临床样本的采集运输和保存及核酸提取

临床标本的采集、处理、运送与保存及DNA/RNA提取

研究背景样本的采集、处理样本的保存样本的运输DNA的提取RNA的提取研究背景一、样本的采集、处理、保存及运输临床标本的正确采集、运送、保存

的重要性临床检验的质量保证关键性环节解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一（一）、样本的采集地贫检测样品采集：外周血:≥5mL脐带血:0.5~1mL羊水：20～30mL绒毛：≥15mg唾液组织标本采集的注意事项所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下进行已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送采集足够量标本每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时间及相关临床信息全血以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠，不可使用肝素全血样本如用于DNA提取检测，可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA血清（浆）DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下

肝素的作用机理

肝素对MLV逆转录酶和TAQDNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用每μg核酸标本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在标本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸在于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNasin25℃下作用2小时可去除肝素的抑制作用（二）、样本的运送

样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本中如加入了适当的稳定剂，如用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄建议：将全血标本或DNA样本用冰袋加泡沫盒快递运送。如需提取RNA的样本需预处理后加lmlTrizol在低温运送（三三））、、样样本本的的保保存存常规规外外周周血血标标本本，，采采集集后后做做血血常常规规，，常常温温24小小时时内内，，4℃℃可可保保存存1周周；；做做血血红红蛋蛋白白电电泳泳常常温温1周周，，电电泳泳4℃℃可可保保存存15天天；；DNA提提取取样样本本常常温温24小小时时，，4℃℃保保存存1个个星星期期，，－－20℃℃保保存存3个个月月，，－－70℃℃保保存存半半年年～～3年年；；RNA提提取取样样本本常常温温6小小时时，，4℃℃保保存存12小小时时，，－－70℃℃保保存存3个个月月，，羊羊水水在在12小小时时内内离离心心可可保保存存同同上上。。研究究背背景景二、、核核酸酸的的提提取取核酸酸提提取取的的重重要要性性核酸酸提提取取是是临临床床PCR检检验验最最为为关关键键的的部部分分，，亦亦是是手手式式操操作作的的主主要要部部分分核酸酸提提取取的的成成败败关关系系到到临临床床PCR检检验验的的正正确确与与否否临床床PCR检检验验操操作作中中最最易易出出问问题题的的环环节节（一一））、、提提取取核核酸酸总总的的原原则则保证证核核酸酸一一级级结结构构的的完完整整性性；；其他他生生物物大大分分子子如如蛋蛋白白质质、、多多糖糖和和脂脂类类分分子子的的污污染染应应降降低低到到最最低低程程度度；；核酸酸样样品品中中不不应应存存在在对对酶酶有有抑抑制制作作用用的的有有机机溶溶剂剂和和过过高高浓浓度度的的金金属属离离子子；；其他他核核酸酸分分子子，，如如提提取取DNA中中的的RNA，，也也应应尽尽量量去去除除。。（二二））、、核核酸酸提提取取的的基基本本步步骤骤1、、核酸酸的的释释放放：：破裂裂细细胞胞释释放放核核酸酸机械械法法与与非非机机械械法法（非非机机械械法法中中溶胞胞法法是应应最最广广泛泛的的方方法法））各种种组组织织细细胞胞破破碎碎方方法法细胞破碎方法

应用

Ⅰ机械法1.匀浆法机体软组织2.捣碎法动物韧性组织3.研磨法细菌、酵母

Ⅱ物理法1.超声法细胞混悬液2.反复冻融法培养细胞3.冷热交替法细菌、病毒4.低渗裂解红细胞

Ⅲ化学法1.有机溶剂细菌、酵母、血液2.去垢剂组织、培养细胞、血液3.酶解法细菌、酵母、血液2、、核核酸酸的的分分离离与与纯纯化化：：将含含有有核核酸酸分分子子复复杂杂复复合合物物中中，，将将核核酸酸与与其其他物物质质分分离离非核核酸酸的的大大分分子子污污染染物物（（蛋蛋白白质质、、多多糖糖和和脂脂类分分子子））、、非非需需要要的的核核酸酸分分子子、、试试剂剂和和溶溶液液3、、核核酸酸的的浓浓缩缩、、沉沉淀淀与与洗洗涤涤沉淀淀可可去去除除部部分分杂杂质质与与某某些些盐盐离离子子加入入一一定定的的盐盐类类（（醋醋酸酸钠钠、、氯氯化化钠钠等等））后后使使用用有有机机溶溶剂剂（（如如乙乙醇醇、、异异丙丙醇醇等等））少数数盐盐类类可可使使用用70-75%的的乙乙醇醇洗洗涤涤4.核核酸酸的的鉴鉴定定浓度度鉴鉴定定纯度度鉴鉴定定完整整性性鉴鉴定定浓度度鉴鉴定定DNA：：1））紫紫外外分分光光光光度度法法：：测测定定DNA在在A260nm的光光吸吸收收值值。。如计计算算DNA浓浓度度A260×稀稀释释倍倍数数××50＝＝μμg/ml紫外外分分光光光光度度法法只只用用于于测测定定浓浓度度大大于于0.25ug/ml的核核酸酸溶溶液液。。(A值值等等于于1时时，，相相当当于于50μg/ml双链链DNA，，40μg/ml单单链DNA或或RNA，，20μg/ml单链链寡寡核核苷苷酸酸））RNA：：紫外外吸吸光光光光度度法法:A260×稀稀释释倍倍数数××40＝＝μμg/ml(OD260-OD320)×稀释倍倍数×40＝μμg/ml2）荧光光光度法荧光染料溴溴化乙锭，，可嵌入到到碱基平面面，而发出出荧光，且且荧光强度度与核酸含含量呈正比比。适用于低浓浓度核酸溶溶液的定量量分析（1-5ng）EB与DNA的结合合纯度鉴定紫外分光光光度法：在260nm和280nm处处测定DAN溶液的的光吸收，，纯的DNAA260与A280之比应在1.80(1.60~1.80)，低于此值值表明制备备物中留有有蛋白质成成份。高于于此值表明明有RNA的残留量量纯的RNAA260与A280之比应在2.0(1.80~2.00),Ratio<1.8:蛋蛋白质污染染;Ratio>2.2:RNA可能已已经水解成成单核苷酸酸A260/A280比值是纯纯度检测的的重要指标标！注：测定吸光值值，稀释液液应使用ＴＴＥ完整性鉴定定凝胶电泳法法：基因组DNA电泳，，在电场中中泳动慢，，如果发生生降解，可可出现电泳泳图谱脱尾尾现象；总RNA电电泳，观测测各条带的的含量，提提示是否存存在RNA降解；如如加样槽中中存在条带带，可能是是DNA污污染。DNA完整整性鉴定：：

正常时，28SRNA的荧荧光强度约约为18SRNA的2倍，，否则提示示RNA的的降解RNA完整整性鉴定：：5、核酸的的贮存———DNA保保存1）短期贮贮存：4℃或-20℃存放放于TE（（tris和EDTA）缓冲冲液中。TE缓缓冲冲液液的的PH与与DNA贮贮存存有有关关，，PH为为8时时，，可可减减少少DNA脱脱氨氨反反应应，，PH低低于于7.0时时DNA容容易易变变性性。。2））长长期期贮贮存存：：TE缓缓冲冲液液中中-70℃℃保保存存数数年年；；在在DNA溶溶液液中中加加一一滴滴氯氯仿仿可可有有效效防防止止细细菌菌和和核核酸酸的的污污染染。。核酸酸的的贮贮存存————RNA保保存存：：RNA可可溶溶于于0.3mol/L的醋醋酸酸钠钠溶溶液液或或双双蒸蒸水水，，在在-70℃℃保保存存。。RNA可可溶溶于于70%的的乙乙醇醇溶溶液液或或去去离离子子的的甲甲酰酰胺胺溶溶液液中中，，可可在在-20℃℃保保存存。。RNA如如果果以以DEPC（（焦焦碳碳酸酸二二乙乙酯酯））可可以以抑抑制制RNA酶酶对对RNA的的降降解解三、、基基因因组组DNA的的分分离离与与纯纯化化（一一））、、DNA样样品品准准备备常见见的的标标本本：：血液液、、尿尿液液、、唾唾液液、、组组织织及及培培养养细细胞胞等等生物物组组织织：：最好好新新鲜鲜组组织织，，若若不不能能马马上上提提取取，，应应贮贮存存－70℃℃或或液液氮氮DNA提提取取前前样样本本采采集集、、预预处处理理和和保保存存：：全血血抗凝凝剂剂：：EDTA-Na2或枸枸橼橼酸酸钠钠作为为抗抗凝凝剂剂不宜宜使使用用肝肝素素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80℃保存2个月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差（二二））、、DNA提提取取（一一））酚酚抽抽提提法法：：先用用EDTA、、SDS、、蛋蛋白白酶酶K破破碎碎细细胞胞，，消消化化蛋蛋白白，，然然后后用用pH8的Tris饱饱和和酚酚或或酚酚-氯氯仿仿抽抽提提DNA，，最最后后乙乙醇醇或或异异丙丙醇醇进进行行沉沉淀淀。。获获DNA大大小小为为100－－150kb。。酚抽提法提取步骤：：DNA酚酚抽抽提提法法示示意意图图主要试剂剂的作用用：EDTA：1.二二价金属属螯合剂剂，抑制制核酸酶酶；2.降降低细胞胞膜的稳稳定性SDS的的作用：：1.溶溶解膜蛋蛋白和脂脂肪，从从而使细细胞膜破破裂2.溶溶解核膜膜和核小小体，使使其解聚聚，将核核酸释放出来来3.对对RNA、DNA酶有有抑制作作用4.与与蛋白质质形成R-O-SO3….R蛋白白质复合合物，使使蛋白质质变性蛋白酶K：水解蛋白白质的作作用，消消化DNA酶和和细胞中中的蛋白白质蛋白酶K与其他他蛋白酶酶相比，，它具有有更强的的水解能能力，而且且在SDS、EDTA存在时时仍保持持较高活活性，可可同时使用用苯酚：蛋白质强强变性剂剂、抑制制DNA酶活性性苯酚溶于于有机溶溶剂，微微溶于水水提取DNA前苯苯酚用Tris-Hcl饱和和，防止止吸收过过多DNA，降降低DNA的损损失率氧化苯酚酚会破坏坏DNADNA的的沉淀：：1）无水水乙醇沉沉淀沉淀前往往往加入入NaCl等盐盐离子，，作用是是中和核核酸分子子表面的的负电荷荷，有助助于分子子之间的的聚集。。无水乙醇醇可以吸吸收分子子之间的的水，使使DNA沉淀析析出，无无水乙醇醇使用前前冰冻，，可以减减少DNA沉淀淀析出过过程释放放热量对对DNA的损伤伤。2）异丙丙醇沉淀淀除了使DNA沉沉淀外，，还可以以溶解少少量的小小的RNA分子子（二）甲甲酰胺胺解聚法法：破碎细胞胞同上，，然后用用高浓度度甲酰胺胺解聚蛋蛋白质与与DNA的结合合，再透透析获得得DNA。高浓浓度甲酰酰胺可以以裂解蛋蛋白质与与DNA的复合合物，可可以使蛋蛋白质变变性。减减少了酚酚多次抽抽提的步步骤甲酰胺解解聚法适适用于从从标本中中制备高高分子量量的DNA样品品。可得得DNA200kb左右。。（三）磁磁珠法：：磁珠在高高盐低pH值下下吸附核核酸，在在低盐高高pH值值下与核核酸分离离，再通通过移动动磁珠来来获取DNA（四）微微柱法：：利用DNA在高高盐、低低pH的的特定溶溶液环境境下可吸吸附在固固相介质质（如硅硅胶膜））上，洗洗涤去除除杂质后后，再改改变溶液液环境使使DNA溶解到到纯水或或TE中中（三）、、DNA的浓缩缩固体聚乙乙二醇（（PEG）浓缩缩：用透透析袋外外敷敷PEG至合适适量丁醇抽提提浓缩：：DNA溶液中中水可分分配到正正丁醇或或仲丁醇醇，但DNA不不会。因因此重复复几次可可显著减减少DNA体积积（四）、、DNA回收主要是从从电泳中中分离回回收DNA片段段回收原则则：尽量量提高回回收率去除回收收DNA样品中中的污染染物DNA降降解的原原因样本不够够新鲜，，采集材材料过陈陈旧样本本身身存在大大量DNA酶提取DNA的生生物活性性差的原原因？提取的基基因组DNA盐盐浓度过过高基因组DNA中中乙醇未未清除净净基因组DNA中中可能存存在其他他抑制因因素提取基因因组DNA，有有时加入入蔗糖的的原因加入多糖糖，保护护DNA长度影响DNA质量量的因素素四、RNA的分分离与纯纯化（一）、、样本来来源理论上所所有有核核真核细细胞、细细菌、病病毒都可可以提取取RNA样本选择择取决于于试验目目的全血是基基因组提提取RNA最常常见的样样本每个细胞胞的RNA量约约为10-5μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他RNA：hnRNA、snRNA、、snoRNA…组织材料起始样品量TotalRNA提取量blood1ml15~20μgleukocytes1×107个约100μgLivertissue1g约5000μgCulturecells1×107个约100μgRenaltissue1g约3000μgSkeletontissue1g约1500μgCerebraltissue1g约1500μg（二）、、RNA提提取的独独特性—关于RNase酶临床标本本及实验验室环境境中,存存在大量量对RNA具有有强烈降降解作用用的RNase，而RNase较耐耐高温,不易失失活如何避免免RNase对对标本的的污染及及防止RNase对提提取的RNA的的降解,是保证证RNA成功提提取的关关键之所所在RNase酶RNA易易被RNase水解，，RNase除除胞内还还广泛存存在于人人的皮肤肤、唾液液、汗液液及周围围的环境境中RNase具有有水解核核糖残基基和磷酸酸二酯键键RNase分子子结构中中的二硫硫键使其其生物学学活性非非常稳定定，去除除变性剂剂后，RNase的活活性又可可恢复去除RNase的污染染及强有有力地抑抑制其活活性是RNA制制备成功功与否的的关键必须在总总RNA提取分分离的最初阶段段，尽可能能地灭活活胞内RNase的活活性1.内内源性RNA酶酶（intrinsicRNase）2.外外源性RNA酶酶(extrinsicRNase)主要来源源：被污染的的缓冲液液细菌或微微生物污污染，高高压不能能去除RNA酶酶自动移液液装置3.实实验室采采取避免免RNA酶污染染的措施施设置专门门RNA移液装装置小份保存存缓冲液液设置专门门的RNA电泳泳装置准备溶液液或缓冲冲液时，，使用无无RNA酶的器器皿、DEPC处理水水等分离RNA过程程中使用用RNA酶抑制制剂4.RNA酶酶的去除除DEPC（焦碳碳酸二乙乙酯）高度活化化的烷基基化试剂剂，破坏坏RNA酶活性性。用来来灭活缓缓冲液或或器皿中中的RNA酶。。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O==DEPC水制备备：0.1%DEPC在37°C处理1h，并高高压灭菌菌15min。。玻璃制品品和塑料料制品应应浸泡在在0.1%的DEPC水溶液液中，37°C处理1h或室温温下过夜夜。DEPC非选择择性的修修饰蛋白白质和RNA，，且与一一些缓冲冲液不相相容，故故在分离离和纯化化RNA的过程程中不使使用DEPC5.RNA提提取所用用器皿的的处理经高压灭灭菌的一一次性使使用的塑塑料制品品如试管管,离心心管等基基本上无无RNase,可以不不经预处处理直接接用于制制备和贮贮存RNA实验室用用的普通通玻璃器器皿经常常有RNase污染,使用前前必须于于180℃干烤烤8小时时以上,或用0.1%焦碳酸酸二乙酯酯(DEPC)的水溶溶液浸泡泡用于制制备RNA的烧烧杯,试试管和其其它用品品DEPC是是RNase的强烈烈抑制剂。。灌满DEPC的器器皿于37℃下放置置2小时，，然后用灭灭菌水淋洗洗数次，并并于100℃干烤15分钟，，最后高压压蒸汽下15分钟。。上述处理理可除去器器皿上痕量量的DEPC,以防防DEPC通过羧甲甲基化作用用对RNA的嘌呤碱碱基进行修修饰6.RNA提取所所用溶液的的准备对于RNA提取所需需溶液的配配制,必须须用高压灭灭菌的水和和RNA研研究专用的的化学试剂剂配制溶液液,用干烤烤过的药匙匙称取试剂剂,将溶液液装入无RNase的玻璃器器皿。可能能的话,溶溶液均应用用0.1%DEPC于37℃℃至少处理理12小时时,然后于于100℃℃加热15分钟或高高压蒸汽灭灭菌15分分钟须注意的是是,DEPC可与胺胺类迅速发发生化学反反应,因此此不能用来来处理含有有Tris一类的缓缓冲液,因因此可存几几瓶新的,未开封的的Tris试剂以制制备无RNase的的溶液7.RNA提取中中RNase污染染的控制实验操作人人员的手是是RNase污染最最主要的潜潜在来源。。策略是：在准备用于RNA纯化化的实验材材料和溶液液时,以及及在涉及RNA的整整个提取操操作过程中中,都应戴戴一次性手手套在RNA提取取实验中，，应勤换手手套（三）、用用于提取RNA的血血样的处理理取新鲜抗凝凝血2－3ml入15ml无无菌塑料管管，600g离心5分钟，弃弃上清。加入6倍细细胞体积的的红细胞裂裂解液（约约12ml），轻轻轻吹打混匀匀，本步骤骤在室温或或4度操作作均可。裂裂解时间至至4-5分分钟，并且且裂解过程程中宜适当当偶尔摇动动以促进红红细胞裂解解。600g离离心5分钟钟，弃红色色上清。4℃离心效效果更佳。。一般情况下下，裂解解1次红细细胞应该裂裂解的差不不多，如果果有较多红红细胞没有有裂解的话话，可以再再加点红细细胞裂解液液约5ml裂解1次次。步骤同同3。向得到的细细胞团中加加Trizol1.0ml，弹匀，，将细胞团团打散，转转入1.5ml无菌菌塑料管，，封好盖。。标上号，，缠上封口口膜，－20℃或－70℃保存。（四）、RNA提取取的常用方方法表面活性剂剂加蛋