NDDSChina2012生物制药注射剂的开发与确证方伟杰课件

生物制药注射剂的开发与确证新型给药系统中国峰会20122012.10.24方伟杰，博士海正药业生物分析与制剂研究室主任Email:wjfang@生物制药注射剂的开发与确证新型给药系统中国峰会20121主要内容生物制药的特性生物制剂的开发的关键因素物理、化学、生物学性质物理、化学降解的作用机理及抑制制剂分析方法的开发制剂破坏条件的选择辅料的选择和优化海正药业生物制剂的开发实例：HS016总结主要内容生物制药的特性2生物制药的特性由重组技术制备的生物制品如蛋白质、单抗、疫苗等结构，组分复杂蛋白质大分子（5

-160

KDa）1’,2’,3’和4’结构复杂混合物，如翻译后修饰等特异性：每个生物药物有不同的性质，如分子量、溶解度、pI、亲水性、高级结构、生物学性质等化学和物理降解化学降解：涉及共价键的断裂和生成，比如脱酰胺化（deamidation），水解（hydrolysis），氧化（oxidation）物理降解：不涉及共价键的断裂和生成，主要是高级结构的变化，包括吸附，变性（去折叠），聚集和沉淀生物制药的特性由重组技术制备的生物制品如蛋白质、单抗、疫苗等3生物制药的特性（二）免疫原性Immunogenicity所有生物制药都有潜在的免疫原性！免疫反应的频率很多因素有关：氨基酸序列、质量（如多聚体、糖基化）、病人状况、给药频率、途径产生的后果差异很大：安全性（如过敏反应），疗效（如产生中和抗体neutralizationantibody），代谢等生物制药的特性（二）免疫原性Immunogenicity4影响生物制药稳定性的因素生物分子的结构（氨基酸序列、翻译后修饰，分子内与分子间作用力）制剂，如蛋白浓度，pH，辅料等生产设施、工艺/过程原材料，如辅料、包材的质量等影响生物制药稳定性的因素生物分子的结构（氨基酸序列、翻译5如何确定生物制剂？了解生物药物的目标产品性质（TargetProductProfile，TPP）了解物理、化学、生物学性质及降解机理开发有效的分析及稳定性检测方法鉴别出主要的降解条件运用筛选（screening）和实验设计（DOE）的原理来评估制剂因素及它们之间的相互作用鉴别出候选制剂进行全方位的研究并最终确定如何确定生物制剂？了解生物药物的目标产品性质（Target6目标产品性质（TPP）给药途径（静脉，皮下，肌肉）剂型（水针、冻干）单次或者多次使用(single-/multiple-dose)生物药物的浓度治疗指数、安全性大小给药的频率，是否需要在医院使用市场竞争的情况，新制剂的优点目标产品性质（TPP）给药途径（静脉，皮下，肌肉）7生物药物的物理、化学性质物理、化学性质可以通过软件进行初步估算Mw、溶解度、pI、EC280、hydrophobicity、高级结构等以往的经验（如文献、其他类似分子等）物理、化学性质需要通过分析进行确认确认上述基本信息热稳定性（Tm，Tagg等）多聚体翻译后修饰（PTM）如糖基化，脱酰胺化等生物药物的物理、化学性质物理、化学性质可以通过软件进行初步估8化学降解-脱酰胺化Deamidation天冬氨酸异天冬氨酸天冬酰胺琥珀酰亚胺化学降解-脱酰胺化Deamidation天冬氨酸异天冬氨酸天9化学降解-水解Hydrolysis酸性裂解Acidiccleavage(Asp-Pro)抗体Hinge部位裂解抑制脱酰胺化和水解反应的方法冻干优化pH，缓冲液种类和浓度增加物理/构象稳定性化学降解-水解Hydrolysis酸性裂解Acidic10化学降解-氧化Oxidation主要在Met、Cys和芳香基氨基酸上，比如Tyr，Trp三大类型金属离子催化氧化反应自由基氧化反应光催化氧化反应抑制氧化反应方法螯合剂（如EDTA）自由基清除剂/抗氧化剂(如MetandTrp)避光保存排除氧气增加物理稳定性化学降解-氧化Oxidation主要在Met、Cys和芳香11化学降解-其他类型N-端环化如pGlu和DKP反应消旋化和β消除反应（racimization，β-elimination）还原性糖基化（glycation）二硫键错配（disulfidescrambling）化学降解-其他类型N-端环化如pGlu和DKP反应12化学性质分析方法化学性质/降解途径分析方法分子量凝胶电泳（SDS），质谱（MS）氨基酸序列Edman降解,LC-MS纯度凝胶电泳（SDS），反相色谱（RPC），分子排阻色谱（SEC），离子交换色谱（IEC），毛细管电泳（CE）电性分布及变化等点聚焦（IEF），IEC,CE脱酰胺化反应IEC，RPC（多肽），LC-MS水裂解反应RPC，SDS，LC-MS氧化反应RPC，肽图，LC-MS共价键结合多聚体SDS，MS化学性质分析方法化学性质/降解途径分析方法分子量凝胶电泳（S13物理降解：吸附在表面造成蛋白剂量的损失和构型的改变液-固表面：吸附到包材的容器壁、胶塞液相柱子、过滤器冰-水表面外来异物，包材的渗出物等液-气表面容器的空气（headspace），震荡、搅拌时与空气的接触物理降解：吸附在表面造成蛋白剂量的损失和构型的改变14物理降解：变性/去折叠二级等高级结构的变化维持天然结构的重要性天然构象是保持生物学活性的基础变性蛋白更容易造成毒副作用如免疫原性变性以后容易发生聚集等后续反应生物药物构象不稳定性的根源变性所需要的能量很低(30kcal/mol)物理降解：变性/去折叠二级等高级结构的变化15物理降解：聚集Aggregation蛋白质分子通过相互作用聚集在一起蛋白变性（构象改变）相互吸附（胶体不稳定性）分类可逆/不可逆聚集（reversible/irreversible）类似天然构象的聚集/完全变性的聚集（native-like？）共价结合/非共价结合聚集covalent/non-covalent可溶性/不溶性聚集soluble/insoluble(precipitation)物理降解：聚集Aggregation蛋白质分子通过相互作用聚16可见与不可见微粒

Visibleandsub-visibleparticles微粒的危害免疫反应！死亡，产生中和抗体堵塞血管，降低疗效，毒性微粒的分类外源性/非蛋白微粒蛋白聚集微粒微粒无处不在，每一步操作都会产生/带入微粒！微粒的检测肉眼外观检测光阻法(Lightobscuration）Micro-FlowImaging（MFI），

Coultercounter动态光散射（DLS），Nanosight，

AffinityBiosensor，TEMCarpenteretal.JPharmSci,2009,27,1201可见与不可见微粒

Visibleandsub-visib17物理稳定性影响因素加热pH,盐（疏水）表面震荡,剪切力光照冻融化学试剂(金属离子,表面活性剂,防腐剂,有机溶剂等)物理稳定性影响因素加热18物理稳定性分析方法物理性质分析方法热稳定性Tm：DSC，圆二色光谱（CD）/荧光Tagg：DLS构象改变二级：远紫外圆二色光谱（Far-UVCD），红外（IR）三级：近紫外圆二色光谱（Near-UVCD），荧光（Fluorescence），2D-UV，NMR，X-ray可溶性聚集SEC，MALS-SEC，超高速离心仪（AUC）不溶性聚集（微粒）肉眼，光阻法，MFI，DLS物理稳定性分析方法物理性质分析方法热稳定性Tm：DSC，圆19增加物理稳定性的方法增加蛋白质的天然构象稳定性加入“选择性排除（preferentiallyexcluded）”的辅料，如糖类，氨基酸，PEG等加入与天然构象结合的配体增加蛋白溶液的胶体稳定性，如改变其表面的电性分布加入表面活性剂如吐温20或80与蛋白竞争表面吸附抑制蛋白-蛋白疏水基团的相互作用增加物理稳定性的方法增加蛋白质的天然构象稳定性20生物制剂开发的降解条件加热（25-40C，小于Tm10C以上）冻融（Freeze-Thaw）光照（Photo-degradation）震荡（Agitation）生物制剂开发的降解条件加热（25-40C，小于Tm1021辅料的筛选原则：每个辅料及使用的量都要有明确被证明的作用！缓冲液，如磷酸、柠檬酸、组氨酸缓冲液表面活性剂，如吐温20或80结构保护剂，如糖类，氨基酸，PEG等等渗剂，如氯化钠抗氧化剂，如EDTA，蛋氨酸配体，如金属离子赋形剂，如甘氨酸、甘露醇防腐剂，如苯甲醇辅料的筛选原则：每个辅料及使用的量都要有明确被证明的作用！22海正生物制剂研发实例-HS016重组全人源化单克隆抗体治疗人类自身免疫疾病原研药在国际上的年销售>50亿美元国内还未有仿制药上市水剂、预灌封注射器海正生物制剂研发实例-HS016重组全人源化单克隆抗体23制剂前研究（Preformulation）原液储存方法：冷冻（-80C）VS低温（5C）原液冻（-80C）、融（室温）6次不影响质量低温保存条件下有大量的多聚物产生pH和盐浓度的影响最佳pH约为5.2-6.0左右盐（NaCl）在原处方中只起到等渗剂的作用强氧化（H2O2）的影响强氧化剂不会对蛋白产生明显的破坏：不需加入抗氧化剂或螯合剂制剂前研究（Preformulation）原液储存方法：冷冻24制剂的优化和确认根据原研制剂和处方前的研究数据为基础常见保护剂的影响：多糖、氨基酸、多元醇热稳定性：DSC、DLS强降解条件高温、冻融、震荡、光照降解产物分析纯度：SEC，SDS不溶性微粒：肉眼外观、光阻法、MFI生物学活性制剂的优化和确认根据原研制剂和处方前的研究数据为基础25原、新制剂热稳定性比较-TmDSC用于比较融化温度（Tm）的差异处方Tm1

（oC）Tm2

（oC）Tm3

（oC）原制剂74.2080.9686.14新制剂75.2381.7387.09融化温度Tm是指50%分子发生变性的温度，有三个数值说明有三个主要变化区域原、新制剂热稳定性比较-TmDSC用于比较融化温度（Tm）的26原、新制剂热稳定性比较-TaggDLS比较开始发生明显聚集的温度（Tagg）原、新制剂热稳定性比较-TaggDLS比较开始发生明显聚集的27高温加速稳定性（40C,2W）：1、SEC新制剂要明显好于原研制剂：单聚体和可溶性蛋白损失差别非常明显高温加速稳定性（40C,2W）：1、SEC新制剂要明显好28SEC杂质峰面积变化情况SEC杂质峰面积变化情况292、还原型SDS主要产生分子量为<20KDa和40KDa的杂质新制剂的杂质要明显少于原制剂2、还原型SDS主要产生分子量为<20KDa和40303、不溶性微粒（光阻法）新制剂不溶性微粒要明显少于原研制剂3、不溶性微粒（光阻法）新制剂不溶性微粒要明显少于原研制剂31HS016制剂研发小结HS016单抗新制剂明显优于原研药制剂更高的热稳定性（Tm、Tagg）在高温储存、冻融、震荡和光照等破坏条件下都有更高的稳定性表现在多聚体含量、杂质、不溶性微粒等多方面的指标上HS016制剂研发小结HS016单抗新制剂明显优于原研药制剂32总结生物药物是非常脆弱的分子！生物制剂的开发是生物药物的关键海正药业建立了完善的生物制剂研发平台总结生物药物是非常脆弱的分子！33谢谢!Email:wjfang@Mobile谢!Email:wjfang@hisunpharm.co34生物制药注射剂的开发与确证新型给药系统中国峰会20122012.10.24方伟杰，博士海正药业生物分析与制剂研究室主任Email:wjfang@生物制药注射剂的开发与确证新型给药系统中国峰会201235主要内容生物制药的特性生物制剂的开发的关键因素物理、化学、生物学性质物理、化学降解的作用机理及抑制制剂分析方法的开发制剂破坏条件的选择辅料的选择和优化海正药业生物制剂的开发实例：HS016总结主要内容生物制药的特性36生物制药的特性由重组技术制备的生物制品如蛋白质、单抗、疫苗等结构，组分复杂蛋白质大分子（5

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KDa）1’,2’,3’和4’结构复杂混合物，如翻译后修饰等特异性：每个生物药物有不同的性质，如分子量、溶解度、pI、亲水性、高级结构、生物学性质等化学和物理降解化学降解：涉及共价键的断裂和生成，比如脱酰胺化（deamidation），水解（hydrolysis），氧化（oxidation）物理降解：不涉及共价键的断裂和生成，主要是高级结构的变化，包括吸附，变性（去折叠），聚集和沉淀生物制药的特性由重组技术制备的生物制品如蛋白质、单抗、疫苗等37生物制药的特性（二）免疫原性Immunogenicity所有生物制药都有潜在的免疫原性！免疫反应的频率很多因素有关：氨基酸序列、质量（如多聚体、糖基化）、病人状况、给药频率、途径产生的后果差异很大：安全性（如过敏反应），疗效（如产生中和抗体neutralizationantibody），代谢等生物制药的特性（二）免疫原性Immunogenicity38影响生物制药稳定性的因素生物分子的结构（氨基酸序列、翻译后修饰，分子内与分子间作用力）制剂，如蛋白浓度，pH，辅料等生产设施、工艺/过程原材料，如辅料、包材的质量等影响生物制药稳定性的因素生物分子的结构（氨基酸序列、翻译39如何确定生物制剂？了解生物药物的目标产品性质（TargetProductProfile，TPP）了解物理、化学、生物学性质及降解机理开发有效的分析及稳定性检测方法鉴别出主要的降解条件运用筛选（screening）和实验设计（DOE）的原理来评估制剂因素及它们之间的相互作用鉴别出候选制剂进行全方位的研究并最终确定如何确定生物制剂？了解生物药物的目标产品性质（Target40目标产品性质（TPP）给药途径（静脉，皮下，肌肉）剂型（水针、冻干）单次或者多次使用(single-/multiple-dose)生物药物的浓度治疗指数、安全性大小给药的频率，是否需要在医院使用市场竞争的情况，新制剂的优点目标产品性质（TPP）给药途径（静脉，皮下，肌肉）41生物药物的物理、化学性质物理、化学性质可以通过软件进行初步估算Mw、溶解度、pI、EC280、hydrophobicity、高级结构等以往的经验（如文献、其他类似分子等）物理、化学性质需要通过分析进行确认确认上述基本信息热稳定性（Tm，Tagg等）多聚体翻译后修饰（PTM）如糖基化，脱酰胺化等生物药物的物理、化学性质物理、化学性质可以通过软件进行初步估42化学降解-脱酰胺化Deamidation天冬氨酸异天冬氨酸天冬酰胺琥珀酰亚胺化学降解-脱酰胺化Deamidation天冬氨酸异天冬氨酸天43化学降解-水解Hydrolysis酸性裂解Acidiccleavage(Asp-Pro)抗体Hinge部位裂解抑制脱酰胺化和水解反应的方法冻干优化pH，缓冲液种类和浓度增加物理/构象稳定性化学降解-水解Hydrolysis酸性裂解Acidic44化学降解-氧化Oxidation主要在Met、Cys和芳香基氨基酸上，比如Tyr，Trp三大类型金属离子催化氧化反应自由基氧化反应光催化氧化反应抑制氧化反应方法螯合剂（如EDTA）自由基清除剂/抗氧化剂(如MetandTrp)避光保存排除氧气增加物理稳定性化学降解-氧化Oxidation主要在Met、Cys和芳香45化学降解-其他类型N-端环化如pGlu和DKP反应消旋化和β消除反应（racimization，β-elimination）还原性糖基化（glycation）二硫键错配（disulfidescrambling）化学降解-其他类型N-端环化如pGlu和DKP反应46化学性质分析方法化学性质/降解途径分析方法分子量凝胶电泳（SDS），质谱（MS）氨基酸序列Edman降解,LC-MS纯度凝胶电泳（SDS），反相色谱（RPC），分子排阻色谱（SEC），离子交换色谱（IEC），毛细管电泳（CE）电性分布及变化等点聚焦（IEF），IEC,CE脱酰胺化反应IEC，RPC（多肽），LC-MS水裂解反应RPC，SDS，LC-MS氧化反应RPC，肽图，LC-MS共价键结合多聚体SDS，MS化学性质分析方法化学性质/降解途径分析方法分子量凝胶电泳（S47物理降解：吸附在表面造成蛋白剂量的损失和构型的改变液-固表面：吸附到包材的容器壁、胶塞液相柱子、过滤器冰-水表面外来异物，包材的渗出物等液-气表面容器的空气（headspace），震荡、搅拌时与空气的接触物理降解：吸附在表面造成蛋白剂量的损失和构型的改变48物理降解：变性/去折叠二级等高级结构的变化维持天然结构的重要性天然构象是保持生物学活性的基础变性蛋白更容易造成毒副作用如免疫原性变性以后容易发生聚集等后续反应生物药物构象不稳定性的根源变性所需要的能量很低(30kcal/mol)物理降解：变性/去折叠二级等高级结构的变化49物理降解：聚集Aggregation蛋白质分子通过相互作用聚集在一起蛋白变性（构象改变）相互吸附（胶体不稳定性）分类可逆/不可逆聚集（reversible/irreversible）类似天然构象的聚集/完全变性的聚集（native-like？）共价结合/非共价结合聚集covalent/non-covalent可溶性/不溶性聚集soluble/insoluble(precipitation)物理降解：聚集Aggregation蛋白质分子通过相互作用聚50可见与不可见微粒

Visibleandsub-visibleparticles微粒的危害免疫反应！死亡，产生中和抗体堵塞血管，降低疗效，毒性微粒的分类外源性/非蛋白微粒蛋白聚集微粒微粒无处不在，每一步操作都会产生/带入微粒！微粒的检测肉眼外观检测光阻法(Lightobscuration）Micro-FlowImaging（MFI），

Coultercounter动态光散射（DLS），Nanosight，

AffinityBiosensor，TEMCarpenteretal.JPharmSci,2009,27,1201可见与不可见微粒

Visibleandsub-visib51物理稳定性影响因素加热pH,盐（疏水）表面震荡,剪切力光照冻融化学试剂(金属离子,表面活性剂,防腐剂,有机溶剂等)物理稳定性影响因素加热52物理稳定性分析方法物理性质分析方法热稳定性Tm：DSC，圆二色光谱（CD）/荧光Tagg：DLS构象改变二级：远紫外圆二色光谱（Far-UVCD），红外（IR）三级：近紫外圆二色光谱（Near-UVCD），荧光（Fluorescence），2D-UV，NMR，X-ray可溶性聚集SEC，MALS-SEC，超高速离心仪（AUC）不溶性聚集（微粒）肉眼，光阻法，MFI，DLS物理稳定性分析方法物理性质分析方法热稳定性Tm：DSC，圆53增加物理稳定性的方法增加蛋白质的天然构象稳定性加入“选择性排除（preferentiallyexcluded）”的辅料，如糖类，氨基酸，PEG等加入与天然构象结合的配体增加蛋白溶液的胶体稳定性，如改变其表面的电性分布加入表面活性剂如吐温20或80与蛋白竞争表面吸附抑制蛋白-蛋白疏水基团的相互作用增加物理稳定性的方法增加蛋白质的天然构象稳定性54生物制剂开发的降解条件加热（25-40C，小于Tm10C以上）冻融（Freeze-Thaw）光照（Photo-degradation）震荡（Agitation）生物制剂开发的降解条件加热（25-40C，小于Tm1055辅料的筛选原则：每个辅料及使用的量都要有明确被证明的作用！缓冲液，如磷酸、柠檬酸、组氨酸缓冲液表面活性剂，如吐温20或80结构保护剂，如糖类，氨基酸，PEG等等渗剂，如氯化钠抗氧化剂，如EDTA，蛋氨酸配体，如金属离子赋形剂，如甘氨酸、甘露醇防腐剂，如苯甲醇辅料的筛选原则：每个辅料及使用的量都要有明确被证明的作用！56海正生物制剂研发实例-HS016重组全人源化单克隆抗体治疗人类自身免疫疾病原研药在国际上的年销售>50亿美元国内还未有仿制药上市水剂、预灌封注射器海正生物制剂研发实例-HS016重组全人源化单克隆抗体57制剂前研究（Preformulation）原液储存方法：冷冻（-80C）VS低温（5C）原液冻（-80C）、融（室温）6次不影响质量低温保存条件下有大量的多聚物产生pH和盐浓度的影响最佳pH约为5.2-6.0左右盐（NaCl）在原处方中只起到等渗剂的作