动物养殖饲料蛋白质营养价值的评定

动物养殖饲料蛋白质营养价值的评定蛋白质营养价值的评定是从20世纪初才有所认识，Thomas(1909)提出了蛋白质生物学价值的概念。进入20世纪30年代以后评价饲料营养价值的研究重点转移至维生素、矿物质和氨基酸。20世纪40年代建立了氨基酸的微生物分析法以及50年代的化学分析法。以后，随着化学、生理、生化、微生物的发展，分析过程的改进和其他相关科学的完善，更多地关注营养成分的有效性研究，并推进了饲料营养价值评定的发展和完善。一、粗蛋白动物所需要的氮大部分是用于蛋白质的合成，饲料里的氮也大都以蛋白质的形式存在，因此几乎全球都是以蛋白质来表达动物的氮需要和饲料的氮含量。从化学上讲，饲料中的蛋白质含量是根据多次修正的凯氏定氮法测定的饲料氮计算出来的。用凯氏法测定的氮，除了蛋白质中所含氮外，还包括其它一些含氮化合物所含的氮，如硝酸盐、亚硝酸盐以及一些环状含氮化合物。在根据含氮量计算蛋白质时，有2个假设：所有的饲料氮都是以蛋白质的形式存在，所有的蛋白质均含16%的氮，而实际上这2个假设均不完全成立（表3～4）,因此，这样计算的蛋白质营养上称为“粗蛋白”。二、可消化粗蛋白粗蛋白虽然提供了饲料中的氮含量，但几乎不知它能否被动物利用。饲料蛋白质在变成对动物有用的化合物之前都必须经过消化和降解，使复杂的蛋白质变成简单、可吸收的氨基酸，因此，在很长一段时期内，可消化蛋白质作为评定单胃动物饲料蛋白质营养价值的指标之一。可消化蛋白质可以由消化实验来测定氮的消化率。由于盲肠微生物能利用部分没有被动物消化和吸收的食糜中的氮，而且大肠吸收的氮对动物几乎无营养意义，因此，用回肠末端的氮消化率能更准确地反映饲料的蛋白质营养价值。三、饲料氨基酸含量对单胃动物而言，蛋白质的营养价值因其所构成的氨基酸的种类和结合状态不同而异。特别是必需氨基酸的含量对蛋白质的营养价值影响很大。如果必需氨基酸的含量不能满足家畜的需要，则其蛋白质的营养价值就低。因此饲料氨基酸含量的分析在现代饲料工业中具有十分重要的意义。氨基酸分析的常用方法有以下3种：（一）高效液相色谱（HPLC）法高效液相色谱技术是目前用于氨基酸分析的常用技术。许多学者对柱前、柱后的衍生条件进行了大量研究，并在此基础上建立了不同的分析程序，如柱后邻苯二甲醛（OPA）法、丹磺酸（DNS）法及PITC法。表3～4含氮量转换成粗蛋白的系数（引自McDonaldP.2002,AnimalNutrition,6thedition）饲料蛋白源含氮量（g/kg）转换系数棉籽大豆大麦玉米燕麦小麦鸡蛋肉奶188.7175.1171.5160.0171.5171.5160.0160.0156.85.305.715.836.255.835.836.256.256.38（二）亚二硫基二乙酸（DTDGA）保护法测定半胱氨酸测定蛋白质和多肽中氨基酸的组成，绝大部分均是采用了6mol/LHCl、110℃水解24h传统方法。然而这种传统方法在精确测定蛋白质中的含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）时却遇到了困难，因为含硫氨基酸在酸解的过程中均不同程度地遭到破坏。近十年来，含硫氨基酸越来越受到营养学家(包括人类营养和动物营养)的重视，因此，研究含硫氨基酸分析测定方法的人越来越多。目前，含硫氨基酸的测定方法大致有2类：一类是过甲酸氧化法；另一类是二硫化物类试剂保护法。过甲酸氧化法把胱氨酸和半胱氨酸转化成磺基丙氨酸，虽然测定了半胱氨酸，但过甲酸使甲硫氨酸转化成了砜，酪氨酸也被破坏(Hoogerheideetal.，1992)。Barkolt等（1989）提出用二硫化物类试剂作为保护试剂，如亚二硫基二丙酸、亚二硫基二丁酸等。二硫化合物与半胱氨酸可形成稳定的衍生物，并且仍可与发光衍生试剂反应，供仪器检测。用亚二硫基二乙酸作为保护剂，二乙酸的碳链短，既不影响衍生物的稳定性又可以缩短分析时间。使用氨基酸分析技术的柱前PITC衍生，高效液相色谱分离测定，可以快速、准确的分析半胱氨酸、甲硫氨酸和所有的氨基酸。四、氨基酸的有效性已有多种可测定饲料中氨基酸利用率的方法,通常不采用单一的方法来进行测定。为方便起见将这些方法分为三大类:体外法、间接体内法和直接体内法.（一）体外法此方法的目的是通过对饲料的实验检测来估计动物可利用氨基酸的含量。体外法有3种形式：化学法、酶法和微生物法。1．化学分析法这种方法多用于测定赖氨酸的利用率。前提条件是赖氨酸的胺基必须是游离状态，以确保赖氨酸的生物利用率。最原始的方法是用赖氨酸与1-氟，2，4-二硝基苯（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene，FDNB）反应，这种方法后来得到了改进。也有使用不同试剂的其它方法，如2，4，6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzxenesulfonicacid,TNBS），还有基于染料（如酸性桔12，acidorange12）被蛋白质吸收的简易方法。虽然同一种饲料的许多样品的化学检测方法可能有异，而且可能在质量控制上起作用。然而，并不鼓励直接用动物检测氨基酸利用率与化学方法检测之间的结果比较。Batterham等用化学方法和猪的生长实验对同一饲料的赖氨酸利用率的估计做了一系列的实验，这些实验表明化学估计和用猪做实验得到的数据没有相关性。对谷类饲料中赖氨酸利用率进行的类似比较，也发现化学和生物学估计的结果之间没有相关。用FDNB和TNBS法及鸡生长鉴定法测定了几种鱼粉、肉骨粉、羽毛粉和动物毛粉（hairmeal）中赖氨酸的利用率。鸡生长法结果与FDNB-赖氨酸和TNBS-赖氨酸之间的相关系数分别为0.83和0.90。2.酶法有人建议用模拟肠道内酶消化的体外测试法。有几种酶（包括胃蛋白酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）曾被实验过。一致认为该法最大的弊端是很难确定一种酶或酶复合物真正模拟了体内混合酶的反应，而且这些酶是否对各种饲料都有效也很难确定。体外酶消化的终产物包括氨基酸、不同长度的肽和未被消化的蛋白。3.微生物评定法曾经是饲料中氨基酸含量测定的基本方法，也被用来估测氨基酸利用率。这种方法是基于微生物的生长对所研究的氨基酸有特别需求，用作实验的微生物是细菌（Streptococcuszymogenes）和原生动物(Tetrahymenapyriformis)。由于微生物法测定氨基酸利用率存在许多理论和实际中的困难，至今很少用它。通常体外测定法为加工工艺对氨基酸利用率的影响提供有用的资料，特别是加热过程对赖氨酸的破坏。但是，用体外法测得的数据来作为饲粮配方的依据并没有得到认可。关于体外法的更详细的资料可参考Carpenter(1973)和Sibbald(1987)的综述（二）间接体内法用实验动物测定氨基酸生物利用率很显然比单独在实验室里进行更理想，但是，用动物来直接测定既费时、成本也高，因此设法用间接法来测定氨基酸利用率。有两种这样的方法，一种是用血浆氨基酸浓度来测量，另一种是通过测量氮的消化率来测定。自从Richardson等(1953)和Dentors和Elvehjem（1954）所做的实验以来，就已清楚地知道动物血液中的氨基酸浓度受饲粮水平的影响，而且用血浆中限制性氨基酸的浓度来估计家禽和猪的氨基酸需要已完全得到了应用。有人曾提议用血浆中氨基酸浓度的改变来估计饲料中氨基酸的利用率，不过这种方法没有得到更全面的改进，主要是由于有多种因素在制约着血浆中氨基酸浓度。而且，进行血浆氨基酸浓度分析有许多困难，还有经费问题。如果单个氨基酸的消化率和总的蛋白质消化率之间有密切的相关，那么通过氮的消化率的测量对氨基酸利用率进行预测，为间接体内法提供了方便的途径。在一些实验中，曾报道过某些氨基酸的利用率与氮消化率之间存在一定的相关，但这种方法仍有局限性。（三）直接体内法1．氨基酸消化率许多研究者着力于利用饲料中可消化氨基酸水平来配制饲粮。肠道后段的微生物发酵改变了流入粪中的氨基酸，从而导致氨基酸在肠道的损失（或合成）。这样并不利于动物体内的氨基酸营养作用。因此，通过比较饲粮摄入和粪中排泄来测定消化率不能很可靠地估计饲料中对动物有用的那部分氨基酸。微生物降解说明了有大量的氨基酸从后段损失掉，与粪中消化率相比，回盲段消化率更具营养意义。在大部分实验中，回盲消化率值比粪消化率值低，这说明粪消化率过高地估计了饲料来源的粪中氨基酸值。以饲料摄入和粪尿中排出直接比较测定的消化率受粪尿中内源物质的影响。由于那些具有蛋白质特性的消化酶和脱落到消化道的粘膜上皮细胞，因此，包括氨基酸在内的内源性含氮物质大量存在。为尽可能减少这些内源性排泄物对消化率测定数据的影响，将粪中这部分内源氮扣除掉，所得的消化率叫真消化率。估测内源氨基酸的方法之一就是在动物饲喂无氮饲粮时测定其粪中的氨基酸的损失，但是内源损失受饲粮摄入量和种类的影响。例如，CraigandBroderick(1981)在鼠中发现每消耗1kg干物资，相应的内源氮损失为1.84g。另一种方法就是找出粪氮（氨基酸）损失与蛋白质（或氨基酸）摄入之间的回归关系，这2种方法都不能解析饲粮摄入的蛋白质对分泌到消化道的内源蛋白的影响作用。饲料中的每种氨基酸都有4种可能的值来表示其消化率：即粪和回盲的表观和真消化率。(1)猪回肠氨基酸消化率的测定由于大肠微生物干扰较大，使测定值偏高（约10％），故均采用回肠末端收取食糜的方法测定回肠氨基酸消化率。由于从消化道后段排出的氨基酸对机体没有价值（Rerat,1978），故必须测定来自回肠的氨基酸。这就需要在氨基酸流入结肠时，用外科瘘管来收集所有的消化液或是消化液样品。采用这种方法要在回肠后段安装一个瘘管，另一个瘘管安在回肠末端收集已测量好的回流的消化液样品。使用的瘘管有凹型和T型2种，凹型瘘管能准确测定消化液的流出量，但是，胃肠道的破坏会影响到小肠的功能。使用T型瘘管时，在食糜离开回肠时收集消化液样品，根本不会损坏肠道，然而，T型瘘管需要一个标记来测定流出量。安装瘘管的动物限制在笼子里，一天24h进行收集，从30min到120min不等收集到的消化液样品测出总的排泄量。取完样品后，剩余的从末端瘘管流回猪体内，比较回肠氨基酸流出量和饲粮氨基酸摄入量可计算出表观回肠消化率。这种方法是可行的和有用的，因为它显示出了动物最小的氨基酸净损失量。表观消化率经过内源损失修正后，得到的真消化率结果更准确，改进程度视日粮摄入的氨基酸量而定。但是Buraczeuski和Horaczynski(1983)发现，把蛋白质水平从10%提高到20%对表观回肠消化率无影响。实际上大多数研究已把表观回肠消化率作为饲料氨基酸利用率的指标。Taverner等(1981)测定了谷物中的氨基酸回肠表观和真消化率。就赖氨酸而言，3种小麦样品的表观值从70%到81%，真消化率值从79%到89%，因此用内源氨基酸进行修正很少改变它变化的域值。通过外科手术收集回肠末端食糜的主要方法有：T型管（simpleT-cannulas）、桥式瘘管（Re-entrantcannulas）、回-直肠接合技术(Ileo-rectalanastomosistechnique)、可移动（可操纵）的回盲瘘手术（Steeredileo-caecalvalve）。每种方法的测值并无太大的差异，加上氨基酸分析测定的误差本身较大，所以很难说哪一个方法测值最准确。目前主要是看哪种方法最简便，包括取样程序和对术荷猪的影响。相对说来，回一直肠吻合术还较可取，虽手术麻烦，但粪样（食糜）收集简单，而且可做到样品有代表性。（2）禽类氨基酸消化率的测定禽饲料氨基酸消化率的测定相对较简单，因禽大肠较短，而且主要是盲肠，所以不必安装屡管，安装也困难。为减少盲肠的影响，可切除盲肠。关于切不切除盲肠现有争议，大多数饲料切除盲肠与否对氨基酸消化率无显著影响，只少数饲料，如肉骨粉等切除盲肠氨基酸消化率降低。另一些人认为盲肠在氮代谢中对尿中尿酸的二次利用有重要作用；未经小肠吸收的氨基酸和短肽也可为盲肠微生物充分利用，因此不宜切除。氨基酸分析仪的测定值误差较大，必然会影响到饲料氨基酸的消化率测值的准确性，一次试验测得的值很难说准确、可靠，一般取平均值较合理。2.氨基酸真消化率测定前面所述方法测定的饲料氨基酸消化率都是指表观消化率。收集的回肠末端食糜或粪样中的氨基酸实际上包括了2个部分，即饲料中未被消化吸收的残余和整个消化道的分泌物、细胞脱落物等内源性的氨基酸等。因此，为了准确测定饲料氨基酸的真消化率，就必须正确评估动物的内源性氨基酸排泄量。评价方法主要有：（1）无氮日粮法和回归外推法测定饲料氨基酸真消化率的最为经典的方法是Mitchell(1924)建立的无蛋白质(氮)日粮法(protein-freediet)。其假定条件是动物采食不含任何蛋白质的饲粮后，进入食糜或粪中的蛋白质、氨基酸即为内源性的，并且在不同饲粮条件下动物内源性氨基酸的排泄量和氨基酸组成是相同或相似的。然而事实上并非如此，随着动物采食蛋白质量的增加，其内源性氨基酸的排泄亦相应增加。Low(1979)指出，动物在采食无氮饲粮后，改变了动物的代谢而影响内源性氨基酸的排泄量。Ozimek等(1985)发现动物采食无氮饲粮后，胰腺分泌的消化酶减少，分泌的蛋白质量亦减少。由于无氮饲粮影响动物消化道的分泌和吸收功能，一般认为无氮饲粮法低估了猪的内源性氨基酸排泄量，即高估了饲料的氨基酸真消化率。为了克服无氮日粮法的上述缺陷，Carlson等(1970)发明了一种回归外推法，用以估测内源性氨基酸排泄量。其方法要点是给猪饲喂不同蛋白质水平的饲粮，分别测定粪或食糜中的氨基酸量，然后用数理统计的方法，推算出饲粮蛋白质水平为零时粪或食糜中的氨基酸即为内源性氨基酸。该方法虽然考虑了饲粮蛋白质含量对内源性氨基酸排泄的影响，但与无氮饲粮法一样，在计算饲料氨基酸真消化率时，仍然存在不同的饲料都扣除同样量内源性氨基酸的问题。另外，Souffrant(1991)经过研究发现，蛋白质采食量与内源性氨基酸排泄之间并不存在线性关系，因此，本方法也难以对内源性氨基酸排泄作准确估测。（2）酶解酪蛋白／超滤法Moughan等(1990)针对上述问题，提出了一种酶解酪蛋白／超滤的新方法来估测动物的内源性氨基酸排泄。其技术原理和过程如下：给动物饲喂含酶解酪蛋白(分子量低于8.25×10-21g)的半纯合饲粮，然后收集回肠末端食糜，立即通过离心和超滤等方法，将食糜中的大分子蛋白质(分子量大于1.65×10-20g)与小分子蛋白质(分子量小于1.65×l0-20g)迅速分离开来，大分子量蛋白质即为内源性的，而小分子量蛋白质是饲粮中未被吸收的部分。当然内源性蛋白质也有可能被水解为小分子蛋白质，但所占比例很小，可以忽略不计。Butts等(1991)将该方法应用于生长大鼠的内源性氨基酸排泄的测定，其测定值高于无氮日粮法，而与15N同位素标记法的结果相当。说明该方法在评估动物内源性氨基酸排泄上有相当的准确性。Yin和Mccracken(1996)认为，尽管此方法还未见有直接测定猪内源性氨基酸排泄的报道，但仍不失一种较为有应用价值的试验方法。（3）15N同位素标记法目前认为15N同位素标记技术是直接测定内源性氨基酸排泄最有效方法，而且可用于测定饲粮成分变化对内源性氨基酸排泄的影响。15N同位素标记技术方法可通过2种途径进行，一是对饲料蛋白质进行标记；二是对动物的氨基酸库即内源性氨基酸进行标记。15N同位素标记的饲料非常昂贵而且不易得到，因而限制了该技术的广泛应用。这样，大多利用各种不同的15N同位素标记动物的氨基酸库，即使用15N同位素进行连续的静脉灌注(或称稀释)，粪中或食糜中内源性氨基酸可以通过同位素的稀释方法来计算。在应用15N同位素稀释技术时，有3个必须解决的现实问题：一是被标记的含氮物的选择；二是15N丰度稳态的判断；三是前体库的选择。最好选择15N同位素标记的各种氨基酸的混合物作为标记。但由于价格昂贵，实际应用中仍然只选择一种氨基酸进行标记。作为标记物的氨基酸要具有以下的特点：①可以发生转氨基作用，使标记的同位素转移到其它氨基酸中去；②被标记处理后不影响采食量；③被标记后不影响氨基酸代谢，不会导致氨基酸的不平衡。Grala等(1998)经过研究发现，唯有亮氨酸完全符合上述条件。因此,15N标记亮氨酸被普遍选作测定内源性氨基酸的标记物。其灌注剂量一般为4.0～40.0mg／kg.d，灌注时间8～9d以上。在运用15N同位素稀释技术时，采样时15N的丰度应当达到一个稳定状态。回肠末端食糜中内源性氨基酸中15N的丰度与血清三氯乙酸(TCA)可溶部分中的15N丰度是相似的。但是血清总氮TCA可溶部分中15N丰度存在昼夜变化。而Schulze(1994)指出，15N灌注5～8d后，并在2次饲喂的中间采血，15N丰度的稳定状态基本可以达到。内源性氨基酸的前体库包括所有代谢组织，而且主要是全身肌肉组织。因此必须选择一个与15N的亲和力相似的参照物，来代替前体组织的15N丰度。而这种参照物中15N丰度也可代表回肠末端食糜中内源性氨基酸的15N丰度。血清往往是最理想的参照物。（4）高精氨酸法如前所述，15N同位素标记技术是对内源性氮前体库进行标记的，以此为基础区分回肠食糜中内源性氮与饲料中氮。Souffrant(1991)、Schultz等(1991)和Nyachoti等(1997)提出了用高精氨酸标记饲粮蛋白质中赖氨酸的方法，测定内源性氮的排泄。其工作原理是：在一定条件下将饲料蛋白质中的赖氨酸与甲基异脲(methylisourea)反应，生成高精氨酸，当高精氨酸被吸收后，在肝脏精氨酸酶的作用下，又可很快转变为赖氨酸，同时释放出尿素。高精氨酸不构成内源性氮，所以消化道脱离细胞以及分泌的消化液中不含高精氨酸，回肠食糜中高精氨酸即为饲料中未被消化吸收的外源蛋白质。动物对胍基化饲粮蛋白质和天然蛋白质具有相同的蛋白酶分解和吸收能力。Souffrant(1991)的研究表明，猪对高精氨酸标记过的酪蛋白和大豆分离蛋白的回肠吸收率高达97％，且只有微量(小于0.2％)的高精氨酸由血液进入肠腔。Schulze等(1994)指出，高精氨酸法必须使经胍基化的高精氨酸在待测饲料蛋白质中均匀分布，才能有代表性，否则影响测定结果。如果饲料蛋白质中的赖氨酸侧链被封闭，特别是经美拉德反应(Maillardreaction)后封闭时，赖氨酸侧链就不能与甲基异脲反应而转化成高精氨酸。这样受热损害的饲料蛋白质经胍基化后代表性差，从而导致对内源性氮估测误差。3、氨基酸消化率体外测定技术如前所述，饲料的蛋白质和氨基酸消化率是评价单胃动物饲料营养价值最为重要的指标之一。人们已普遍接受了采用氨基酸回肠末端表观或真消化率来评价猪饲料的营养价值和衡量动物的营养需要。然而测定这些指标，很大程度上要依赖荷术的试验动物，这样测定的结果虽然直观、可靠，但是十分繁琐并耗资旷时。因此，寻求一种体外试验方法来估测蛋白质和氨基酸消化率，以此评价饲料的营养价值就显得十分必要。体外消化试验一般是尽可能地模拟动物消化道环境条件来进行。但是，消化道中的酶是一个复杂多变的多酶系统，因此一般情况下酶的活力受各种因素的影响较大。如喂给低蛋白高能量饲粮猪的小肠液中胰蛋白酶及胰糜蛋白酶活力分别为77.2±27.1和5.1±1.9酶活单位／mL，而喂给高蛋白低能量的却分别为59.4±20.2和6.5±1.9酶活单位／mL。因此，不同的体外试验方法都是在相应的严格控制条件下对体内消化代谢过程进行模拟而获得的。(1)两阶段水解法丹麦Boisen等(1994)和法国Jaguelin等(1994)提出了先用pH值2.0的胃蛋白酶处理，再用胰蛋白酶处理，结束后用5m120％的磺基水杨酸沉淀未被消化的蛋白质，经过滤后，由样品和未消化残渣含量计算出粗蛋白和氨基酸的体外消化率。虽然测得的结果变异系数（CV=3.8）很低，但体外法和体内法测得的结果相关性不强（r2=0.57）。这一方法尽管可以克服采用小肠液酶活不稳定的缺陷，但反应过程仍然是在封闭容器中进行的。(2)活动尼龙袋法Sauer等(1989)发明了一种用半离体的活动尼龙袋法测定了一些饲料的能量和粗蛋白消化率的方法。其过程是：被测样品1g左右置于120目的小尼龙袋中，经过酸性胃蛋白酶处理4h后从十二指肠瘘管进入试验猪的消化道，然后从粪中收集尼龙袋，这样小肠液中消化酶进入尼龙袋而被消化的氨基酸游离出尼龙袋，并且消化环境完全与体内条件一致,因此测定结果可以与粪分析法结果建立比较好的回归关系。Yin等(1995)改进为试验动物在安装十二指肠瘘管的同时进行回直肠吻合，这样测定结果可与回肠末端消化率建立更好的回归关系。但是这种半离体方法仍然需要荷术动物，并非真正的离体测试方法。另外该方法因为尼龙袋在动物消化道内的滞留时间差异较大，且难以调控，往往导致实验的重复性较差。（3）体外透析管法黄瑞林等(1999)指出，在体外试验的条件选择上不应该刻意追求与体内环境的一致性，而应更注重提高体外试验法的精确度和可重复性。根据仿生学原理，在实验室条件下，样品先经过胃蛋白酶水解，经中和后转移至透析管装置内，用胰蛋白酶水解，透析管的透析液可使水解产物及时透析至管外，最后定量测定透析液粗蛋白和氨基酸的含量，即可计算样品粗蛋白质和氨基酸的消失率。其适宜条件是：温度为35℃，1g(精确至0.0001g)样品，胃蛋白酶浓度为0.001g／mL，pH值为2.0，水解4h；经中和后，转移至透析管内，用pH值7.6且浓度为0.0025g／mL的胰蛋白酶水解24h，透析管外以300mL透析液使水解产物及时透析至管外。黄瑞林等(2000)进一步研究表明，可以用透析管体外法的测定结果来较准确地预测饲料蛋白质和大部分氨基酸的回肠末端消化率。透析管体外法的优点在于：每一测定结果的变异较小，变异系数大都在1％～3％之间，符合一般分析要求。并且在可操作性、重复性和精确度方面优于其它体外方法，与回肠末端消化率结果之间的相关性很好，因此其回归模型可靠。五、单胃动物的饲料蛋白质质量评定用可消化蛋白质有时仍不能全面评价一种蛋白质对动物的营养价值，因为吸收的蛋白质的利用效率有很大的差异，以下是几个常用的评价指标。（一）蛋白质效率比（proteinefficiencyratio,PER）蛋白质效率比就是单位重量的蛋白质消耗所产生的体增重。常用小白鼠作为实验动物。PER=（3～18）（二）净蛋白沉积（netproteinretention,NPE）用蛋白质效率比来评价时，有时会因为内源氮的不同而影响评定结果，因而采用一组饲喂无氮饲粮的动物来消除差异。相应的计算公式为：NPR＝(3～19)（三）总蛋白值(grossproteinvalue,GPV)用鸡作为实验动物。共用3组实验鸡，分别饲喂含蛋白质80g/kg的基础饲粮；基础饲粮加30g/kg的测试蛋白质；以及基础饲粮加30g/kg的酪蛋白，然后比较3组动物的体增重。单位重量的补充测试蛋白质所导致的额外体增重占单位重量的补充酪蛋白所导致的额外体增重的百分比。用公式表示为：GPV=(3～20)公式中A代表每克测试蛋白质所增加的体增重；Å代表每克酪蛋白所增加的体增重。（四）生物学价值(biologicalvalue,BV)这是直接衡量饲料蛋白质能够用于合成体组织和体成分的比例。可以定义为吸收氮沉积在体内的百分比。进行一次氮平衡试验，测定尿氮(Un)和粪氮(Fn)，同时测定内源尿氮(EUN)和代谢性粪氮(MFN)，就可以计算出生物学价值。内源尿氮是指经尿排泄的动物体内分泌蛋白和结构蛋白不可避免的降解和替代所产生的氮。代谢性粪氮是指从粪排泄的非饲料来源的物质所含氮，如唾液、胆汁、胃和胰的分泌物、肠道粘膜脱落的细胞等。BV=(3～21)（五）化学比分和必需氨基酸指数测定了饲料氨基酸含量以后，我们可以比较不同蛋白质饲料的品质，如了解蛋白质饲料的第一限制性氨基酸等。通常比较不同蛋白质饲料的品质可以计算其化学比分（chemicalscore）和必需氨基酸指数（essentialaminoacidindex）。前者把全卵粉的蛋白质认为是最理想的蛋白源，以其必需氨基酸组成为基准，计算出各种饲料蛋白质的各个必需氨基酸的比率，得出比例的最小值，就把这个比率称为化学比分。例如玉米的最小比率是赖氨酸，只有33%，故玉米的化学比分就是33。必需氨基酸指数也和化学比分一样，以全卵蛋白质的氨基酸为基准，全面考虑各种必需氨基酸的比率来评定蛋白质的营养价值。即以全卵蛋白质的必需氨基酸含量为100,依此求出供试蛋白质的必需氨基酸含量的比率，比率在100以上的一概以100计算，由这些比率的积，用下式求出必需氨基酸指数。EAA-Index=(3-22)六、反刍动物的饲料蛋白质评定体系在过去很长一段时期，反刍动物的饲料蛋白质评定常用粗蛋白质或可消化粗蛋白质为主要指标。由于粗蛋白质含有不同数量的非蛋白氮，故也曾经使用真蛋白，但这样就完全忽视了非蛋白氮的营养作用。可消化蛋白质曾广泛用于评价反刍动物的蛋白质营养价值，但目前基本上不用，其原因主要是瘤胃微生物的蛋白质降解和合成作用。瘤胃微生物负责寄主动物的能量供应，主要通过将饲粮碳水化合物转换成乙酸、丙酸和丁酸。为了完成这一使命，微生物必须生长和繁殖，这就必然有大量的微生物蛋白质合成。而这些蛋白质合成的氮来源主要是来自饲料蛋白质降解后生成的氨基酸、多肽和氨。作用于饲粮结构性碳水化合物的细菌只利用氨，而作用于非结构性碳水化合物的细菌，其氮来源65%是氨基酸和多肽，其余35%是氨。近年来评价反刍动物饲料蛋白质营养价值常用的指标有饲粮氮的降解率和可代谢蛋白质等。（一）饲粮氮的降解率饲粮氮可以根据其在瘤胃的可降解性分为快速可降解部分、可降解部分和不可降解部分（表3-6）。1.降解率的体内测定需测定饲粮摄入氮(FIN)、内源氮（EN）、通过十二指肠的来源于饲粮的非氨态氮（NAN）和微生物氮（MIN）。这样饲粮氮的降解率（Dy）可以用下面的公式表示：Dy＝１－(3～23)表3-6瘤胃降解和小肠消化的日粮氮组分（资料来源：ChalupaandGarnsworthy,1994,Recentadvancesinanimalnutrition）组分主要化合物瘤胃降解肠道消化率（%）A氨、硝酸盐、氨基酸、肽持续不断不会到达肠道B1球蛋白、某些清蛋白200～300100B2大多数清蛋白、面筋蛋白5～15100B3细胞壁蛋白、变性蛋白、醇溶谷蛋白0.1～1.5—C美拉德反应产物、与木质素连接的氮、单宁结合蛋白00这一方法需准确测定十二指肠的食糜流量、微生物氮和内源氮，这些参数的测定需使用双指示剂和同位素标记技术，会使测定结果有较大误差。内源氮随动物种类和饲养水平不同有一定差异，约占50～150g/kg，常用150g/kg作为估计值。尽管这一方法不十分准确，但是目前测定氮降解率绝对值的唯一可用的方法，且用作检验其他测定方法准确性的标准。2.瘤胃尼龙袋法测定氮降解率将饲料装入一个人造纤维袋，然后将袋悬于瘤胃内。经过一定时间后，比较放入瘤胃前后的氮含量变化。降解率（%）＝×100(3～24)由于纤维袋中的蛋白质消失率与时间相关，并随时间的延长而增加，但随着时间的延长，增加的幅度变小。因此存在如下关系式：氮消失率=a+b×（1-）（3～25）式中:a代表时间为零时的消失率，即水溶性蛋白部分，b代表缓慢降解的氮部分，c代表有潜力降解的b的消失率。根据上述关系，有效的氮降解率可以表示为：P=a+(3～26)公式中r为食糜从瘤胃到真胃的通过速率。从理论上讲，随着时间的延长，瘤胃内剩余的氮会降为零，降解的氮也会为零，因此，有效的氮降解率可以简化为：P=a+(3～27)公式中a代表快速可降解氮，bc÷(c+r)为缓慢降解部分。该测定方法也有许多导致分析误差的因素，如样品大小、纤维袋大小、纤维材料的多孔性、袋从瘤胃取出以后的处理等。ARC（1992）提出了该测定方法的技术规程。这一方法假设纤维袋中的氮消失率能够反映饲料氮在瘤胃液中的溶解性，即降解率。但事实上，有