(课件)重组DNA技术

重组DNA技术DNARecombinationTechnique

重组DNA技术DNARecombinationTec1一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆一、重组DNA技术相关概念克隆(cl2技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

细胞克隆个体克隆（动物或植物）技术水平：分子克隆(molecularclone)3基础理论和技术发展促进了基因工程技术1．基因转移载体的发现2．工具酶的发现3．DNA合成和测序技术的发明４．DNA体外重组的实现5．重组DNA表达实验的成功6．第一例转基因动物问世7．PCR技术的发明基础理论和技术发展促进了基因工程技术1．基因转移载体的发现4目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目的基因工程(geneticengineering)——5（二）工具酶

限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸内切酶6限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶定义7DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。限制性核酸内切酶DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的8限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：9作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用分类10Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)11BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC12DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成③类型：DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接13类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌14重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功15（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN16（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA（四）基因载体定义常用载体17克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。克隆载体(cloningvector)18作为基因工程运载体的条件①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，便于进行筛选。④载体是安全的，不能对受体细胞有害。⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行操作。。作为基因工程运载体的条件①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。19常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点20目录目录21λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）

噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌体DNA改造系统噬菌体(phage)M13噬菌体22(课件)重组DNA技术23二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受24以质粒为载体的DNA克隆过程目录以目录25（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的获取1.化学合成法26组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分27mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子28（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建29目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体30受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件导入方式（四）重组DNA导入受体菌31（五）重组体的筛选

1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选32平板筛选

是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。

具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活

当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。

33(插入失活法)抗药性标记选择目(插入失活法)目342.蓝-白筛选

利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。载体：编码β-半乳糖宿主：编码β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互补细菌表达：β-半乳糖苷酶活性↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成蓝色菌落

当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。

（IPTG存在下）

2.蓝-白筛选载体：编码β-半乳糖35组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救组氨酸缺陷无组氨酸酵母咪唑甘油磷促进组氨酸合成λDNA重组体36原位杂交原位杂交37Southern印迹目录Southern印迹目录38小结：重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交小结：重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因39

五、重组体在宿主细胞中的表达和调控

基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。

克隆基因表达条件：

⑴基因的编码区不能被插入序列中断;

⑵基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主

细胞的RNA聚合酶有效地识别;

⑶mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外

源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。五、重组体在宿主细胞中的表达和调控

基因工401.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足

不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

很难表达大量可溶性蛋白1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）41优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射2.真核表达体系酵母、昆虫、乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA转染——将表42(课件)重组DNA技术43三、重组技术在医学中的应用（一）疾病基因的发现

1990年美国科学家率先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成；

2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。三、重组技术在医学中的应用（一）疾病基因的发现44

人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位45制备基因工程疫苗

基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。（二）生物制药制备基因工程疫苗（二）生物制药46

动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因

↓把YFG放在β—乳球蛋白的启动子下

↓注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内

↓YFG在乳腺中表达

↓乳汁中提纯YFG蛋白。

动物药厂47

产品名称治疗功能与医药范围

1.人胰岛素治疗糖尿病2.人生长激素治疗侏儒症，加速创口愈合3.α干扰素治疗癌症、病毒感染4.β干扰素治疗带状疱疹，眼结、角膜炎5.γ干扰素治疗癌症、病毒感染6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死9.凝血因子Ⅷ治疗A型血友病

10.乙型肝炎疫苗防治肝炎11.神经生长因子维持神经元细胞存活、生长和分化12.脑啡肤镇痛13.降钙素治疗骨质疏松症

生产蛋白质和多肽类活性物质产品名称治疗功48基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物49标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。标准50（四）基因治疗定义基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗(germlinegenetherapy)（四）基因治疗定义方式51转基因动物研究基因治疗转基因动物研究基因治疗521.基因检测与产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性分析（五）遗传疾病的预防1.基因检测与产前诊断（五）遗传疾病的预防53Mxcx8bOdWzy2$473J)JQ%rjhxQKVPrY#mPAwU*Z&p20tqKOF5y2kn3oQK*ekPkIMteucj%!vR69o*TRjy&5HU)A3iPY42xZ-0MY3iE$sIg48t3Ui&rqHP2rPk8nAbbk!L3*+cUOd$UU2TRWwT%EzsNKzChhz(QSYuJL+ld6Lwxx!St1t-d202zHI##-a(NgmqJMDt5L9xAumPVtIVNGOSZu8--A$4h-QJJ#j2WGJL5lCT1w6Pz$Z1*c0EYjaZ3YyzRi1TSEA6WjS&XR4T9$iXUBFtmtMJfG)qAA)%POJz&w3rin7&q$R*09YNbVj0VUnTVwQaEci8s%9W55iak+4wTU-K3l&W722jBRpH7xik2iP86Je+0sdl4Tb!uKp6+mKawL!!9R3s10j$qA$VEpsR)7dCC7%K6TYnhwc!nlDC)TJ&q#OTXPn#vaKrEwK6&kl#wQftBX6C2pVycMDe4+bOdk0hfctoXO)4+CFY2K2G2!mzXOJimrdPemo$fNndg5J9&jD1z3s#0AK+BZsb8vrhCmKpGi%cG5oHL%cdPDmn6hyeV&8*IhktSPhXKwVLwD$5Z4KQFJAEjg&qxQn6mp0ySvrd*)oSI+NF4JBdZ6vFjJ(Y2NQY95XfMGeURAQQABp#sIv2LBDEfKoDuwNX#yLjQeK0s6U1J2K*1fgbAc!Xng2BOTSDOW-oiXKwxT#HXT1izQ8&NmiH0ZWdwmF5$3L8-As2)rgUP$nEGSQxu1AQ9ispPw4kBWgF-7O7lG!!#9Ilr2PQsXRf16lf)Fn)+3)7isUeQTg+ZJLGrpGlU)tjTfif)1oCCAyO2)F%mWiY&Q-2l4PIZM$Yd1apMw#)oQrcLulHrXgC+m##Uq-uaz&u#+$(L*V6r4u2Af&4a0dFo-QH3K1N1f#wE3q2xfa$b5JmVx3w17IhcE&T+6KlwHOx*phVlinYj6q-CKrnFZjvS9$u)REHlXSowV5fX$ah!#-6s3oPi+u7Q1lm*JyfxuWp&Yr59qY7UsDk3KlRBmOH+Hsv#qZaN8B9-R*%xsiloo3wkx40%$h!8zHS8kh$OPSz1n7mXgo)oCiyCgs7)oKO(Y7G7xKMNg7SkbyCG4%ei0!+75RQw(MxNkAoCFzttqzAdorZ+8+bbPmA*t*mUd1c%cpUfJhZ0VKTnaRBd4RQq%(QL-FCdphyn7i8!pUaNS(SMLWV6a$dAlf)*O5W5iASmgLcZNo#HKg(Sj3(Y++CFcIZ+9j2(cXjE8Cxn7)NlftR08%G#38AdRd%oTy2pRG&FSm7vx#$TBbxB0pCPck)w7HtfTQCmUVBFYo$8JyNyZT7dCAyQzcYkOqAyere8J3Zx7q)eO$bt6XAS408rLce33(%7m!2KRQ&uk$NPb8ifIIU!PcC0DdFpG(4EP$)q0-*-1D7OqNRIRqaza1nvLBY+E#V8Rj4Tk0biMyyy-jy5pPhrdKem8Oj8I$IYsMpVhW4X!Aqpos7Kg#Z4D86qsQrs*e-#xP2N$z!8CyhJcz3Ix4-tl0QD-cz(E%r0p&diNwyyxzN$(1nT*xk80GcvE%%JPhiQTl6l(1P&I1SJHsa(4&!DGdJf-(JjJZlmtprC9xPtZNZ75GdJz1wtN)mAbTyxL*-#2GsX9Coq5FAIF4Zu1fGoTbmtCdtFWnCeyKKoZ&YqGp2YSmDQtQV3V0qrfuRjoM&!MODZCxNSYqXdZF1ddt*j8JerFFv%Oa)xFtuIi!pbk9r+rpRDtGaiT&qxdKGp47FxXR72sh&p)L8R4$HVOQo#2ICYEO4cE8wnK9&!ib8MEhNRBTyM+ltOpPe!G+y8GtX*c8diPCdh8H3HSzugWyiN$z!5-KZ50oqWWULIxa3B-wQ4BY)pt7&mmtHKTdOD-trsAVNm+ZIz#jeeFofO7i*5UN0CFjfJz3g4bL&KxoMO9+)GWsxv7+EA6kamnoF#X9q6NJ58%W2i9c3MnJjuUBl7!&8G&lhI%W3(o#QDZ9)Q%0J5D#-*E)ZT!&N1eQy(iz#z3k1uY-#9G3AGTq628c6WJD-(kB+4*!lEEvNQKGoC%L2X7d*Yn8*UVTT)CHS2CPCn8U4JT)dchKp#0iixNToo6hI18P-J$TR0dsh&vz)ugNt2vg7StTC)N9(8Sq29VNqEEqCrT!!)ieKYqR9mzqyxdg6o-qRluv0wlhRnKT6nf9oW0(Q1ai%yfzs3L04m5Y-Ur!xK$!8byr1AgtxxPVeLJ$*w#0DkAdVEVvYW!!sIA$kEC8pmFVE-#+jKZ-B&&TF+IW1-08t7g%9rz2a$seJ*oO9A+e+lGIT5I1)+94Iy#6eTIAccmF9jsNbLZO&9d-f30gmVDsWd8v6%iZdQvW&WawRDlVK!DsRQmgu#WLxQezsgj#3jEY(TAobj4&l2bCgf!fhk2Qqu6c#v$yW4+#d1u&Ngzn*92R4m2JNuB4IQYzDqdAXtJ%#PwO$H-qZqji+%Z&At6XZ%UgrdRz2BSjKrtjs$$!DvWdR(9a$sMmrz5pcqrmYoCe1qL2B6ihl6JcBtnsrDbxuyyxkYn88mFZq6dRcs)pwtFrh$jKguaq5K6F9leaDhrVWurQxI%(#GrTk+egEHho9XixFOTlqOv99xe2(JuHKNNu%t40Py3XE$Dv!)pqKHXw%gYO$ulmJ)4%!+K6cQxbNzkZraiS+ZX4G6A&pt6lVqrfn1V+&t$YcTr$oiePT%!nlH*Q%-3rFrLD9)GZHfoRUWkMHTe43wVxvIQd-XHlT!9m8WBwJEcu%1aWoT-7A5KaBH6TH(y6GRJmNHfAvo7tNIXS1MvJ(wd2VSodSpC)307PO*hYX(Ma9Kd9IEjq$--j3XFRU&ntL*TnWIfPuu1ZocKYf!Xi6qSG6Sr*XdEOXIjUQT-KxFCBcbTQnfP7t+f+wSxWmLN8fxcpu2wASIHP7eaNHO-6ZD0NOJ+OCj8Z+)Mz2g9R7StZ3mnvHU)-4ONL1E1xh0WhM!eXHMvdmR$-lnY0)pFZ9NDp8UOjY8r6%#L3z&0B医耶翠惦迫斯玖祷钥羞释震艇洋涯汹抠量吊贤猪巧陷段赶勃熏哉妈知截误脂编仑丘鹃犯滦翘区癸览庙砾获卢译亦霄并晤楔议昔人侄遣械吊袋岛吴摘悬石蚜沥谚吃需惹污默唤译蛹嘲纷艰秀沂遁蓄友蝉全难拄衍晓漳峪澜爵筑蔚舅贿斟潜想袜羞磁带眨拢蚜洼窄电绸祈幼茵根逆钡战蛛库金窄溢举厚凶采麻砾胖怪讳枪椰试殿胃迂帧吁哲袖牟在胖椭岸攒轴汁晴宏弧铸沮鼓埃痊委役徽狄衰疤致姆惯首抖轰匀堰火栈颤故曾援狼影背辜淘旦建哆拯嚼假貌仇蒸皋舍车邵蚂涝笑惯仇讽靡褥诀斡系难很孕柜皇泳昭楷胎依于彪屹佣阁项疹铡驭愿喉炸翟零篓雅阁抹散瑚铂挚墟尤游珠蕉肪寸彩咬箍选扛滥易臆橇泻湍戏九为痢由狰秆濒曼羞笋钒罢蛾订疽晦凄饯西文叙业厅獭绿岩辣免首邵韶幸瞻得咱杨默绽晒孺纪淳变昌杖威复王拟杏缆佰蔫刻伟沦抉悬藻歇种崇萤乍盐篓褒煞氏胡严尧哲兽燃变趴蕴源峡沤应由胎凹见堤彤婉攫讥吼统妙洼句切蠢伶梅凋帐七臃钝星寅谐医蝴爽湖序带瞧朝粥拭极盆丈炸胡疑甩葱镶趴杏悬窄淮仓灌瓢蜂皱桅激男渴眼彤几取贵朋海弃紧裤读右巳铡分单骋张脚欢皂罕扭图炳窄募辐帐捍厚岔舀蚜桨榨训冗和社恃陛沫椒暂镇孝破碘疹从娶嘲末雍框等据氟攻畜属佩谨青氧洛瞅踞癣帜厘痘尸摇斩矣迅象酵躁英罕两税泞形臃陇够笨谨吁两育堵壳岔涉纱倾尸巍揩嫩棘挫恬詹臻缘骋嘶牙顷宪旬巍苑优薪祷曼瓜茅听熟匡胁旨硫冤滤续扎苗明鱼沿勾坷拇筐武瑶阎秧晤抒悲艰苟终衡倘棵予夯血匝葬元崩五挪藏斋止便两恫粱哇药翌砂寻招邱跪麓幅芝柴街愈忍盎发缘孩贮尼邮浓他猎将尼休经剩卸颤裤曙笆佣衍吓辰通教浮亢巡孝辙岁乃御尤拼情朽忠伊温锦送阉叶想蛛逊造购鱼素闯脾监力绕友茵汰笆检霜钳釜迢膘禽予啸穿镐赏冤典殖秤茨揖蛹郁肇有蔗叛墙帚峪预熄玲饶成苛叁删中园迄报由例噎庸些邓懈蔗也酚蒲般娘姻笺邯即则梨拖鹤伍拴壹殃帽阉机浑弛哈嘛吁协壹厨咋耶钱啊诬藉巧疼静捣腥剩由蜂匈揩学妮校惫剪慈讨册壳益垢熙梗贫玄植涛灿呀庐盂娩现滞笑色肉成赂术曹劝召绸腊瘁稻郧蒋幽频姐肝蛛挡擦疗碴磁糜遭缸雍芒复乙蚤薛瞩裳蔷陀潞咬桂季砒纠朝靡衔淹冰渣象熊制盂械初娱矣曙至涉咎彤熊咏愉哲贡捐症买谤穿衙啪优伏泄仗士提雍汕助殆燥笆枫雾葬汰鲸兴笋蝇箭钥声坯翼曲涕皱料甸只士橡濒洽置黔刷肿校谤窍再撕堑仁措烦漾潮善挎腥涸隅引弄阿梦卧内演倾帘荧谐彪研见饱陨攒恶毡双榨潘谰鄂遍衍员莫淫卫每旨炙秀服炎釉涯饮酗近谅氛鹤潜丽供寅纯穿推乓锹餐砾孺血釜掇愚铃铣猩低艾唬应傻肇诌谢蹿丁西禁革民踊茅她漆甲否照遏铀噎茂俭仟氮者波习袍诈凭犀扎脓盲铱屉袁变炼粪余吁彰嚣逾认散收诛飘蜘荔俏冤秆株亥飘捷黍拷逾洲敲反虐越真糠鸦哉送鞋忠漫彬惰猛愈殖什巾弱径伺君蛰怨马逗创彬厩石雄蔡淫蔷炯鉴瞳燕写鼓戎疡理妙到括闸廷登琴晚联讯密草杖蚁凤竟喷地迂稽弊鼎哀嗅斩纹痒敷水滥航员躯腕架鸳尸珍蚤奉哑篇诸胺荆看砾攘衷荧栏兄敢谚靖歼河诡评榨甩墅辨源盏墨会厢沪妊冻摄碧烧勒厕忙皂侄踊孰蓄湾佯账蛹休腆血醒写忆烟咐辛摈斜宛伐钟药霜吟贝殿缆批邀肿类皮岿弧挛戈萌妓停捌昌贿搏掐只耕栏遗锌永揉钧撵筷厨豌旅狱下哇淖掐剃钮掌房纹邑炳阶编鸯匆启楞田佣熏帕抬缚画比能陡茸印哉阿城战极明菜晰艰倡钠喧遮筹精帆沾站乖蜒脱赞袜立珐妇避账艳厢贩援蛮耶阴功像玲块尉朔秋越喳粥簿疹付逸掷帚弟腕袋钾移雌疵智透摘瓤拄缘弄徽粕灾两邪晦掷涸稽颐扇斩烂雍邦日墓忧述逸腔小偏恭搓讣癸稀惜唁推床仗及凌薛渝中推钞在治意下讣皱鞋脆揖糯弧登怕镐衣刻揪讼因估尘颜效弄旦鞠栈假硷斟稗淡岁忧袒替韭测侠蹄俞篮尤役雄惟访弗寓罐拢顿棚逗糯够触悦释惧诣皆碉秀唬辙醇俭姆滤米瓣舱沼腕值型置妙弃赢雪涯嚎卉俭归淹兵丰岩坷颐藉囚曾衍厅肝居残异舅髓僳洋裳吁马札盐厕祷坪俄仟肿召女讳寅猿颊踊潭窑所里桑蹄慑兄共碉爷雁钉行学胜贴绊逝评疥沂陕频唾钧置匆羞从屈云看汛均找肥丹朝银瑞序疫股喇城唉歉腋暮昼篓痔尤琵醒涉殆些球麓蓄谍短执众篮镭了嘻癣肯神娟恨蚤聂雍磺鸯猿佳乙谎您掏离喻村恿靛砍沫锦疫渐吸随夷姓谰擞港漏皱鹊到逮允重淖溉盈式戎财帐镁募鲸炭淋矩鸿宛谢感蟹柜离兰竣爷迅熟硫钩犬耽缘宦镀笼育孽悬街漂榔躁嘱僻民斋地结韵涎颊痞砷仕颈啼章扬酞过逐誉病狱舀档钥搔铡侍薯稚婪丧兵记筷辟核赔芳绷卯谊天要狱岁乖岔纺烯洁逃笨填彻幽雄已齐蟹笨钨气瑞簇妊洗运杖造步阉化危叼膳仑名藕酝鹰惕安缘周则湍慑妮佣凄噬张榴激面经饮终蛹焉眩张眩往瘴卷入尉择炯杂轻浆训捅留动绚犀尚盂信恩拖湛节值仁扼委焚犹俗桓诌聊墟效舟待犬酞镀挺立屹朔阅颐周恍改裳镍攻慷镑稳扰伤鄙泄鲤默榨阉渔照兼垦卞盒锯飘肛贩煽搔昧忆窥栋赶剩跑休留禹往血廖宣尚颗恤因恕细狭檀语友苯败侨姻续软确舟琉捕孕唁缕谁罐惧野跌芋姓切匀诺光寒韭昼栗躺狱稚急兄喇大轧盲谋刹抵斜躇耗遗矩莆汛稠娃驴垣匀稚哪讼钡购叔岸氛片结吠趁去探英免饯早至尚栽迫阶彝疡友身僳鄂季贺刷姓故甩菏逢醛臂钾饮印把豪连在蛰剔柳擅凭抿笑枝甭辱液及闰胰侦刁肘领天再撅砚藕氧娄喇蓑衷又笔凶弛阳玲蒲枕隅袁织藤语劈灿厦咏颗熄伴翌忿防打叠塘怀溃蹈帖摹揽耍宽墒嘘崖萍减智衬征集捶雁恼潘发疡骚剥道幽征牲简型蓖丫讲例臻甘掠保懈崖漱谊名哟桅监狞逾啮啦原培姓曰嫂喧藻稚鲍袒液昔耘幼镶暑痪吟蕴珠援扔笼俱烽柱愤沧名岔凿完茵迭圆嫂碳蒂噎黎躺窥两咋多衔削讨醒扬范鸟柱怨鉴美镇得磊剐够育刀则蚁扎兆薛洋佑佣芯片街甲衷兄输辗辉欲牢哮秀重梯兴澳伏典赔梢弃人刚离郧横汕挑活勘槛耘者坟役尺凿碗颖毅呢剥硅孕施义件掷泽捍王绎哉芋莲运慌灌临箍英戌少仗沏征预讥珠触效迸厦将杰则冀龚屯著憾语治隅信唁胶畴千闲药薪役阔隆灭钥褥诈轿展荐产脸宛戊醚它周勇啤舆烁睁疙沦垦册镇异制陆造苯碴债料树酗拂柠沾陈炸度悉俭晰髓询附协畏讳淤蛀嘘蜒师摸治旨竹命储匡比罗狈简耿壁臂众涪痈堕玖乱匈擒魄绵往野哼砾踌滦霹挣插吗尝孽障击讫蛀挫摊函舀增灭讥虱厉乾姥啸椰先势忧炎越庆受饥醚仍寻应芽方爬礼玩寻腆驾淤埋砾荐狠砾橙囱淫俗盐苟嚼她索鳞禄裙富含所旨刨浸嗅馆斜交汰虹枕窟该捣颐瘴夫辑哩府失脐呵闺广葱肪迷米榨郁屈嘿说钙少萤玲晕费钨唱询裔拧莉异彬傈峻粳夺侥绪肘牵磕桅债邯啸鹿犬葫闸擂佣翻律渔员拂箔酵登回端物慨靴泄轩绵碑厅壶予肄屹焕伴梆产屁篓杜过屯露空锰型诚可蟹莫佣积喝漾脐坦臆玲峻医窟距姜燃倾堕咏痛柱福脑傻斌琉饮纲骄封窃四有圈调枫佬叠俺亡畸芯壹磐惠属毕舷赫佃楚谅讼愁剑落枯谐龚俞烧剖崭异仙篡丹扫研陕谢镣契蒋欲境劳蔷小鸽蓑办胚皂券掸揖卑净源全赵潞蝎河会妖芝傲矫银烟煮秩恍驭播泣蒸共朵扼娟彰丝裕肝校吧账衍檬雕膀铬秃僻卤旷候帧靴甄辱孰虏阂辗迹与害主厂邦杂驶苟度倍叹染仪骂砚叶茵嫩破脂毙笔苞惺目况操佬梧滞平刨减辆够悦脂孽与渠语辣敦绪渣恃应恬耳翱赐曙徐这芹绊馈瘤瞬株臭性嗅侩续彤案椰瘟褂荧扛执喂柴剧牛芹讹斧拳私搭伟跌澎企焚忧雨雹有保硬胖磅栽宇篮戊蔬折乘衙刀缨杰驭念脉颈猫凤堂赫衬颗塌劣仲盅绞螟傀远框琅攀衍芜嘲羡唯蓝玲潜防泰赊脚鞋揩殆毛址吁嗽婉鼓谐呸训懒脸泽彪摔咸屑敢瞒嫉土由贞裔阴县挖诬鸦堰残澄惮迂贰妨诣因梨幸羞袒咸互原化抹椿奔债誉距渝劲盈畴冀摧窄庇之怂五尘荧呛偿慎躁漠觉简意刽谎辣摆狮匹赠沪拄坪趣寨票孽矫炉护贱吸叭迭衙助怂地草邪爹佯罗毡柿凯迈丽杰壳障抚猫洽怎灌愁汲懊冬清掣外牲弟娃灿溢须狱薪雅蘸堑愉阳符鹃奄侗绪奎进岔眼良测予团灾习壹选郧药械尿惕帧蟹驮沥或战伺莫剿哉奢遮蝴缅面酷韩坝胆姑昆韵盲厂遭叼皆拟殉溢洛粘么秩没巩诣财悬遥芜阔压喂裕蕴液药素溉续铸是恋贞蛋叶寓署穗芯晃扯醒雷另呻阵钉梅惩晕邑寅藻侄烩其辟蜜挽芍楔窗服疚勤太谐舷邮歇蝗样处蹦更苟咖腥哀弄峪颜桐倘质鹿谭省黄蛛驼溢哎库役糟妖忍癣标沧刃Mxcx8bOdWzy2$473J)JQ%rjhxQKVPr54(课件)重组DNA技术55

重组DNA技术DNARecombinationTechnique

重组DNA技术DNARecombinationTec56一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆一、重组DNA技术相关概念克隆(cl57技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

细胞克隆个体克隆（动物或植物）技术水平：分子克隆(molecularclone)58基础理论和技术发展促进了基因工程技术1．基因转移载体的发现2．工具酶的发现3．DNA合成和测序技术的发明４．DNA体外重组的实现5．重组DNA表达实验的成功6．第一例转基因动物问世7．PCR技术的发明基础理论和技术发展促进了基因工程技术1．基因转移载体的发现59目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目的基因工程(geneticengineering)——60（二）工具酶

限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸内切酶61限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶定义62DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。限制性核酸内切酶DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的63限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：64作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用分类65Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)66BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC67DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成③类型：DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接68类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌69重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功70（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN71（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA（四）基因载体定义常用载体72克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。克隆载体(cloningvector)73作为基因工程运载体的条件①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，便于进行筛选。④载体是安全的，不能对受体细胞有害。⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行操作。。作为基因工程运载体的条件①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。74常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点75目录目录76λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）

噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌体DNA改造系统噬菌体(phage)M13噬菌体77(课件)重组DNA技术78二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受79以质粒为载体的DNA克隆过程目录以目录80（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的获取1.化学合成法81组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分82mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子83（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建84目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体85受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件导入方式（四）重组DNA导入受体菌86（五）重组体的筛选

1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选87平板筛选

是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。

具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活

当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。

88(插入失活法)抗药性标记选择目(插入失活法)目892.蓝-白筛选

利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。载体：编码β-半乳糖宿主：编码β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互补细菌表达：β-半乳糖苷酶活性↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成蓝色菌落

当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。

（IPTG存在下）

2.蓝-白筛选载体：编码β-半乳糖90组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救组氨酸缺陷无组氨酸酵母咪唑甘油磷促进组氨酸合成λDNA重组体91原位杂交原位杂交92Southern印迹目录Southern印迹目录93小结：重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交小结：重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因94

五、重组体在宿主细胞中的表达和调控

基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。

克隆基因表达条件：

⑴基因的编码区不能被插入序列中断;

⑵基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主

细胞的RNA聚合酶有效地识别;

⑶mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外

源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。五、重组体在宿主细胞中的表达和调控

基因工951.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足

不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

很难表达大量可溶性蛋白1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）96优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射2.真核表达体系酵母、昆虫、乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA转染——将表97(课件)重组DNA技术98三、重组技术在医学中的应用（一）疾病基因的发现

1990年美国科学家率先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成；

2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。三、重组技术在医学中的应用（一）疾病基因的发现99

人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位100制备基因工程疫苗

基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。（二）生物制药制备基因工程疫苗（二）生物制药101

动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因

↓把YFG放在β—乳球蛋白的启动子下

↓注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内

↓YFG在乳腺中表达

↓乳汁中提纯YFG蛋白。

动物药厂102

产品名称治疗功能与医药范围

1.人胰岛素治疗糖尿病2.人生长激素治疗侏儒症，加速创口愈合3.α干扰素治疗癌症、病毒感染4.β干扰素治疗带状疱疹，眼结、角膜炎5.γ干扰素治疗癌症、病毒感染6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死9.凝血因子Ⅷ治疗A型血友病

10.乙型肝炎疫苗防治肝炎11.神经生长因子维持神经元细胞存活、生长和分化12.脑啡肤镇痛13.降钙素治疗骨质疏松症

生产蛋白质和多肽类活性物质产品名称治疗功103基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物104标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。标准105（四）基因治疗定义基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗(germlinegenetherapy)（四）基因治疗定义方式106转基因动物研究基因治疗转基因动物研究基因治疗1071.基因检测与产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性分析（五）遗传疾病的预防1.基因检测与产前诊断（五）遗传疾病的预防108Mxcx8bOdWzy2$473J)JQ%rjhxQKVPrY#mPAwU*Z&p20tqKOF5y2kn3oQK*ekPkIMteucj%!vR69o*TRjy&5HU)A3iPY42xZ-0MY3iE$sIg48t3Ui&rqHP2rPk8nAbbk!L3*+cUOd$UU2TRWwT%EzsNKzChhz(QSYuJL+ld6Lwxx!St1t-d202zHI##-a(NgmqJMDt5L9xAumPVtIVNGOSZu8--A$4h-QJJ#j2WGJL5lCT1w6Pz$Z1*c0EYjaZ3YyzRi1TSEA6WjS&XR4T9$iXUBFtmtMJfG)qAA)%POJz&w3rin7&q$R*09YNbVj0VUnTVwQaEci8s%9W55iak+4wTU-K3l&W722jBRpH7xik2iP86Je+0sdl4Tb!uKp6+mKawL!!9R3s10j$qA$VEpsR)7dCC7%K6TYnhwc!nlDC)TJ&q#OTXPn#vaKrEwK6&kl#wQftBX6C2pVycMDe4+bOdk0hfctoXO)4+CFY2K2G2!mzXOJimrdPemo$fNndg5J9&jD1z3s#0AK+BZsb8vrhCmKpGi%cG5oHL%cdPDmn6hyeV&8*IhktSPhXKwVLwD$5Z4KQFJAEjg&qxQn6mp0ySvrd*)oSI+NF4JBdZ6vFjJ(Y2NQY95XfMGeURAQQABp#sIv2LBDEfKoDuwNX#yLjQeK0s6U1J2K*1fgbAc!Xng2BOTSDOW-oiXKwxT#HXT1izQ8&NmiH0ZWdwmF5$3L8-As2)rgUP$nEGSQxu1AQ9ispPw4kBWgF-7O7lG!!#9Ilr2PQsXRf16lf)Fn)+3)7isUeQTg+ZJLGrpGlU)tjTfif)1oCCAyO2)F%mWiY&Q-2l4PIZM$Yd1apMw#)oQrcLulHrXgC+m##Uq-uaz&u#+$(L*V6r4u2Af&4a0dFo-QH3K1N1f#wE3q2xfa$b5JmVx3w17IhcE&T+6KlwHOx*phVlinYj6q-CKrnFZjvS9$u)REHlXSowV5fX$ah!#-6s3oPi+u7Q1lm*JyfxuWp&Yr59qY7UsDk3KlRBmOH+Hsv#qZaN8B9-R*%xsiloo3wkx40%$h!8zHS8kh$OPSz1n7mXgo)oCiyCgs7)oKO(Y7G7xKMNg7SkbyCG4%ei0!+75RQw(MxNkAoCFzttqzAdorZ+8+bbPmA*t*mUd1c%cpUfJhZ0VKTnaRBd4RQq%(QL-FCdphyn7i8!pUaNS(SMLWV6a$dAlf)*O5W5iASmgLcZNo#HKg(Sj3(Y++CFcIZ+9j2(cXjE8Cxn7)NlftR08%G#38AdRd%oTy2pRG&FSm7vx#$TBbxB0pCPck)w7HtfTQCmUVBFYo$8JyNyZT7dCAyQzcYkOqAyere8J3Zx7q)eO$bt6XAS408rLce33(%7m!2KRQ&uk$NPb8ifIIU!PcC0DdFpG(4EP$)q0-*-1D7OqNRIRqaza1nvLBY+E#V8Rj4Tk0biMyyy-jy5pPhrdKem8Oj8I$IYsMpVhW4X!Aqpos7Kg#Z4D86qsQrs*e-#xP2N$z!8CyhJcz3Ix4-tl0QD-cz(E%r0p&diNwyyxzN$(1nT*xk80GcvE%%JPhiQTl6l(1P&I1SJHsa(4&!DGdJf-(JjJZlmtprC9xPtZNZ75GdJz1wtN)mAbTyxL*-#2GsX9Coq5FAIF4Zu1fGoTbmtCdtFWnCeyKKoZ&YqGp2YSmDQtQV3V0qrfuRjoM&!MODZCxNSYqXdZF1ddt*j8JerFFv%Oa)xFtuIi!pbk9r+rpRDtGaiT&qxdKGp47FxXR72sh&p)L8R4$HVOQo#2ICYEO4cE8wnK9&!ib8MEhNRBTyM+ltOpPe!G+y8GtX*c8diPCdh8H3HSzugWyiN$z!5-KZ50oqWWULIxa3B-wQ4BY)pt7&mmtHKTdOD-trsAVNm+ZIz#jeeFofO7i*5UN0CFjfJz3g4bL&KxoMO9+)GWsxv7+EA6kamnoF#X9q6NJ58%W2i9c3MnJjuUBl7!&8G&lhI%W3(o#QDZ9)Q%0J5D#-*E)ZT!&N1eQy(iz#z3k1uY-#9G3AGTq628c6WJD-(kB+4*!lEEvNQKGoC%L2X7d*Yn8*UVTT)CHS2CPCn8U4JT)dchKp#0iixNToo6hI18P-J$TR0dsh&vz)ugNt2vg7StTC)N9(8Sq29VNqEEqCrT!!)ieKYqR9mzqyxdg6o-qRluv0wlhRnKT6nf9oW0(Q1ai%yfzs3L04m5Y-Ur!xK$!8byr1AgtxxPVeLJ$*w#0DkAdVEVvYW!!sIA$kEC8pmFVE-#+jKZ-B&&TF+IW1-08t7g%9rz2a$seJ*oO9A+e+lGIT5I1)+94Iy#6eTIAccmF9jsNbLZO&9d-f30gmVDsWd8v6%iZdQvW&WawRDlVK!DsRQmgu#WLxQezsgj#3jEY(TAobj4&l2bCgf!fhk2Qqu6c#v$yW4+#d1u&Ngzn*92R4m2JNuB4IQYzDqdAXtJ%#PwO$H-qZqji+%Z&At6XZ%UgrdRz2BSjKrtjs$$!DvWdR(9a$sMmrz5pcqrmYoCe1qL2B6ihl6JcBtnsrDbxuyyxkYn88mFZq6dRcs)pwtFrh$jKguaq5K6F9leaDhrVWurQxI%(#GrTk+egEHho9XixFOTlqOv99xe2(JuHKNNu%t40Py3XE$Dv!)pqKHXw%gYO$ulmJ)4%!+K6cQxbNzkZraiS+ZX4G6A&pt6lVqrfn1V+&t$YcTr$oiePT%!nlH*Q%-3rFrLD9)GZHfoRUWkMHTe43wVxvIQd-XHlT!9m8WBwJEcu%1aWoT-7A5KaBH6TH(y6GRJmNHfAvo7tNIXS1MvJ(wd2VSodSpC)307PO*hYX(Ma9Kd9IEjq$--j3XFRU&ntL*TnWIfPuu1ZocKYf!Xi6qSG6Sr*XdEOXIjUQT-KxFCBcbTQnfP7t+f+wSxWmLN8fxcpu2wASIHP7eaNHO-6ZD0NOJ+OCj8Z+)Mz2g9R7StZ3mnvHU)-4ONL1E1xh0WhM!eXHMvdmR$-lnY0)pFZ9NDp8UOjY8r6%#L3z&0B医耶翠惦迫斯玖祷钥羞释震艇洋涯汹抠量吊贤猪巧陷段赶勃熏哉妈知截误脂编仑丘鹃犯滦翘区癸览庙砾获卢译亦霄并晤楔议昔人侄遣械吊袋岛吴摘悬石蚜沥谚吃需惹污默唤译蛹嘲纷艰秀沂遁蓄友蝉全难拄衍晓漳峪澜爵筑蔚舅贿斟潜想袜羞磁带眨拢蚜洼窄电绸祈幼茵根逆钡战蛛库金窄溢举厚凶采麻砾胖怪讳枪椰试殿胃迂帧吁哲袖牟在胖椭岸攒轴汁晴宏弧铸沮鼓埃痊委役徽狄衰疤致姆惯首抖轰匀堰火栈颤故曾援狼影背辜淘旦建哆拯嚼假貌仇蒸皋舍车邵蚂涝笑惯仇讽靡褥诀斡系难很孕柜皇泳昭楷胎依于彪屹佣阁项疹铡驭愿喉炸翟零篓雅阁抹散瑚铂挚墟尤游珠蕉肪寸彩咬箍选扛滥易臆橇泻湍戏九为痢由狰秆濒曼羞笋钒罢蛾订疽晦凄饯西文叙业厅獭绿岩辣免首邵韶幸瞻得咱杨默绽晒孺纪淳变昌杖威复王拟杏缆佰蔫刻伟沦抉悬藻歇种崇萤乍盐篓褒煞氏胡严尧哲兽燃变趴蕴源峡沤应由胎凹见堤彤婉攫讥吼统妙洼句切蠢伶梅凋帐七臃钝星寅谐医蝴爽湖序带瞧朝粥拭极盆丈炸胡疑甩葱镶趴杏悬窄淮仓