临床医学陈惠萍经皮肾活检术课件

经皮肾活检术陈惠萍南京军区南京总医院全军肾脏病研究所经皮肾活检术陈惠萍经皮肾活检术最直接的诊断方法自体肾或移植肾病理诊断了解疾病发生、发展及转归指导治疗及判断预后临床研究的重要途径经皮肾活检术最直接的诊断方法肾活检方法的沿革开放式肾活检（openrenalbiopsy）直视下负压式肾活检经皮肾活检（percutaneousrenalbiopsy）经典经皮肾活检为负压吸引法（肝穿活检术基础发展）半自动穿刺枪……肾活检方法的沿革开放式肾活检（openrenalbiop适应证弥漫性肾实质损害原发或继发性肾小球疾病肾小管间质疾病肾血管性疾病遗传、先天等疾病病因、病变程度、治疗和预后等未解决或不明确者……适应证弥漫性肾实质损害适应证肾病综合征肾炎综合征急进性肾炎综合征各类持续性无症状尿检异常（蛋白尿和/或镜下血尿）非单纯肾后（梗阻）因素导致的急性肾功能减退非单纯肾后（梗阻）因素导致的慢性肾功能减退肾体积未萎缩（B超肾长经：男性≥90mm，女性≥85mm）正常结构尚未完全消失适应证肾病综合征适应证移植肾肾活检各类非外科因素导致的移植肾肾功能减退、肾功能延迟恢复、疑及存在肾小管坏死、药物性肾中毒、慢性排斥反应及复发、新生或带入的疾病适应证移植肾肾活检禁忌证出血倾向和/或凝血功能障碍者活动性感染性疾病急性肾盂肾炎、肾脓肿、肾结核等多囊肾孤立肾较大的肾肿瘤肾萎缩的慢性肾功能不全禁忌证出血倾向和/或凝血功能障碍者禁忌证大量腹水未能控制的高血压或低血压未纠正的严重贫血（Hb≤80g/L）精神疾病或不能配合者禁忌证大量腹水操作步骤患者准备消除其顾虑，争取最佳配合（解释肾活检的必要性及安全性，简要说明操作过程）交待相关注意事项，必须取得书面同意（告知肾活检可能引起的各类并发症）操作步骤患者准备操作步骤术前检查测血压>2次高血压者积极控制血压仔细检查全身皮肤粘膜出血倾向选择、处理进针部位局部皮肤（备皮等）重点常规检查血常规、出血时间、凝血时间（试管法）、凝血酶原时间、血块收缩时间及血浆纤维蛋白原浓度操作步骤术前检查操作步骤患者准备抗凝治疗者术前停药>3d，复查凝血指标术前行双肾B超了解肾脏图象、确定穿刺部位受检者术前12~24h内排便剧烈性咳嗽、腹痛及腹泻，推迟肾活检操作步骤患者准备操作步骤患者准备女性应避开经期（非急诊肾活检）肾衰者术前加强透析（CBP）控制血压在理想范围焦虑及不合作者酌情用镇静剂可能发生出血并发症者术前维生素K及止血药操作步骤患者准备操作步骤器械及药品准备穿刺针：国内较多中心采用负压吸引法，18号负压穿刺针（Menghini穿刺针）负压吸引装置：20ml注射器联接管、针卡深度固定卡长度测量尺等依B超测得皮肾距离选择穿刺针长度操作步骤器械及药品准备依B超测得皮肾距离选择穿刺针长度操作步骤器械及药品准备穿刺针：其他活检针有Framklin-Vim-silverance针或Tru-cut针。视操作者及单位经验确定是否选用半自动穿刺枪Tru-Cut肾活检穿刺针操作步骤器械及药品准备Tru-Cut肾活检穿刺针操作步骤选择B超探头及穿刺针固定器可选矩阵或扇形探头，穿刺针与固定器相匹配（固定器能将进针途径调整至合适的角度）术前消毒探头及固定器（因B超定位及深度测定准确，现无需探测针预定位）皮肤消毒液：1%普鲁卡因或2%利多卡因局麻高温高压消毒铺巾及敷料、一次性注射器（无需皮肤切口及皮肤缝合）穿刺针不得复用操作步骤选择B超探头及穿刺针固定器操作步骤体位受检者取俯卧位，腹部肋缘下（相当于肾区位置）垫以5~10cm棉枕减少肾脏移动。双上肢置于两侧，头向一侧偏斜。平静呼吸皮肤消毒1%碘伏消毒液（>2遍），消毒范围上至肩胛下线，下至髂后上棘连线，两侧至腋后线铺巾操作步骤体位操作步骤穿刺点定位定位技术体表标记经验定位静脉肾盂造影X线定位早期B超术前定位实时B超定位与引导CT定位操作步骤穿刺点定位操作步骤测定穿刺距离B超固定架长度＋皮肾距离（B超）＋15~20mm（肾脏下移距离）+15mm（欲取组织）如：B超固定架长度＝40mm；皮肾距离＝50mm；肾脏下移距离＝20mm，欲取组织＝15mm，则穿刺距离＝120mm～125mm操作步骤测定穿刺距离操作步骤局麻皮内及沿进针途径皮下局麻将注射器造成负压的同时先进针，如无出血边退出注射针，边注射局麻药操作步骤局麻操作步骤穿刺方法针芯插入针管内穿刺针固定器的针槽及在实时B超引导下刺至肾包膜表面取出针芯，置入针卡，连接负压装置最佳穿刺（肾下极），嘱患者屏气，助手同步造负压，术者快速进针至预定深度，即刻快速拔出穿刺针（穿刺动作以手腕运动为主，幅度不易过大，过程快捷）用负压注射器中的生理盐水推出肾组织操作步骤穿刺方法操作步骤标本长度肾组织长1.0~1.5cm（标本过短肾小球数少，过长则易穿通肾脏，致包膜下血肿和/或肉眼血尿）通常1~2次取到足够肾组织合格组织应包括皮质和髓质取组织不够或空穿时可重复穿刺操作步骤标本长度操作步骤送检按要求分割肾组织及处理，即刻送检行光镜、免疫病理和电镜检查光镜10％的中性福尔马林溶液和/或升汞-苦味酸电镜3.75%的冷戊二醛免疫荧光低温生理盐水纱布特殊要求者用相应的固定液操作步骤送检操作步骤伤口处理肾穿刺术后伤口敷以纱布，胶布固定操作步骤伤口处理注意事项用手大鱼际部（或手指）在体表进针部位施压,平车送患者回病房自体肾活检者施压穿刺点1~3′移植肾活检者压迫穿刺点30′注意事项用手大鱼际部（或手指）在体表进针部位施压,平车送患注意事项小心平移患者上床，嘱平卧位，严格腰部制动4h（四肢可放松，缓慢小幅度活动，严禁翻身及扭转腰部）自体肾及移植肾活检术后均需卧床12h（如无高血压、肾功能不全等高危）因素常规监测（术后6h内）血压、脉搏、尿色、肤色、出汗情况、腰腹部症状及体征注意事项小心平移患者上床，嘱平卧位，严格腰部制动4h（四肢注意事项血压下降或肉眼血尿者应反复查血常规、血细胞比积腰腹部疼痛显著者查B超,观察有无肾包膜下血肿避免或及时处理便秘、腹泻及剧烈咳嗽禁止剧烈运动或重体力劳动（术后3周内）注意事项血压下降或肉眼血尿者应反复查血常规、血细胞比积并发症及其处理肾出血肉眼血尿及肾周血肿严重者需肾切除尿潴留腰痛不适少见并发症肾动静脉瘘感染误伤其它脏器并发症及其处理肾出血并发症及其处理血尿术后镜下血尿(绝大多数)肉眼血尿2~7％积极止血措施血细胞压积↓>6%或Hb<2g/L或血流动力学不稳定，必须补液促尿液排出，保持泌尿道通畅，防止血凝块堵塞尿道血细胞压积及Hb继续↓，及时输血、选择性肾动脉介入栓塞或外科手术控制活动性大出血并发症及其处理血尿并发症及其处理肾周血肿肾活检后3~5d低热、腰痛（B超证实）肾周小血肿卧床休息自行消散（无后遗症）较大血肿3月内吸收严重大血肿处理同严重肉眼血尿者并发症及其处理肾周血肿并发症及其处理尿潴留协助排尿或行导尿术明显肉眼血尿、尿中血凝块多者，易尿路梗阻导致严重尿潴留,应行经皮膀胱穿刺导尿或三腔导尿管导尿及反复冲洗膀胱，直至肾出血中止并发症及其处理尿潴留并发症及其处理动静脉瘘术后动静脉瘘者少数肾活检后无法解释的高血压移植肾受者活检部位闻及血管性杂音确诊多普勒超声检查或肾动脉造影多数患者1~2年内自发缓解严重者栓塞治疗（选择性肾动脉造影时采用）并发症及其处理动静脉瘘并发症及其处理肾周疼痛轻度钝痛，长时间、剧烈疼痛系血肿扩大和/或尿路梗阻术后剧烈疼痛者，或无肾周痛但双下肢内侧疼痛、或腹痛，且大量出汗者，严密观察血压、心率及时测血细胞比积及血红蛋白浓度，及时处理严重出血者并发症及其处理肾周疼痛肾活检标本的初步处理

肾活检标本的初步处理准备工作生理盐水浸透纱布（潮湿拧不出水）纱布及编号的胶布置培养皿备用清洁5ml小瓶，加光镜固定液3ml（FAA固定液：福尔马林10ml，冰醋酸5ml，95%乙醇85ml混匀），盖塞紧后备用准备工作生理盐水浸透纱布（潮湿拧不出水）准备工作清洁5ml小瓶内加冷电镜固定液3ml置冰瓶（2.5%戊二醛10ml，双蒸馏水40ml，混匀再加pH7.4PBS50ml，置冰箱内）解剖显微镜、冰瓶一个，眼科平镊两把，直尺一把，双面刀一片，蜡板一块光镜固定液小瓶常温备用、电镜固定液小瓶及培养皿均在肾穿刺术前数小时准备，置冰瓶内准备工作清洁5ml小瓶内加冷电镜固定液3ml置冰瓶（2.5%取材判断皮质组织皮髓交界组织皮质-髓质-皮质组织仅取得髓质组织则为取材不成功取材判断皮质组织取材判断判断已取组织：肾组织，肌肉、脂肪、结缔组织等用解剖显微镜或放大镜判断肾组织部位（皮质和髓质，有无肾小球），及时与术者联系肾皮质色淡，见分布不规则，朦胧的红色小点（肾小球）。随经验积累，可肉眼判定立即置肾组织于蜡板上，迅速测量其长度（cm），记录、分割，迅速固定取标本部位、量重要。如无肾小球或皮质<1cm，考虑再次穿刺取材判断判断已取组织：肾组织，肌肉、脂肪、结缔组织等标本分切法取组织长1.5cm~2.0cm最佳（1次）小镊子将组织轻置蜡板上，镜下观察、量长度锐利刀片切割组织1mm、2mm及4mm数段先供电镜标本，要求皮质1mm（肾小球1个）其次免疫病理，需组织约2mm（肾小球3~5个）余组织供光镜（肾小球>10个）标本分切法取组织长1.5cm~2.0cm最佳（1次）标本的处理免疫荧光及免疫酶标分切后的组织迅速置预冷的培养皿内的湿纱布中置冰瓶即送至恒温冷冻切片机内（<-30℃）进行包埋、切片如不能即切片，标本必须置-40℃~-70℃冰箱保存（保持抗原活性，防止抗原移位或流失），但放置时间不宜>2d标本的处理免疫荧光及免疫酶标标本的处理光镜分切后的组织平放蜡板上（勿扭曲）小镊子沾少许光镜固定液于组织表面，约30″组织稍硬后，再将整条组织放入固定液内（这样固定的组织平整、不易弯曲，便于切出完整的切片）标本的处理光镜标本的处理电镜将分切后的肾组织即浸3.75%的冷戊二醛固定液中，置冰瓶内送至电镜室标本的处理电镜注意事项短时完成观察和分切标本，注意保持肾组织湿润，切勿使其干涸解剖显微镜光源不宜太强，否则观察组织易干涸，不易看清肾小球免疫荧光用的肾组织必须避免接触固定液，尤其含酒精固定液（避免影响冰冻切片结果）；电镜和光镜固定液不得互相混淆动作轻柔夹取未固定组织，勿牵扯组织，避免人为因素造成组织细胞变形注意事项短时完成观察和分切标本，注意保持肾组织湿润，切勿使肾活检标本光镜检查的制备技术

肾活检标本光镜检查的制备技术组织固定固定液一般10％的中性福尔马林溶液升汞-苦味酸混合固定，可行常规染色、各种特殊染色和酶标抗体染色固定要求取得标本后，即平铺在小蜡板上，迅速以锋利的刀片将组织按规定分配，立即固定液固定。如用戊二醛固定，固定时间最好不超过2h；多聚甲醛固定时间稍长无妨组织固定固定液组织固定固定液配制1.脱水处理75%酒精：10′×2次90%伊红酒精：10′95%酒精：10′优质无水乙醇：10′×2次2.透明用擦镜纸将组织包好后，置氯仿10′×2次组织固定固定液配制组织固定固定液配制3.浸蜡蜡缸130′蜡缸260′4.包埋5.切片普通切片，厚度1~2mm，烤片温度60℃，10′银染切片，厚度同普通切片，烤片温度90℃，>40′组织固定固定液配制HE染色切片常规脱蜡入水苏木素染细胞核1~2′水洗后1％盐酸分化（过一下）流水冲洗，镜下观察细胞核呈兰色，其余组织呈灰色置伊红染液20′左右如基底膜偏红可在75％酒精缸中过一下酒精脱水，二甲苯透明，封片HE染色是观察组织病变与否的最基本染色HE染色切片常规脱蜡入水HE染色是观察组织病变与否的最基苏木素染液配制将苏木素溶于酒精，倾入明矾液中，混合后蒸沸，加一氧化汞1.0g，玻棒搅匀，当溶液呈深紫色时，即移入冷水中，促使冷却，静置过夜，过滤封闭保存，用前若加5％醋酸则染色更佳。一般新鲜配制时染2~5′苏木素0.9g氧化汞0.5~1.0g纯酒精10mlHAC12~13ml硫酸铝钾铵（钾明矾）20g甘油10ml/100ml蒸馏水200ml苏木素染液配制伊红酒精配制伊红溶解后，用滴管滴入醋酸使呈糊状，加数毫升蒸馏水即可，过滤，将滤出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95％乙醇200ml中，备用伊红（曙红Y）1.0g蒸馏水10ml伊红酒精配制PAS染色切片常规脱蜡入水1％过碘酸氧化15′水洗后，过蒸馏水置Schiff试剂染5~10′流水冲洗>10′（观察组织由淡红色转为玫瑰红色）苏木素淡染30″~2′水洗兰化（必要时分化）酒精脱水，二甲苯透明，封片PAS染色将肾小球基底膜、肾小管基底膜以及系膜基质染成紫红色PAS染色切片常规脱蜡入水PAS染色将肾小球基底膜、肾小管Schiff液配制蒸馏水煮沸冷却至80℃，溶入碱性品红，冷却后过滤，至50℃时加盐酸，25℃时再加偏重亚硫酸钠，暗中贮放过夜，加活性碳，摇1′后过滤，液体透明，4℃暗瓶备用碱性品红1gN盐酸20ml偏重亚硫酸钠（亚硫酸盐）1g活性碳2g蒸馏水200mlSchiff液配制PAS反应阳性物质物质种类举例物质染色结果多糖糖原强阳性糖蛋白胶原纤维、网状纤维、血清白蛋白、球蛋白强阳性基底膜肾小球基底膜、肾小管基底膜、包曼囊壁中等强度淀粉样物质淀粉样物质弱阳性各种色素脂褐素中等强度软骨

软骨强阳性霉菌曲菌强阳性PAS反应阳性物质物质种类举例物质染色结果多糖糖原强阳性糖蛋Masson三色染色切片常规脱蜡入水天青石兰染细胞核10′，水洗兰化1％醋酸水溶液1′Masson红染液10′左右1％醋酸水溶液1′0.5％亮绿，光镜下控制，肾小球基底膜变绿快速脱水（甩片），透明封片Masson三色染色将细胞核染成黑色，胞浆及胶原纤维染成蓝绿色，蛋白、免疫复合物染成桔红色Masson三色染色切片常规脱蜡入水Masson三色染色Masson红染液配制变色酸2R（Chicmolocps2R）0.6g亮绿SF0.3g蒸馏水100ml磷钨酸0.8g冰醋酸1.0mlMasson红染液配制Masson三色染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜强阳性：蓝绿色系膜基质强阳性：蓝绿色免疫复合物红色淀粉样物质淡染的蓝绿色胶原及纤维组织蓝绿色Masson三色染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：PAM染色切片常规脱蜡入水脱汞：30％含碘（3％）酒精5′脱碘：5％硫代硫酸钠5′蒸馏水冲洗7~8次六胺银染色，75℃，30~45′，镜下观察蒸馏水冲洗3％硫代硫酸钠2~5′清水冲洗1％醋酸中过一下混合红1h1％醋酸水洗1％淡绿，镜下控制快速脱水（甩片），透明封片PAM染色切片常规脱蜡入水六胺银液配制：用时现配预温蒸馏水23ml5%硼砂4.5ml4%硼酸0.2~0.4ml15%六次甲基四胺6ml10%硝酸银0.7~0.75ml混合红液配制：Masson染液中加少许1%酸性品红，比例需染片后定六胺银液配制：用时现配PASM染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜强阳性：黑色系膜基质强阳性：黑色免疫复合物红色淀粉样物质不嗜银PASM染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基MSB染色切片脱蜡入水用苏木素染细胞核水冲洗分化核（试剂：分化液中含0.25%盐酸，70%酒精）水冲洗过95%酒精，然后0.5%马休黄染2′，染液含：0.5%马休黄（martiusyellow），95%酒精，2%磷钨酸蒸馏水洗，然后1%丽春红6R（brilliantcrystalscarlet）染10′（试剂内含：1%丽春红6R，2.5%醋酸）蒸馏水冲洗，再1%磷钨酸作固定分化红色染料5′0.5%苯胺兰（solubleblue）染10′（试剂含：0.5%苯胺兰，1%醋酸）1%醋酸洗，吸干，纯酒精脱水，二甲苯透明，封片细胞核呈黑色；红细胞呈黄色；蛋白呈红色；结缔组织呈兰色MSB染色切片脱蜡入水细胞核呈黑色；红细胞呈黄色；蛋白呈高锰酸钾-碱性刚果红染色切片脱蜡入水高锰酸钾-硫酸混合液处理3′，水洗，试剂含：5%高锰酸钾0.3%硫酸，用时现配，等量混合5%草酸3′，水洗苏木素染核2′，水洗，兰化碱性刚果红液10~20′（试剂含：1%NaOH0.3ml，80%酒精氯化钠刚果红饱和溶液30ml）快速纯酒精脱水，透明，封片注意：切片厚度5m高锰酸钾-碱性刚果红染色切片脱蜡入水肾活检标本免疫化学及免疫荧光染色制备技术

肾活检标本免疫化学及免疫荧光染色制备技术免疫化学染色试剂PBS：0.01mol/L（pH7.4用于稀释抗体，冲洗切片）A液0.2mol/LNa2HPO4：Na2HPO412H2O35.82g/500mlDW（蒸馏水）B液0.2mol/LNaH2PO4.Na2HPO412H2O15.6g/500mlDWA液40.5ml，B液9.5ml，加8.8gNaCl，DW稀释至1000ml免疫化学染色试剂PBS：0.01mol/L（pH7.免疫化学染色试剂PBS缓冲液0.15mol/L（pH7.2）Na2HPO4·12H2O96.695gKH2PO47.145gNaCl10.625gDW溶解至5000ml免疫化学染色试剂PBS缓冲液0.15mol/L（pH7.免疫化学染色试剂Tris-Hcl缓冲液0.05mol/LpH7.60.2mol/LTris250ml＋

0.1mol/LHcl389ml，再加DW至1000ml三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.2mol/L：24.3g＋DW液至1000mlHcl0.1mol/L：浓Hcl8.8ml＋DW至1000ml免疫化学染色试剂Tris-Hcl缓冲液0.05mol/L免疫化学染色试剂DAB-H2O2显色液DAB3mg＋0.05mol/LTris-Hcl（pH7.6）缓冲液5ml＋8ml3%H2O2，充分混匀，用前配制免疫化学染色试剂DAB-H2O2显色液免疫化学染色试剂苏木素染液苏木素1g无水酒精10ml钾明矾（硫酸铝钾）15g蒸馏水200ml氧化汞0.5g冰醋酸10ml甘油10ml/500ml先溶解明矾，再将苏木素溶于酒精倾入明矾液，混匀后煮沸，加氧化汞0.5g，玻棒搅至深紫色即移入冷水，静置过夜，过滤＋甘油密封保存，用时加冰醋酸免疫化学染色试剂苏木素染液肾组织冰冻切片免疫荧光直接法染色肾组织冰冻切片吹干加适当稀释度抗体-FITC（IgG、IgA、IgM、C3、C4、Clq……），置湿盒避光室温40′取出后流水冲洗，吹干50％缓冲甘油（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5）封片荧光显微镜下观察肾组织冰冻切片免疫荧光直接法染色肾组织冰冻切片吹干肾组织免疫酶标染色石蜡切片脱蜡、入水0.05％胰蛋白酶微波消化或高温高压修复抗原10％小牛血清封闭加特异性抗体（一抗）室温孵育2h，PBS冲洗加生物素（biotin）标记的抗一抗抗体，室温40′，PBS冲洗加HRP-链霉素卵白素复合物（streptoavidin），室温40′,PBS冲洗。或5~6步用Envision复合物代替，室温40′，PBS冲洗DAB-H2O2显色，镜下观察，至现棕色阳性结果，即水洗苏木素复染，水洗，吹干树胶封片（1/3树胶+2/3二甲苯）镜下观察肾组织免疫酶标染色石蜡切片脱蜡、入水结果判断肾小球观察并计录切片中所有肾小球中阳性细胞总数，再以此总数除以每份切片中肾小球个数，得出每个肾小球内阳性细胞相对平均值，分别记录球内阳性细胞最高、最低值肾间质10×目镜中加25格测微器，在40×高倍镜下，参照血球计数板算得每平方毫米内阳性细胞数肾小管分别计数皮、髓质各50个肾小管，求其百分数结果判断肾小球肾活检标本电子显微镜超薄切片制备技术

肾活检标本电子显微镜超薄切片制备技术制备技术取材固定脱水浸透包埋切片染色……制备技术取材取材快争取在穿刺组织取出后0.5′内固定（保持生活状态）小组织块大小<1mm3（固定液对组织穿透力弱）准合格的电镜标本应有≥1个肾小球（注意取材准确性）取材快取材低温操作避免组织自溶（停止血供组织和细胞内各种酶活力变化）需在0~4℃操作（夏季将组织放冰块上），所用器械应先预冷避免拉伤牵拉和挤压组织直接影响观察效果（选锋利器械取材），操作时勿牵拉或挤压组织取材低温操作取材步骤将蜡板置冰块上，滴上冷（4℃）的电镜固定液（3.75%的冷戊二醛），将肾组织迅速置蜡板上固定液中，锋利刀片切成1mm3小块，移入小瓶中，确保组织块全部浸没在固定液中，加盖，4℃固定取材步骤固定固定方式（物理和化学固定）生物组织和细胞的固定多选化学方法一定的化学试剂和细胞内蛋白质发生化学结合形成交联，稳定蛋白质，保存脂肪、糖类、藉此来固定细胞结构，尽可能保存细胞活体状态时超微结构细节固定固定方式（物理和化学固定）固定固定剂的选择理想的固定剂应具备：能迅速、均匀地渗入到组织内部；较好的稳定各种结构成分；保存一定的酶活力；不使细胞收缩或膨胀；无人工假象，保证电镜图象真实性固定剂的pH值，渗透压及电解质也与其固定效果有直接的关系固定固定剂的选择固定常用固定剂戊二醛（glutaraldehydeC5H8O2）组织结构细腻，成份丧失少。其结构式为O-CH-CH2-CH2-CH2-CH-O，一般配成3.75%的溶液（pH7.2~7.4）置4℃冰箱中备用，标本固定时间4℃2h主要优点组织穿透力较强、较快与细胞亲和力强，对糖原、核蛋白，尤其微管、内质网等细胞膜结构有较好的固定作用能保存某些酶活性，适于行细胞化学研究在其冷溶液中组织块可保存数周至数月，微细结构无改变缺点无“电子染色”作用，单独固定的标本反差很弱对脂质作用很差，脱水后大部分脂质被抽取不影响细胞渗透压，故对缓冲液渗透压要求高固定常用固定剂固定常用固定剂锇酸（osmiumtetroxideOSO4）又称四氧化锇。淡黄色结晶体，水溶液中性，具强挥发性和毒性。是贵重、优良的电镜标本固定剂（后固定）。固定时间因组织不同而异，一般1~2h/4℃锇酸主要优点强氧化剂，对氮具很强亲和力，几乎能和所有细胞成份结合，保存细胞微细结构能与不饱和脂肪酸结合，形成脂肪-锇酸复合物（唯一能固定脂类的固定剂）较好地保存核蛋白密度高，产生良好的电子反差，弥补戊二醛固定的不足对缓冲液要求不严格固定时间合适时，固定组织不变硬、变脆及收缩和膨胀，便于超薄切片固定常用固定剂固定常用的固定剂锇酸（osmiumtetroxideOSO4）锇酸缺点分子较大，渗透力弱，组织块若>1mm3，固定效果差，引起固定不均匀对糖原、核酸及微管固定差，不适行细胞化学工作标本长时停留在固定液中组织变脆，造成切片困难挥发性和毒性大，对人体有害固定常用的固定剂固定双固定法多用戊二醛作前（预）固定，锇酸后固定固定液用量一般为标本的40倍醛类和锇酸混合后会起氧化还原反应，形成还原锇沉淀。因此，标本经戊二醛作固定后必须磷酸缓冲液充分浸泡清洗固定双固定法固定其他固定液4%多聚甲醛经济、易得、不受条件限制，固定效果接近戊二醛高锰酸钾磷脂类固定效好，适于保存细胞膜结构常规肾穿组织一般不采这两种固定液固定其他固定液固定的步骤常规用3.75%冷戊二醛作预固定4℃固定2h或过夜0.1mol/L的磷酸缓冲液充分清洗后1%锇酸后固定一般4℃固定1.5~2h固定的步骤常规用3.75%冷戊二醛作预固定脱水一般用梯度浓度的乙醇或丙酮脱水脱水液量与组织块比>20:1倍，室温操作脱水后包埋前可加入环氧丙烷（propyleneoxide）作中间溶剂（便于包埋剂渗透）可在70%乙醇脱水过程中加醋酸铀行组织块染（提高样品反差）脱水一般用梯度浓度的乙醇或丙酮脱水脱水丙酮脱水，由低浓度始，逐渐增加浓度30%、50%、70%、90%、100%逐渐递增，每级10~15′纯丙酮脱水45′（每15′换液1次）脱水应充分，否则包埋剂浸透不全、聚合不好等，影响切片质量脱水丙酮脱水，由低浓度始，逐渐增加浓度浸透、包埋及聚合理想的包埋剂粘度较低，易渗入组织，与组织不起化学反应，能溶于脱水剂聚合均匀、充分，不产生体积收缩软、硬度适中，易切片透明度好，不产生前景反应材料来源丰富，操作简便多用环氧树脂Epon812浸透、包埋及聚合理想的包埋剂浸透、包埋及聚合配制包埋剂注意事项配制成分准确无误，尤其DMP-30搅拌充分，依次按时加入；需缓慢加入DMP-30，至少搅拌10′使其充分混合加硬化剂时勿加温，以免提早聚合操作时注意防潮（相对湿度<40%），在密闭操作箱内进行，避免包埋介质混浊，聚合不匀，硬度和弹性不当等浸透、包埋及聚合配制包埋剂注意事项浸透、包埋及聚合浸泡、包埋、聚合浸泡脱水后的标本，移入包埋剂与纯丙酮（1:1）>30′再移入2:1丙酮中3h→纯包埋剂3h包埋取药用透明胶囊（1号或2号、内放标本号），烤干，注入包埋剂，置样品于胶囊中（样品逐渐下沉胶囊底部），移入37℃烤箱（12~24h）→45℃12h→60℃12~24h聚合聚合好的胶囊微黄（棕）色、透明、均匀、无气泡；组织块胶囊底中心浸透、包埋及聚合浸泡、包埋、聚合修块定位修块样品夹固定包埋块，解剖显微镜下修去顶部及周围包埋剂，暴露组织，组织块修成上下边缘平行（梯形、长方形或正方形等）四面锥体组织块表面平整，大小约1mm2，切去一角留作记号，以便定位修块定位修块修块定位定位电镜仅能观察某（几）个细胞形态及内部微细结构，超薄切片亦只能切0.04~0.09mm2大小，故定位重要肾穿刺组织定位如定不到肾小球则影响诊断修块定位定位修块定位步骤用超薄切片机将修好的包埋块切成0.5~1mm的薄切片甲苯胺兰染色、光镜观察选合适的小球及病变部位，修去多余组织（选锋利刀片修，组织边要直，角要锐，便于超薄切片）甲苯胺兰染色：0.5%甲苯胺兰水溶液染色约1′（可加温，见水汽停），水洗，镜下定位修块定位步骤超薄切片载网与支持膜载网具透明支持膜的铜网，圆形，直径多为3mm，网孔50~300目不等，有正方形、圆形、单孔，依试验不同自行选择多用Formvar（聚乙烯醇缩甲醛）支持膜（机械强度和透明度好）另有火棉及碳膜（更坚固）、微筛膜等，各有所长切片是样品制备过程中技术性较强的一环超薄切片载网与支持膜切片是样品制备过程中技术性较强的一环超薄切片切片刀玻璃刀厚70-90nm，硬度适宜；用专门的制刀机制刀（干净，角度合乎标准，刀口锐利等），玻璃刀的优劣直接影响超薄切片质量钻石刀更优良，可切出40-90nm的切片，使用寿命长，但价格昂贵超薄切片切片刀超薄切片超薄切片机多种型号，瑞典LeicaEMUC6型超薄切片机多用，用途广（半薄和超薄切片，控制切片厚度50~200nm，依需要自动控制，切出厚度均匀的连续切片带）超薄切片超薄切片机超薄切片超薄切片超薄切片质量与玻璃刀、架刀角度、收集槽液面、组织块硬度、组织固定、脱水、包埋过程及包埋块修整，切片机性能和操作者的责任心等因素有密切关系操作基本过程：开机-固定组织块→架刀→手动修块→注水槽→自动连续切片→收集片→捞片超薄切片厚度50~70nm，切片越薄，分辨率越高，对比度则越低切片环境温度20℃、湿度<60%为佳超薄切片超薄切片超薄切片超薄切片切片厚度由干涉色估计，其颜色与厚度的关系如下干涉色切片厚度（nm）灰色<50银白色50~70

金黄色70~90紫色>90选灰色和银白色的切片捞于有膜铜网（或镍网）（支持膜厚约10~20nm，无结构，耐电子轰击，不起化学反应）超薄切片超薄切片染色染色要求理想染色剂能增强反差选择性地使重金属常沉淀在一定部位保持微细结构的完整性不与固定剂发生不良反应室温和正常大气情况下，配制简单，操作方便，染色均匀目前采用的是醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，以达互补作用染色染色要求目前采用的是醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，以达互染色D又称醋酸双氧铀，结构式UO2（CH3COO）2.2H2O，它可和大多数细胞成份结合，易与核糖核酸颗粒反应，降低组织类脂提取PH值影响醋酸铀结合到生物各种基质上的能力，pH>3.5时，双氧铀离子对DNA的亲和力增加染色D染色柠檬酸铅密度很大，对各种细胞都有亲和力，可提高反差铅盐与核蛋白和糖原结合，几乎浸染所有细胞成份，提高切片反差暴露空气易形成不溶性碳酸铅，染液混浊、切片污染（钠石灰置操作箱中，吸收CO2避免污染）染色柠檬酸铅染色柠檬酸铅液配制高纯度或AR、GR的硝酸铅1.33g，柠檬酸钠［Na3（C6H5O7）.2H2O］1.76g，加双蒸水30ml置50ml量瓶内混合，摇1′，间隔再摇，试剂全部溶解呈乳白色再加8ml1NNaOH（NaOH须新鲜配制），摇之使乳白色液清亮再加双蒸水至总量50ml，必要时可过滤染色柠檬酸铅液配制染色染色步骤取一蜡板，滴饱和醋酸铀上清（纯水或70%乙醇配制均可）切片的铜网面靠在液面，室温15~30′或更长双蒸水洗净铀液，滤纸吸干再置另一滴柠檬铅液蜡板，室温5~15′双蒸水洗净，滤干，置干净培皿，备用染色染色步骤注意事项要求试剂纯度高（AR级或GB级）器皿清洁，以免污染锇酸易挥发，应在通风橱中操作（其蒸汽有剧毒，对眼、鼻粘膜刺激）注意防护、避免皮肤破损铅是重金属，铀有放射性DMP-30为剧毒品环氧树脂有致癌性应在干燥箱中操作，以保持聚合块干燥（尤其Epon812）注意事项要求试剂纯度高（AR级或GB级）判断电镜标本固定良好的标准部位标准细胞膜低倍下呈完整清晰的单层结构，高倍下见双层结构核膜内外膜完整，基本平行，可见核孔线粒体饱满，外膜完整光滑，内嵴连续，内、外膜间保持一定距离，没有肿胀或收缩粗面内质网内质网池完整，膜上核糖体可辨，没有脱落或丢失滑面内质网呈分枝小管状或泡状，膜完整高尔基复合体扁平囊成堆叠排列，膜完整核内含物核仁、核液及染色质保存完好，层次清楚可辨糖原颗粒致密，保存良好，没有丢失细胞质基质呈精细颗粒状，分布均匀，未见明显的空白区判断电镜标本固定良好的标准部位标准细胞膜低倍下呈完整清晰的单小结按指南要求安全开展肾活检确保取材符合要求技术工作是正确诊断的保证小结按指南要求安全开展肾活检谢谢！谢谢！经皮肾活检术陈惠萍南京军区南京总医院全军肾脏病研究所经皮肾活检术陈惠萍经皮肾活检术最直接的诊断方法自体肾或移植肾病理诊断了解疾病发生、发展及转归指导治疗及判断预后临床研究的重要途径经皮肾活检术最直接的诊断方法肾活检方法的沿革开放式肾活检（openrenalbiopsy）直视下负压式肾活检经皮肾活检（percutaneousrenalbiopsy）经典经皮肾活检为负压吸引法（肝穿活检术基础发展）半自动穿刺枪……肾活检方法的沿革开放式肾活检（openrenalbiop适应证弥漫性肾实质损害原发或继发性肾小球疾病肾小管间质疾病肾血管性疾病遗传、先天等疾病病因、病变程度、治疗和预后等未解决或不明确者……适应证弥漫性肾实质损害适应证肾病综合征肾炎综合征急进性肾炎综合征各类持续性无症状尿检异常（蛋白尿和/或镜下血尿）非单纯肾后（梗阻）因素导致的急性肾功能减退非单纯肾后（梗阻）因素导致的慢性肾功能减退肾体积未萎缩（B超肾长经：男性≥90mm，女性≥85mm）正常结构尚未完全消失适应证肾病综合征适应证移植肾肾活检各类非外科因素导致的移植肾肾功能减退、肾功能延迟恢复、疑及存在肾小管坏死、药物性肾中毒、慢性排斥反应及复发、新生或带入的疾病适应证移植肾肾活检禁忌证出血倾向和/或凝血功能障碍者活动性感染性疾病急性肾盂肾炎、肾脓肿、肾结核等多囊肾孤立肾较大的肾肿瘤肾萎缩的慢性肾功能不全禁忌证出血倾向和/或凝血功能障碍者禁忌证大量腹水未能控制的高血压或低血压未纠正的严重贫血（Hb≤80g/L）精神疾病或不能配合者禁忌证大量腹水操作步骤患者准备消除其顾虑，争取最佳配合（解释肾活检的必要性及安全性，简要说明操作过程）交待相关注意事项，必须取得书面同意（告知肾活检可能引起的各类并发症）操作步骤患者准备操作步骤术前检查测血压>2次高血压者积极控制血压仔细检查全身皮肤粘膜出血倾向选择、处理进针部位局部皮肤（备皮等）重点常规检查血常规、出血时间、凝血时间（试管法）、凝血酶原时间、血块收缩时间及血浆纤维蛋白原浓度操作步骤术前检查操作步骤患者准备抗凝治疗者术前停药>3d，复查凝血指标术前行双肾B超了解肾脏图象、确定穿刺部位受检者术前12~24h内排便剧烈性咳嗽、腹痛及腹泻，推迟肾活检操作步骤患者准备操作步骤患者准备女性应避开经期（非急诊肾活检）肾衰者术前加强透析（CBP）控制血压在理想范围焦虑及不合作者酌情用镇静剂可能发生出血并发症者术前维生素K及止血药操作步骤患者准备操作步骤器械及药品准备穿刺针：国内较多中心采用负压吸引法，18号负压穿刺针（Menghini穿刺针）负压吸引装置：20ml注射器联接管、针卡深度固定卡长度测量尺等依B超测得皮肾距离选择穿刺针长度操作步骤器械及药品准备依B超测得皮肾距离选择穿刺针长度操作步骤器械及药品准备穿刺针：其他活检针有Framklin-Vim-silverance针或Tru-cut针。视操作者及单位经验确定是否选用半自动穿刺枪Tru-Cut肾活检穿刺针操作步骤器械及药品准备Tru-Cut肾活检穿刺针操作步骤选择B超探头及穿刺针固定器可选矩阵或扇形探头，穿刺针与固定器相匹配（固定器能将进针途径调整至合适的角度）术前消毒探头及固定器（因B超定位及深度测定准确，现无需探测针预定位）皮肤消毒液：1%普鲁卡因或2%利多卡因局麻高温高压消毒铺巾及敷料、一次性注射器（无需皮肤切口及皮肤缝合）穿刺针不得复用操作步骤选择B超探头及穿刺针固定器操作步骤体位受检者取俯卧位，腹部肋缘下（相当于肾区位置）垫以5~10cm棉枕减少肾脏移动。双上肢置于两侧，头向一侧偏斜。平静呼吸皮肤消毒1%碘伏消毒液（>2遍），消毒范围上至肩胛下线，下至髂后上棘连线，两侧至腋后线铺巾操作步骤体位操作步骤穿刺点定位定位技术体表标记经验定位静脉肾盂造影X线定位早期B超术前定位实时B超定位与引导CT定位操作步骤穿刺点定位操作步骤测定穿刺距离B超固定架长度＋皮肾距离（B超）＋15~20mm（肾脏下移距离）+15mm（欲取组织）如：B超固定架长度＝40mm；皮肾距离＝50mm；肾脏下移距离＝20mm，欲取组织＝15mm，则穿刺距离＝120mm～125mm操作步骤测定穿刺距离操作步骤局麻皮内及沿进针途径皮下局麻将注射器造成负压的同时先进针，如无出血边退出注射针，边注射局麻药操作步骤局麻操作步骤穿刺方法针芯插入针管内穿刺针固定器的针槽及在实时B超引导下刺至肾包膜表面取出针芯，置入针卡，连接负压装置最佳穿刺（肾下极），嘱患者屏气，助手同步造负压，术者快速进针至预定深度，即刻快速拔出穿刺针（穿刺动作以手腕运动为主，幅度不易过大，过程快捷）用负压注射器中的生理盐水推出肾组织操作步骤穿刺方法操作步骤标本长度肾组织长1.0~1.5cm（标本过短肾小球数少，过长则易穿通肾脏，致包膜下血肿和/或肉眼血尿）通常1~2次取到足够肾组织合格组织应包括皮质和髓质取组织不够或空穿时可重复穿刺操作步骤标本长度操作步骤送检按要求分割肾组织及处理，即刻送检行光镜、免疫病理和电镜检查光镜10％的中性福尔马林溶液和/或升汞-苦味酸电镜3.75%的冷戊二醛免疫荧光低温生理盐水纱布特殊要求者用相应的固定液操作步骤送检操作步骤伤口处理肾穿刺术后伤口敷以纱布，胶布固定操作步骤伤口处理注意事项用手大鱼际部（或手指）在体表进针部位施压,平车送患者回病房自体肾活检者施压穿刺点1~3′移植肾活检者压迫穿刺点30′注意事项用手大鱼际部（或手指）在体表进针部位施压,平车送患注意事项小心平移患者上床，嘱平卧位，严格腰部制动4h（四肢可放松，缓慢小幅度活动，严禁翻身及扭转腰部）自体肾及移植肾活检术后均需卧床12h（如无高血压、肾功能不全等高危）因素常规监测（术后6h内）血压、脉搏、尿色、肤色、出汗情况、腰腹部症状及体征注意事项小心平移患者上床，嘱平卧位，严格腰部制动4h（四肢注意事项血压下降或肉眼血尿者应反复查血常规、血细胞比积腰腹部疼痛显著者查B超,观察有无肾包膜下血肿避免或及时处理便秘、腹泻及剧烈咳嗽禁止剧烈运动或重体力劳动（术后3周内）注意事项血压下降或肉眼血尿者应反复查血常规、血细胞比积并发症及其处理肾出血肉眼血尿及肾周血肿严重者需肾切除尿潴留腰痛不适少见并发症肾动静脉瘘感染误伤其它脏器并发症及其处理肾出血并发症及其处理血尿术后镜下血尿(绝大多数)肉眼血尿2~7％积极止血措施血细胞压积↓>6%或Hb<2g/L或血流动力学不稳定，必须补液促尿液排出，保持泌尿道通畅，防止血凝块堵塞尿道血细胞压积及Hb继续↓，及时输血、选择性肾动脉介入栓塞或外科手术控制活动性大出血并发症及其处理血尿并发症及其处理肾周血肿肾活检后3~5d低热、腰痛（B超证实）肾周小血肿卧床休息自行消散（无后遗症）较大血肿3月内吸收严重大血肿处理同严重肉眼血尿者并发症及其处理肾周血肿并发症及其处理尿潴留协助排尿或行导尿术明显肉眼血尿、尿中血凝块多者，易尿路梗阻导致严重尿潴留,应行经皮膀胱穿刺导尿或三腔导尿管导尿及反复冲洗膀胱，直至肾出血中止并发症及其处理尿潴留并发症及其处理动静脉瘘术后动静脉瘘者少数肾活检后无法解释的高血压移植肾受者活检部位闻及血管性杂音确诊多普勒超声检查或肾动脉造影多数患者1~2年内自发缓解严重者栓塞治疗（选择性肾动脉造影时采用）并发症及其处理动静脉瘘并发症及其处理肾周疼痛轻度钝痛，长时间、剧烈疼痛系血肿扩大和/或尿路梗阻术后剧烈疼痛者，或无肾周痛但双下肢内侧疼痛、或腹痛，且大量出汗者，严密观察血压、心率及时测血细胞比积及血红蛋白浓度，及时处理严重出血者并发症及其处理肾周疼痛肾活检标本的初步处理

肾活检标本的初步处理准备工作生理盐水浸透纱布（潮湿拧不出水）纱布及编号的胶布置培养皿备用清洁5ml小瓶，加光镜固定液3ml（FAA固定液：福尔马林10ml，冰醋酸5ml，95%乙醇85ml混匀），盖塞紧后备用准备工作生理盐水浸透纱布（潮湿拧不出水）准备工作清洁5ml小瓶内加冷电镜固定液3ml置冰瓶（2.5%戊二醛10ml，双蒸馏水40ml，混匀再加pH7.4PBS50ml，置冰箱内）解剖显微镜、冰瓶一个，眼科平镊两把，直尺一把，双面刀一片，蜡板一块光镜固定液小瓶常温备用、电镜固定液小瓶及培养皿均在肾穿刺术前数小时准备，置冰瓶内准备工作清洁5ml小瓶内加冷电镜固定液3ml置冰瓶（2.5%取材判断皮质组织皮髓交界组织皮质-髓质-皮质组织仅取得髓质组织则为取材不成功取材判断皮质组织取材判断判断已取组织：肾组织，肌肉、脂肪、结缔组织等用解剖显微镜或放大镜判断肾组织部位（皮质和髓质，有无肾小球），及时与术者联系肾皮质色淡，见分布不规则，朦胧的红色小点（肾小球）。随经验积累，可肉眼判定立即置肾组织于蜡板上，迅速测量其长度（cm），记录、分割，迅速固定取标本部位、量重要。如无肾小球或皮质<1cm，考虑再次穿刺取材判断判断已取组织：肾组织，肌肉、脂肪、结缔组织等标本分切法取组织长1.5cm~2.0cm最佳（1次）小镊子将组织轻置蜡板上，镜下观察、量长度锐利刀片切割组织1mm、2mm及4mm数段先供电镜标本，要求皮质1mm（肾小球1个）其次免疫病理，需组织约2mm（肾小球3~5个）余组织供光镜（肾小球>10个）标本分切法取组织长1.5cm~2.0cm最佳（1次）标本的处理免疫荧光及免疫酶标分切后的组织迅速置预冷的培养皿内的湿纱布中置冰瓶即送至恒温冷冻切片机内（<-30℃）进行包埋、切片如不能即切片，标本必须置-40℃~-70℃冰箱保存（保持抗原活性，防止抗原移位或流失），但放置时间不宜>2d标本的处理免疫荧光及免疫酶标标本的处理光镜分切后的组织平放蜡板上（勿扭曲）小镊子沾少许光镜固定液于组织表面，约30″组织稍硬后，再将整条组织放入固定液内（这样固定的组织平整、不易弯曲，便于切出完整的切片）标本的处理光镜标本的处理电镜将分切后的肾组织即浸3.75%的冷戊二醛固定液中，置冰瓶内送至电镜室标本的处理电镜注意事项短时完成观察和分切标本，注意保持肾组织湿润，切勿使其干涸解剖显微镜光源不宜太强，否则观察组织易干涸，不易看清肾小球免疫荧光用的肾组织必须避免接触固定液，尤其含酒精固定液（避免影响冰冻切片结果）；电镜和光镜固定液不得互相混淆动作轻柔夹取未固定组织，勿牵扯组织，避免人为因素造成组织细胞变形注意事项短时完成观察和分切标本，注意保持肾组织湿润，切勿使肾活检标本光镜检查的制备技术

肾活检标本光镜检查的制备技术组织固定固定液一般10％的中性福尔马林溶液升汞-苦味酸混合固定，可行常规染色、各种特殊染色和酶标抗体染色固定要求取得标本后，即平铺在小蜡板上，迅速以锋利的刀片将组织按规定分配，立即固定液固定。如用戊二醛固定，固定时间最好不超过2h；多聚甲醛固定时间稍长无妨组织固定固定液组织固定固定液配制1.脱水处理75%酒精：10′×2次90%伊红酒精：10′95%酒精：10′优质无水乙醇：10′×2次2.透明用擦镜纸将组织包好后，置氯仿10′×2次组织固定固定液配制组织固定固定液配制3.浸蜡蜡缸130′蜡缸260′4.包埋5.切片普通切片，厚度1~2mm，烤片温度60℃，10′银染切片，厚度同普通切片，烤片温度90℃，>40′组织固定固定液配制HE染色切片常规脱蜡入水苏木素染细胞核1~2′水洗后1％盐酸分化（过一下）流水冲洗，镜下观察细胞核呈兰色，其余组织呈灰色置伊红染液20′左右如基底膜偏红可在75％酒精缸中过一下酒精脱水，二甲苯透明，封片HE染色是观察组织病变与否的最基本染色HE染色切片常规脱蜡入水HE染色是观察组织病变与否的最基苏木素染液配制将苏木素溶于酒精，倾入明矾液中，混合后蒸沸，加一氧化汞1.0g，玻棒搅匀，当溶液呈深紫色时，即移入冷水中，促使冷却，静置过夜，过滤封闭保存，用前若加5％醋酸则染色更佳。一般新鲜配制时染2~5′苏木素0.9g氧化汞0.5~1.0g纯酒精10mlHAC12~13ml硫酸铝钾铵（钾明矾）20g甘油10ml/100ml蒸馏水200ml苏木素染液配制伊红酒精配制伊红溶解后，用滴管滴入醋酸使呈糊状，加数毫升蒸馏水即可，过滤，将滤出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95％乙醇200ml中，备用伊红（曙红Y）1.0g蒸馏水10ml伊红酒精配制PAS染色切片常规脱蜡入水1％过碘酸氧化15′水洗后，过蒸馏水置Schiff试剂染5~10′流水冲洗>10′（观察组织由淡红色转为玫瑰红色）苏木素淡染30″~2′水洗兰化（必要时分化）酒精脱水，二甲苯透明，封片PAS染色将肾小球基底膜、肾小管基底膜以及系膜基质染成紫红色PAS染色切片常规脱蜡入水PAS染色将肾小球基底膜、肾小管Schiff液配制蒸馏水煮沸冷却至80℃，溶入碱性品红，冷却后过滤，至50℃时加盐酸，25℃时再加偏重亚硫酸钠，暗中贮放过夜，加活性碳，摇1′后过滤，液体透明，4℃暗瓶备用碱性品红1gN盐酸20ml偏重亚硫酸钠（亚硫酸盐）1g活性碳2g蒸馏水200mlSchiff液配制PAS反应阳性物质物质种类举例物质染色结果多糖糖原强阳性糖蛋白胶原纤维、网状纤维、血清白蛋白、球蛋白强阳性基底膜肾小球基底膜、肾小管基底膜、包曼囊壁中等强度淀粉样物质淀粉样物质弱阳性各种色素脂褐素中等强度软骨

软骨强阳性霉菌曲菌强阳性PAS反应阳性物质物质种类举例物质染色结果多糖糖原强阳性糖蛋Masson三色染色切片常规脱蜡入水天青石兰染细胞核10′，水洗兰化1％醋酸水溶液1′Masson红染液10′左右1％醋酸水溶液1′0.5％亮绿，光镜下控制，肾小球基底膜变绿快速脱水（甩片），透明封片Masson三色染色将细胞核染成黑色，胞浆及胶原纤维染成蓝绿色，蛋白、免疫复合物染成桔红色Masson三色染色切片常规脱蜡入水Masson三色染色Masson红染液配制变色酸2R（Chicmolocps2R）0.6g亮绿SF0.3g蒸馏水100ml磷钨酸0.8g冰醋酸1.0mlMasson红染液配制Masson三色染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜强阳性：蓝绿色系膜基质强阳性：蓝绿色免疫复合物红色淀粉样物质淡染的蓝绿色胶原及纤维组织蓝绿色Masson三色染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：PAM染色切片常规脱蜡入水脱汞：30％含碘（3％）酒精5′脱碘：5％硫代硫酸钠5′蒸馏水冲洗7~8次六胺银染色，75℃，30~45′，镜下观察蒸馏水冲洗3％硫代硫酸钠2~5′清水冲洗1％醋酸中过一下混合红1h1％醋酸水洗1％淡绿，镜下控制快速脱水（甩片），透明封片PAM染色切片常规脱蜡入水六胺银液配制：用时现配预温蒸馏水23ml5%硼砂4.5ml4%硼酸0.2~0.4ml15%六次甲基四胺6ml10%硝酸银0.7~0.75ml混合红液配制：Masson染液中加少许1%酸性品红，比例需染片后定六胺银液配制：用时现配PASM染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜强阳性：黑色系膜基质强阳性：黑色免疫复合物红色淀粉样物质不嗜银PASM染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基MSB染色切片脱蜡入水用苏木素染细胞核水冲洗分化核（试剂：分化液中含0.25%盐酸，70%酒精）水冲洗过95%酒精，然后0.5%马休黄染2′，染液含：0.5%马休黄（martiusyellow），95%酒精，2%磷钨酸蒸馏水洗，然后1%丽春红6R（brilliantcrystalscarlet）染10′（试剂内含：1%丽春红6R，2.5%醋酸）蒸馏水冲洗，再1%磷钨酸作固定分化红色染料5′0.5%苯胺兰（solubleblue）染10′（试剂含：0.5%苯胺兰，1%醋酸）1%醋酸洗，吸干，纯酒精脱水，二甲苯透明，封片细胞核呈黑色；红细胞呈黄色；蛋白呈红色；结缔组织呈兰色MSB染色切片脱蜡入水细胞核呈黑色；红细胞呈黄色；蛋白呈高锰酸钾-碱性刚果红染色切片脱蜡入水高锰酸钾-硫酸混合液处理3′，水洗，试剂含：5%高锰酸钾0.3%硫酸，用时现配，等量混合5%草酸3′，水洗苏木素染核2′，水洗，兰化碱性刚果红液10~20′（试剂含：1%NaOH0.3ml，80%酒精氯化钠刚果红饱和溶液30ml）快速纯酒精脱水，透明，封片注意：切片厚度5m高锰酸钾-碱性刚果红染色切片脱蜡入水肾活检标本免疫化学及免疫荧光染色制备技术

肾活检标本免疫化学及免疫荧光染色制备技术免疫化学染色试剂PBS：0.01mol/L（pH7.4用于稀释抗体，冲洗切片）A液0.2mol/LNa2HPO4：Na2HPO412H2O35.82g/500mlDW（蒸馏水）B液0.2mol/LNaH2PO4.Na2HPO412H2O15.6g/500mlDWA液40.5ml，B液9.5ml，加8.8gNaCl，DW稀释至1000ml免疫化学染色试剂PBS：0.01mol/L（pH7.免疫化学染色试剂PBS缓冲液0.15mol/L（pH7.2）Na2HPO4·12H2O96.695gKH2PO47.145gNaCl10.625gDW溶解至5000ml免疫化学染色试剂PBS缓冲液0.15mol/L（pH7.免疫化学染色试剂Tris-Hcl缓冲液0.05mol/LpH7.60.2mol/LTris250ml＋

0.1mol/LHcl389ml，再加DW至1000ml三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.2mol/L：24.3g＋DW液至1000mlHcl0.1mol/L：浓Hcl8.8ml＋DW至1000ml免疫化学染色试剂Tris-Hcl缓冲液0.05mol/L免疫化学染色试剂DAB-H2O2显色液DAB3mg＋0.05mol/LTris-Hcl（pH7.6）缓冲液5ml＋8ml3%H2O2，充分混匀，用前配制免疫化学染色试剂DAB-H2O2显色液免疫化学染色试剂苏木素染液苏木素1g无水酒精10ml钾明矾（硫酸铝钾）15g蒸馏水200ml氧化汞0.5g冰醋酸10ml甘油10ml/500ml先溶解明矾，再将苏木素溶于酒精倾入明矾液，混匀后煮沸，加氧化汞0.5g，玻棒搅至深紫色即移入冷水，静置过夜，过滤＋甘油密封保存，用时加冰醋酸免疫化学染色试剂苏木素染液肾组织冰冻切片免疫荧光直接法染色肾组织冰冻切片吹干加适当稀释度抗体-FITC（IgG、IgA、IgM、C3、C4、Clq……），置湿盒避光室温40′取出后流水冲洗，吹干50％缓冲甘油（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5）封片荧光显微镜下观察肾组织冰冻切片免疫荧光直接法染色肾组织冰冻切片吹干肾组织免疫酶标染色石蜡切片脱蜡、入水0.05％胰蛋白酶微波消化或高温高压修复抗原10％小牛血清封闭加特异性抗体（一抗）室温孵育2h，PBS冲洗加生物素（biotin）标记的抗一抗抗体，室温40′，PBS冲洗加HRP-链霉素卵白素复合物（streptoavidin），室温40′,PBS冲洗。或5~6步用Envision复合物代替，室温40′，PBS冲洗DAB-H2O2显色，镜下观察，至现棕色阳性结果，即水洗苏木素复染，水洗，吹干树胶封片（1/3树胶+2/3二甲苯）镜下观察肾组织免疫酶标染色石蜡切片脱蜡、入水结果判断肾小球观察并计录切片中所有肾小球中阳性细胞总数，再以此总数除以每份切片中肾小球个数，得出每个肾小球内阳性细胞相对平均值，分别记录球内阳性细胞最高、最低值肾间质10×目镜中加25格测微器，在40×高倍镜下，参照血球计数板算得每平方毫米内阳性细胞数肾小管分别计数皮、髓质各50个肾小管，求其百分数结果判断肾小球肾活检标本电子显微镜超薄切片制备技术

肾活检标本电子显微镜超薄切片制备技术制备技术取材固定脱水浸透包埋切片染色……制备技术取材取材快争取在穿刺组织取出后0.5′内固定（保持生活状态）小组织块大小<1mm3（固定液对组织穿透力弱）准合格的电镜标本应有≥1个肾小球（注意取材准确性）取材快取材低温操作避免组织自溶（停止血供组织和细胞内各种酶活力变化）需在0~4℃操作（夏季将组织放冰块上），所用器械应先预冷避免拉伤牵拉和挤压组织直接影响观察效果（选锋利器械取材），操作时勿牵拉或挤压组织取材低温操作取材步骤将蜡板置冰块上，滴上冷（4℃）的电镜固定液（3.75%的冷戊二醛），将肾组织迅速置蜡板上固定液中，锋利刀片切成1mm3小块，移入小瓶中，确保组织块全部浸没在固定液中，加盖，4℃固定取材步骤固定固定方式（物理和化学固定）生物组织和细胞的固定多选化学方法一定的化学试剂和细胞内蛋白质发生化学结合形成交联，稳定蛋白质，保存脂肪、糖类、藉此来固定细胞结构，尽可能保存细胞活体状态时超微结构细节固定固定方式（物理和化学固定）固定固定剂的选择理想的固定剂应具备：能迅速、均匀地渗入到组织内部；较好的稳定各种结构成分；保存一定的酶活力；不使细胞收缩或膨胀；无人工假象，保证电镜图象真实性固定剂的pH值，渗透压及电解质也与其固定效果有直接的关系固定固定剂的选择固定常用固定剂戊二醛（glutaraldehydeC5H8O2）组织结构细腻，成份丧失少。其结构式为O-CH-CH2-CH2-CH2-CH-O，一般配成3.75%的溶液（pH7.2~7.4）置4℃冰箱中备用，标本固定时间4℃2h主要优点组织穿透力较强、较快与细胞亲和力强，对糖原、核蛋白，尤其微管、内质网等细胞膜结构有较好的固定作用能保存某些酶活性，适于行细胞化学研究在其冷溶液中组织块可保存数周至数月，微细结构无改变缺点无“电子染色”作用，单独固定的标本反差很弱对脂质作用很差，脱水后大部分脂质被抽取不影响细胞渗透压，故对缓冲液渗透压要求高固定常用固定剂固定常用固定剂锇酸（osmiumtetroxideOSO4）又称四氧化锇。淡黄色结晶体，水溶液中性，具强挥发性和毒性。是贵重、优良的电镜标本固定剂（后固定）。固定时间因组织不同而异，一般1~2h/4℃锇酸主要优点强氧化剂，对氮具很强亲和力，几乎能和所有细胞成份结合，保存细胞微细结构能与不饱和脂肪酸结合，形成脂肪-锇酸复合物（唯一能固定脂类的固定剂）较好地保存核蛋白密度高，产生良好的电子反差，弥补戊二醛固定的不足对缓冲液要求不严格固定时间合适时，固定组织不变硬、变脆及收缩和膨胀，便于超薄切片固定常用固定剂固定常用的固定剂锇酸（osmiumtetroxideOSO4）锇酸缺点分子较大，渗透力弱，组织块若>1mm3，固定效果差，引起固定不均匀对糖原、核酸及微管固定差，不适行细胞化学工作标本长时停留在固定液中组织变脆，造成切片困难挥发性和毒性大，对人体有害固定常用的固定剂固定双固定法多用戊二醛作前（预）固定，锇酸后固定固定液用量一般为标本的40倍醛类和锇酸混合后会起氧化还原反应，形成还原锇沉淀。因此，标本经戊二醛作固定后必须磷酸缓冲液充分浸泡清洗固定双固定法固定其他固定液4%多聚甲醛经济、易得、不受条件限制，固定效果接近戊二醛高锰酸钾磷脂类固定效好，适于保存细胞膜结构常规肾穿组织一般不采这两种固定液固定其他固定液固定的步骤常规用3.75%冷戊二醛作预固定4℃固定2h或过夜0.1mol/L的磷酸缓冲液充分清洗后1%锇酸后固定一般4℃固定1.5~2h固定的步骤常规用3.75%冷戊二醛作预固定脱水一般用梯度浓度的乙醇或丙酮脱水脱水液量与组织块比>20:1倍，室温操作脱水后包埋前可加入环氧丙烷（propyleneoxide）作中间溶剂（便于包埋剂渗透）可在70%乙醇脱水过程中加醋酸铀行组织块染（提高样品反差）脱水一般用梯度浓度的乙醇或丙酮脱水脱水丙酮脱水，由低浓度始，逐渐增加浓度30%、50%、70%、90%、100%逐渐递增，每级10~15′纯丙酮脱水45′