入孔中并吹打均匀；用阅读仪测量可见光强度10s（此时所读的光为pGL载体上转录翻译产生的萤火虫荧光素酶所发出的）；继续在孔中加入50ulStop&GioReagent,吹打均匀：用阅读仪测量可见光强度10s（此时所读的光为内参pRL-TK载体上转录翻译出的海肾荧光素酶所发出的）；将所得到的数据，标准化后进行分析。2结果2.1EGR1启动子突变序列的获得以原有的启动子片段为模板，利用含有突变碱基的引物进行重叠PCR,分别为596bp和305bp的扩增片段：将得到的扩增片段作为模板进行PCR,获得全长为846bp的含有突变碱基的启动子片段，经测序鉴定正确（图1A、IB、1C）oM123M:lOObpDNA标准；1:596bp片段;2:305bp片段;3:846bp的含有突变碱基的启动子片段图1AEGR1启动子突变序列的获得GGAAGGATCCCTCGCCTTCACAACCCTTATTTG6^.aGGATCCCCCGCCG6AACAACCCTTATT图1C原始序列图2.2重组突变载体的构建根据A-T克隆法，先把目的片段连接到PMD18-T载体（图2A）,经Xho\>Hind\\\双酶切，亚克隆到pGL3-basic载体（图2B）opGL3-basic载体多克隆位点下游含有萤火虫荧光素能编码区域，荧光素酶表达量的高低间接反映启动子活性。M：DS5000标准；1:pMD18-T-EGRlmt;23:pMD18-T-EGRlmt双酶切、PCR图2ApMD18-T-EGRlmt重组载体的构建M1M212345Ml:XHindIIIDNA标准;M2:DS2000DNA标准；1:pGL3-basic;3:pGL3-EGRlmt;2、4:pGL3、pGL3-EGRlmt双酶切；5:pGL3-EGRlmtPCR图2BpGL3-EGRlmt载体的构建2.3突变启动子活性检测pGL3-basic载体含有荧光素能报告基因，常用来检测基因启动子活性。将PGL3-EGR1和pGL3-EGRlmt分别与内对照载体pRL-TK共转染293A细胞，48h后收集样品检测。EGR1启动子上ELK1结合位点经突变后，其启动子活性明显比原始启动子序列启动子活性低（图3）。图3突变启动子活性检测3讨论EGR1最初是作为调控细胞生长和增殖的因子被发现同，促进细胞从GCVG1期进入G2/M期。高表达的EGR1能稳定染色体和抑制增殖，也可以促进分化和细胞凋亡：并能直接调控一系列的肿瘤抑制因子、转录因子、生长因子及其受体等的表达，形成下游信号网络决定细胞命运站。ELK1为核转录激活因子，ELK1基因编码的蛋白结合细胞核，激活Ras-Raf-MAPK信号通路。通过软件分析和文献报道，结合重叠PCR,对EGR1启动子原序列上含有的ELK1结合位点，如果对其结合位点进行突变，通过双荧光素酶实验证明ELK1结合位点突变后基因启动子活性明显下降，则说明ELK1对EGR1的转录具有调控作用。因此，本文对EGR1启动子相关ELK1位点突变的研究，为下一步对EGR1功能研究提供了实验基础。本研究中主要采用重叠PCR技术来实现目的碱基的突变。重叠PCR技木（OverlapPCR）由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.与目前市面上发传的点突变试剂盒相比，它利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，故能够很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法雅以得到的产物。但是需要注意的是，本技术成功的关键是重叠互补引物的设计，尽管通过引物设计软件的辅助分析，但由于在实际操作中，作为模板的核昔酸序列特性不同，不同的PCR仪器升降温速度，以及PCR反应体系等多种因素对实验的成功都会有影响，因此，需通过具体实验来分析所设计引物的可用性。获得成功的重组报告载体后，本研究还采用了双荧光报告系统（DLR）来验证突变重组载体是否有预期功能。在DLR测试系统中，分别测定细胞裂解液中的荧光虫和海肾荧光素酶活力。在完成萤火虫荧光素酶活力的测定后，萤火虫发光被快速湮灭，并同时激活海肾荧光素酶的发光反应（内对照）。因此，DLR系统整合了两个测试化学，对共表达的两个报告基因作快速的定量，而旦通过内对照，内在的变化因素所削弱的实验准确性，如培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率，因此，目前该系统广泛地应用于启动子活性分析的研究。总而言之，通过本研究，为下一步研究EGR1的功能奠定了良好的工作基础。参考文献YuJ,BaronVMercolaD,etal.Anetworkofp73,p53andEgrlisrequiredfo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