LC基本原理课件

第六章

高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法的特点及基本原理CharacteristicandbasicprincipleofLC二、液相色谱的固定相与流动相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC三、分离类型选择choiceofseparatingtypes第一节

主要分离类型与原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2022/12/10第六章

高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法的特点及基本原理1概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法(HPLC)，是20世纪60年代末发展起来的一项新颖快速的分离分析色谱技术。它是在经典的液体柱色谱法的基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术。2022/12/10概述以高压液体为流动相的液相色谱分析2一、高效液相色谱法的特点及基本原理

CharacteristicandbasicprincipleofLC

（一）特点：高选择性－能同时分离性质极为相似的混合物高效能－在较短的时间内能同时分离极为复杂的混合物，一般一次色谱分析时间为几分钟到几十分钟，有些快速分析一秒钟可分析7个组分。高灵敏度－使用高灵敏度检测器可检测10-11~10-13g的物质，色谱不仅可以作常量分析，也可以作微量和痕量分析。高压高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。2022/12/10一、高效液相色谱法的特点及基本原理

Characterist3液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后不稳定的有机物，而且比气相色谱流动相的选择余地大。由于HPLC的具有色谱柱可以反复使用，流动相可选择范围宽，流出组分容易收集，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化，适用范围广(样品不需气化，只需制成溶液即可)，定量分析方法的准确度高的特点，在《中国药典》中该法已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。它与气相色谱法配合使用，几乎可以承担绝大部分的有机物分离测试任务。不足之处是定性能力较差。2022/12/10液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后4液相色谱几个名称

高速液相色谱(HighSpeedLiquidChromatography)高效率液相色谱(HighEfficiencyLiquidChromatography)高压液相色谱(HighPressureLiquidChromatography)高效(能)液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography)2022/12/10液相色谱几个名称

高速液相色谱(HighSpeedLi5GC：在不衍生情况下，GC分析样品的分子量<500；

GC的样品必须是挥发性的；

GC的样品必须具有良好的热稳定性。LC：从理论上讲，LC分析样品的分子量没有限制；

LC的样品必须可溶解；由于LC的分析温度可以从低于室温到100℃－140℃，所以对样品热稳定性没有要求。

（二）GC与LC的区别

2022/12/10GC：在不衍生情况下，GC分析样品的分子量<500；（二）6高效液相色谱组成2022/12/10高效液相色谱组成2022/12/107相关名词色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。峰高：从峰的最大值到峰底的距离。峰宽：在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离。半峰宽：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。脱尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰。鬼峰：并非样品所产生的峰。基线：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器时所产生的响应信号曲线。基线漂移：基线随时间定向的缓慢的变化。基线噪音：由各种因素引起的基线波动。2022/12/10相关名词色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响8谱带扩张：由于纵向扩散、传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。峰容量：在给定的色谱条件下（柱系统，柱温，流动相线速度），在一定时间内最多能从色谱柱流出满足分离度要求的等高度色谱峰个数。固定相：色谱柱内的填充物。相对流动相而言，固定相在分析中是静止的。流动相：又称溶剂或洗脱液。与此相应的被分离的物质称之为溶质或洗脱物。正相色谱：与流动相的极性，固定相极性比流动相大。反相色谱：流动相极性大于固定相。梯度洗脱：流动相的组成在整个分析过程中随时间变化而变化。2022/12/10谱带扩张：由于纵向扩散、传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱9（三）主要分离类型及基本原理

1液-固吸附色谱固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。2022/12/10（三）主要分离类型及基本原理1液-固吸附色102液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反。。2022/12/102液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；2011①正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正己烷、环己烷)，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)，极性小的组分先洗出2022/12/10①正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈12②反相色谱法一般用非极性固定相(如C18、C8)。流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物，极性大的组分先洗出。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程中的解离，常用缓冲液控制流动相的pH。但需要注意的是，C18和C8使用的pH通常为2.5～7.5(2～8)，太高的pH会使硅胶溶解，太低的pH会使键合的烷基脱落。2022/12/10②反相色谱法一般用非极性固定相(如13固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。2022/12/10固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；2022/12143离子交换色谱

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2022/12/103离子交换色谱固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换15

4离子色谱

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。5离子对色谱原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵作对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。2022/12/104离子色谱

离子色谱是在20世纪70年代中期16

6排阻色谱固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。7亲和色谱(AC)原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2022/12/106排阻色谱2022/12/1017（一）液相色谱固定相

1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低；二、液相色谱的固定相与流动相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC2022/12/10（一）液相色谱固定相（2）表面多孔型担体（薄壳型微18（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2022/12/10（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用19化学键合固定相的特点1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；2.液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm。2022/12/10化学键合固定相的特点2022/12/10203.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂：薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相：薄壳键合型；微粒硅胶键合型。树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）

2022/12/103.离子交换色谱分离固定相2022/12/10214.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶：苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2022/12/104.空间排阻分离固定相2022/12/1022（二）液相色谱的流动相1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2022/12/10（二）液相色谱的流动相1.流动相特性2022/12/10232.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022/12/102.流动相类别2022/12/10243.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2022/12/103.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。254.选择流动相时应注意的几个问题

（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2022/12/104.选择流动相时应注意的几个问题

（1）尽量使用高纯度试剂26三、分离类型选择

choiceofseparatingtypes

2022/12/10三、分离类型选择

choiceofseparating27四、影响分离的因素

1.影响分离的因素与提高柱效的途径

在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：

H=A+Cu

故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。

液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2022/12/10四、影响分离的因素

1.影响分离的因素与提高柱效的途径28

2.流速

流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。

3.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2022/12/102.流速流速大于0.5cm/s时,294.液相制备色谱

获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15～30cm），一次制备量０.1～１mg；色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；

对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；

超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。

超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2022/12/104.液相制备色谱获得高纯物质（色谱纯）的有效方30液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：

（1）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。

2022/12/10液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：2022/1231

应用实例：

环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37～50m)

流动相：正己烷流速：1.5mL/min

色谱柱：50cm2.5mm(内径)

检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2022/12/10

应用实例：

环境中有机氯农药残留量分析可对水果32稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器2022/12/10稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八33第六章

高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法的特点及基本原理CharacteristicandbasicprincipleofLC二、液相色谱的固定相与流动相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC三、分离类型选择choiceofseparatingtypes第一节

主要分离类型与原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2022/12/10第六章

高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法的特点及基本原理34概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法(HPLC)，是20世纪60年代末发展起来的一项新颖快速的分离分析色谱技术。它是在经典的液体柱色谱法的基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术。2022/12/10概述以高压液体为流动相的液相色谱分析35一、高效液相色谱法的特点及基本原理

CharacteristicandbasicprincipleofLC

（一）特点：高选择性－能同时分离性质极为相似的混合物高效能－在较短的时间内能同时分离极为复杂的混合物，一般一次色谱分析时间为几分钟到几十分钟，有些快速分析一秒钟可分析7个组分。高灵敏度－使用高灵敏度检测器可检测10-11~10-13g的物质，色谱不仅可以作常量分析，也可以作微量和痕量分析。高压高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。2022/12/10一、高效液相色谱法的特点及基本原理

Characterist36液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后不稳定的有机物，而且比气相色谱流动相的选择余地大。由于HPLC的具有色谱柱可以反复使用，流动相可选择范围宽，流出组分容易收集，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化，适用范围广(样品不需气化，只需制成溶液即可)，定量分析方法的准确度高的特点，在《中国药典》中该法已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。它与气相色谱法配合使用，几乎可以承担绝大部分的有机物分离测试任务。不足之处是定性能力较差。2022/12/10液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后37液相色谱几个名称

高速液相色谱(HighSpeedLiquidChromatography)高效率液相色谱(HighEfficiencyLiquidChromatography)高压液相色谱(HighPressureLiquidChromatography)高效(能)液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography)2022/12/10液相色谱几个名称

高速液相色谱(HighSpeedLi38GC：在不衍生情况下，GC分析样品的分子量<500；

GC的样品必须是挥发性的；

GC的样品必须具有良好的热稳定性。LC：从理论上讲，LC分析样品的分子量没有限制；

LC的样品必须可溶解；由于LC的分析温度可以从低于室温到100℃－140℃，所以对样品热稳定性没有要求。

（二）GC与LC的区别

2022/12/10GC：在不衍生情况下，GC分析样品的分子量<500；（二）39高效液相色谱组成2022/12/10高效液相色谱组成2022/12/1040相关名词色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。峰高：从峰的最大值到峰底的距离。峰宽：在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离。半峰宽：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。脱尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰。鬼峰：并非样品所产生的峰。基线：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器时所产生的响应信号曲线。基线漂移：基线随时间定向的缓慢的变化。基线噪音：由各种因素引起的基线波动。2022/12/10相关名词色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响41谱带扩张：由于纵向扩散、传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。峰容量：在给定的色谱条件下（柱系统，柱温，流动相线速度），在一定时间内最多能从色谱柱流出满足分离度要求的等高度色谱峰个数。固定相：色谱柱内的填充物。相对流动相而言，固定相在分析中是静止的。流动相：又称溶剂或洗脱液。与此相应的被分离的物质称之为溶质或洗脱物。正相色谱：与流动相的极性，固定相极性比流动相大。反相色谱：流动相极性大于固定相。梯度洗脱：流动相的组成在整个分析过程中随时间变化而变化。2022/12/10谱带扩张：由于纵向扩散、传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱42（三）主要分离类型及基本原理

1液-固吸附色谱固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。2022/12/10（三）主要分离类型及基本原理1液-固吸附色432液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反。。2022/12/102液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；2044①正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正己烷、环己烷)，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)，极性小的组分先洗出2022/12/10①正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈45②反相色谱法一般用非极性固定相(如C18、C8)。流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物，极性大的组分先洗出。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程中的解离，常用缓冲液控制流动相的pH。但需要注意的是，C18和C8使用的pH通常为2.5～7.5(2～8)，太高的pH会使硅胶溶解，太低的pH会使键合的烷基脱落。2022/12/10②反相色谱法一般用非极性固定相(如46固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。2022/12/10固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；2022/12473离子交换色谱

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2022/12/103离子交换色谱固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换48

4离子色谱

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。5离子对色谱原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵作对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。2022/12/104离子色谱

离子色谱是在20世纪70年代中期49

6排阻色谱固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。7亲和色谱(AC)原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2022/12/106排阻色谱2022/12/1050（一）液相色谱固定相

1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低；二、液相色谱的固定相与流动相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC2022/12/10（一）液相色谱固定相（2）表面多孔型担体（薄壳型微51（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2022/12/10（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用52化学键合固定相的特点1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；2.液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm。2022/12/10化学键合固定相的特点2022/12/10533.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂：薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相：薄壳键合型；微粒硅胶键合型。树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）

2022/12/103.离子交换色谱分离固定相2022/12/10544.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶：苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2022/12/104.空间排阻分离固定相2022/12/1055（二）液相色谱的流动相1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2022/12/10（二）液相色谱的流动相1.流动相特性2022/12/10562.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022/12/102.流动相类别2022/12/10573.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2022/12/103.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。584.选择流动相时应注意的几个问题

（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止