中国药品检验标准操作流程

中国药品检验标准操作规程

2010年版

高效液相色谱法11、对仪器的一般要求所用仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。1.1色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性添充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱使用离子交换填充剂；分子排阻色谱使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm（1nm=10Å）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间，粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定的结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。流动相的PH值应控制在2～8之间。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用PH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用PH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。1.2检测器最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。.紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散色检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。不同的检检测器，，对流动动相的要要求不同同。如采采用紫外外检测器器，所用用流动相相应符合合紫外—可见分光光光度法法（《中国药典典》2010年版二部部附录ⅣA）项下对对溶剂的的要求；；采用低低波长检检测时，，还应考考虑有机机相中有有机溶剂剂的截止止使用波波长，并并选用色色谱级有有机溶剂剂。蒸发发光散射射检测器器和质谱谱检测器器通常不不允许使使用含不不挥发盐盐组分的的流动相相。1.3流动相反相色谱谱系统的的流动相相首选甲甲醇-水系统（（采用紫紫外末端端波长检检测时，，首选乙乙腈-水系统）），如经经试用不不合适时时，再选选用其他他溶剂系系统。应应尽可能能少用含含有缓冲冲液的流流动相，，必须使使用时，，应尽可可能选用用含较低低浓度缓缓冲液的的流动相相。由于于C18链在水相相环境中中不易保保持伸展展状态，，故对于于十八烷烷基硅烷烷键合硅硅胶为固固定相的的反相色色谱系统统，流动动相中有有机溶剂剂的比例例通常应应不低于于5%，否则C18链的随机机卷曲将将导致组组分保留留值变化化，造成成色谱系系统不稳稳定。各品种项项下规定定的条件件除固定定相种类类、流动动相组成成、检测测器类型型不得改改变外，，其余如如色谱柱柱内径、、长度、、载体粒粒度、流流动相流流速、混混合流动动相各组组成的比比例、柱柱温、进进样量、、检测器器的灵敏敏度等，，均可适适当改变变，以适适应供试试品并达达到系统统适用性性试验的的要求。。其中，，调整流流动相组组分比例例时，以以组分比比例较低低者（小小于或等等于50%）相对于于自身的的改变量量不超过过±30%且相对于于总量的的改变量量不超过过±10%为限，如如30%相对改变变量的数数值超过过总量的的10%时，则改改变量以以总量的的±10%为限。对于必须须使用特特定牌号号的填充充剂方能能满足分分离要求求的品种种，可在在该品种种项下注注明。2、系统适适用性试试验色谱系统统的适用用性试验验通常包包括理论论板数、、分离度度、重复复性和拖拖尾因子子等四个个参数。。其中，，分离度度和重复复性尤为为重要。。按各品种种项下要要求对色色谱系统统进行适适用性试试验，即即用规定定的对照照品溶液液或系统统适用性性试验溶溶液在规规定的色色谱系统统进行试试验，必必要时，，可对色色谱系统统进行调调整，以以符合要要求。2.1色谱柱的的理论板板数(n)。用于评价价色谱柱柱的分离离效能。。由于不不同物质质在同一一色谱柱柱上的色色谱行为为不同，，采用理理论板数数作为衡衡量柱效效能的指指标时，，应指明明测定物物质，一一般为待待测组分分或内标标物质的的理论板板数。在规定的的条件下下，注入入供试品品溶液或或各品种种项下规规定的内内标物质质溶液，，记录色色谱图，，量出供供试品主主成分峰峰或内标标物质峰峰的保留留时间tR（以分钟钟或长度度计，下下同，但但应取相相同单位位）和峰峰宽（W）半峰高高宽（Wh/2），按n＝16(tR/W)2或n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱谱柱的理理论板数数。2.2分离度（（R）用于评价价待测组组分与相相邻共存存物或难难分离物物质之间间的分离离程度，，是衡量量色谱系系统效能能的关键键指标。。可以通通过测定定待测物物质与已已知杂质质的分离离度，也也可以通通过测定定待测组组分与某某一添加加的指标标性成分分（内标标物质或或其他难难分离物物质）的的分离度度，或将将供试品品或对照照品用适适当的方方法降解解，通过过测定待待测组分分与某一一降解产产物的分分离度，，对色谱谱系统进进行评价价与控制制。无论是定定性鉴别别还是定定量分析析，均要要求待测测峰与其其他峰、、内标峰峰或特定定的杂质质对照峰峰之间有有较好的的分离度度。除另另有规定定外，待待测组分分与相邻邻共存物物之间的的分离度度应大于于1.5。2.3重复性用于评价价连续进进样后，，色谱系系统响应应值的重重复性能能。采用用外标法法时，通通常取各各品种项项下的对对照品溶溶液，连连续进样样5次，除另另有规定定外，其其峰面积积测量值值的相对对标准偏偏差应不不大于2.0％；采用用内标法法时，通通常配制制相当于于80％、100％和120％的对照照品溶液液，加入入规定量量的内标标溶液，，配成3种不同浓浓度的溶溶液，分分别至少少进样2次，计算算平均校校正因子子，其相相对标准准偏差也也应不大大于2.0％。2.4拖尾因子子（T）用于评价价色谱峰峰的对称称性。为为保证分分离效果果和测量量精度，，应检查查待测峰峰的拖尾尾因子是是否符合合各品种种项下的的规定。。拖尾因因子计算算公式为为：T＝W0.05h/2d1式中,W0.05h为5%峰高处的的峰宽；；d1为5%峰高出峰峰顶点至至峰前沿沿之间的的距离。。除另有规规定外，，峰高法法定量时时T应在0.95～1.05之间。峰面积法法测定时时，若拖拖尾严重重，将影影响峰面面积的准准确测量量。必要要时，应应在各品品种项下下对拖尾尾因子做做出规定定。3、测定法法3.1内标法按各品种种项下的的规定，，精密称称（量））取对照照品和内内标物质质，分别别配成溶溶液，精精密量取取各适量量，混合合配成校校正因子子测定用用的对照照溶液。。取一定定量注入入仪器，，记录色色谱图。。测量对对照品和和内标物物质的峰峰面积或或峰高，，按下式式计算校校正因子子校正因子子（ƒ）＝（AS/CS）/(AR/CR)式中,AS为内标物物质的峰峰面积或或峰高；；AR为对照品品的峰面面积或峰峰高；CS为内标物物质的浓浓度；CR为对照品品的浓度度。再取各品品种项下下含有内内标物质质的供试试品溶液液，注入入仪器，，记录色色谱图，，测量供供试品中中待测成成分和内内标物质质的峰面面积或峰峰高，按按下式计计算含量量：含量（CX）＝ƒ·AX/(A′′S／C′S)式中,Ax为供试品品峰面积积或峰高高；CX为供试品品的浓浓度；A′S为内标物物质的峰峰面积或或峰高；；C′S为内标物物质的浓浓度；ƒ为较正因因子。采用内标标法，可可避免因因样品前前处理及及进样体体积误差差对测定定结果的的影响。。3.2外标法按各品种种项下的的规定，，精密称称(量)取对照品品和供试试品，配配制成溶溶液，分分别精密密取一定定量，注注入仪器器，记录录色谱图图，测量量对照品品溶液和和供试品品溶液中中待测成成分的峰峰面积（（或峰高高），按按下式计计算含量量：含量（CX）＝CR(AX/AR)式中各符符号意义义同上。。由于微量量注射器器不易精精确控制制进样量量，当采采用外标标法测定定供试品品中某成成分或杂杂质含量量时，以以定量环环或自动动进样器器进样为为好。3.3加校正因因子的主主成分自自身对照照法测定杂质质含量时时，可采采用加校校正因子子的主成成分自身身对照法法。在建建立方法法时，按按各品种种项下的的规定，，精密称称（量））取杂质质对照品品和待测测成分对对照品各各适量，，配制测测定杂质质校正因因子的溶溶液，进进样，记记录色谱谱图，按按上述3.1法计算杂杂质的校校正因子子。此校校正因子子可直接接载入各各品种项项下，用用于校正正杂质的的实测峰峰面积。。这些需需作较正正计算的的杂质，，通常以以主成分分为参照照，采用用相对保保留时间间定位，，其数值值一并载载入各品品种项下下。测定杂质质含量时时，按各各品种项项下规定定的杂质质限度，，将供试试品溶液液稀释成成与杂质质限度相相当的溶溶液作为为对照溶溶液，进进样，调调节仪器器灵敏度度（以噪噪音水平平可接受受为限））或进样样量（以以柱子不不过载为为限），，使对照照溶液的的主成分分色谱峰峰高约达达满量程程的10％～25％或其峰峰面积能能准确积积分【通常含量量低于0.5%的杂质，，峰面积积的相对对标准偏偏差（RSD）应小于于10%；含量在在0.5%～2%的杂质，，峰面积积的RSD应小于5%；含量大大于2%的杂质，，峰面积积的RSD应小于2%】。然后，，取供试试品溶液液和对照照品溶液液适量，，分别进进样，供供试品溶溶液的记记录时间间，除另另有规定定外，应应为主成成分色谱谱峰保留留时间的的2倍，测量量供试品品溶液色色谱图上上各杂质质的峰面面积，分分别乘以以相应的的校正因因子后与与对照溶溶液主成成分的峰峰面积比比较，依依法计算算各杂质质含量。。3.4不加校正正因子的的主成分分自身对对照法测定杂质质含量时时，若没没有杂质质对照品品，也可可采用不不加校正正因子的的主成分分自身对对照法。。同上述述3.3法配制对对照溶液液并调节节检测灵灵敏度后后，取供供试品溶溶液和对对照溶液液适量，，分别进进样，前前者的记记录时间间除另有有规定外外，应为为主成分分保留时时间的2倍，测量量供试品品溶液色色谱图上上各杂质质的峰面面积并与与对照溶溶液主成成分的峰峰面积比比较，计计算杂质质含量。。若供试品品所含的的部分杂杂质未与与溶剂峰峰完全分分离，则则按规定定先记录录供试品品溶液的的色谱图图Ⅰ，再记录录等体积积纯溶剂剂的色谱谱图Ⅱ。色谱图图Ⅰ上杂质峰峰的总面面积（包包括溶剂剂峰），，减去色色谱图Ⅱ上的溶剂剂峰面积积，即为为总杂质质峰的校校正面积积。然后后依法计计算。3.5面积归一一法按各品种种项下的的规定，，配制供供试品溶溶液，取取一定量量注入仪仪器，记记录色谱谱图。测测量各峰峰的面积积和色谱谱图上除除溶剂峰峰以外的的总色谱谱峰面积积，计算算各峰面面积占总总峰面积积的百分分率。用于杂质检检查时，由由于峰面积积归一化法法测定误差差大，因此此，通常只只用于粗略略考察供试试品中的杂杂质含量。。除另有规规定外，一一般不宜用用于微量杂杂质的检查查。4、注意事项项4.1流动相的制制备与保存存用高纯度的的试剂配制制流动相，，必要时照照紫外-可见分光光光度法进行行溶剂检查查，应符合合要求；水水应为新鲜鲜制备的高高纯水，可可用超纯水水器制得或或用重蒸水水。凡规定定pH值的流动相相，应使用用精密pH计进行调节节，除另有有规定外，，偏差一般般不超过±0.2pH单位。配制制好的流动动相应通过过适宜的0.45μμm（或0.22μμm)滤膜滤过，，以除去杂杂质微粒。。流动相用用前必须脱脱气，否则则容易在系系统内逸出出气泡，影影响泵的工工作、色谱谱柱的分离离效率、检检测器的灵灵敏度以及及基线稳定定性等。流动相一般般贮存于玻玻璃、聚四四氟乙烯等等容器内，，不能贮存存在塑料容容器中。因因许多有机机溶剂如甲甲醇、乙腈腈等可浸出出塑料表面面的增塑剂剂，导致流流动相受污污染。贮存存溶剂一定定要盖严，，以防止溶溶剂挥发引引起组成变变化，也防防止氧和二二氧化碳溶溶入流动相相引起pH值变化，对对分离或分分析结果带带来误差。。磷酸盐、、醋酸盐缓缓冲液容易易发霉变质质，应尽量量新鲜配制制使用。如如确需贮存存，可在冰冰箱内冷藏藏，并在3天内使用，，用前应重重新滤过。。4.2溶剂的配制制与保存除另有规定定外，采用用规定溶剂剂配制对照照品溶液和和供试品溶溶液，定量量测定时，，对照品溶溶液和供试试品溶液均均应分别配配制两份。。供试品溶溶液在注入入液相色谱谱仪前，一一般应经适适宜的0.45μμm（或0.22μμm)滤膜滤过，，以减少对对色谱系统统产生污染染或影响色色谱分离。。应根据试试验要求和和供试品的的稳定性，，设置待测测溶液的贮贮存条件（（如温度、、遮光等））。4.3色谱柱的使使用与保存存根据实验要要求和流动动相的pH值范围，参参照色谱柱柱说明书，，选用适宜宜的色谱柱柱。安装色色谱柱时应应使流动相相流路的方方向与色谱谱柱标签上上箭头所示示方向一致致。除另有有规定外，，不宜反向向使用，否否则会导致致色谱柱柱柱效明显降降低，无法法恢复。进进样前，色色谱柱应用用流动相充充分冲洗平平衡。经色色谱系统适适用性试验验测试，应应符合要求求。色谱柱在使使用过程中中，应避免免压力和温温度的急剧剧变化及任任何机械震震动。温度度的突然变变化或者机机械震动都都会影响柱柱内定相的的填充状况况；柱压的的突然升高高或降低也也会冲动柱柱内填料，，因此在调调节流动相相流速时应应该缓慢进进行。试验结束后后，可按色色谱柱的使使用说明书书，对色谱谱柱进行冲冲洗和保存存。一般来讲，，对于反相相色谱柱，，如使用缓缓冲液或含含盐溶液作作为流动相相，在试验验结束后，，应用10倍柱体积（（如150mm柱长，约15ml）的低浓度度的甲醇/乙腈-水溶液（10%～20%）冲洗，使使色谱柱内内的盐完全全溶解洗脱脱出，再用用较高浓度度的甲醇/乙腈-水溶液（50%）冲洗，最最后用高浓浓度的甲醇醇/乙腈-水溶液（80%～100%）冲洗，使使色谱柱中中的强吸附附物质冲洗洗出来。如色谱柱需需长期保存存，反相柱柱可以贮存存于甲醇或或乙腈中，，正相柱可可以贮存于于经脱水处处理后的正正己烷中，，离子交换换柱可以贮贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化纳的的水中，并并将色谱柱柱两端密封封，以免干干燥，室温温保存。4.4流动相的调调整为满足色谱谱柱系统适适用性要求求，试验中中有时需要要调整流动动相组分的的比例。在在调整流动动相组分比比例时，以以组分比例例较低者（（小于或等等于50%）相对改变变量不超过过±30%且绝对改变变量不超过过±10%为限，如30%相对改变量量的数值超超过10%时，则改变变量以±10%为限。下面面举例说明明。4.4.1二元流动相相系统例1两组分比例例为50：50按上述原则则，50%的最大相对对该变量为为15%，已超过了了绝对改变变量允许的的范围，故故该流动相相比例调节节的范围是是±10%，即40：60至60:40。例2两组分比例例为2:98按上述原则则，2%的最大相对对改变量为为0.6%，故该流动动相比例调调节的范围围是1.4:98.6至2.6:97.4。4.4.2三元流动相相系统例3三组分比例例为60:35:5按上述原则则，可每次次调节流动动相系统中中比例较低低的两个组组分。对于35%的组分，其其最大相对对改变量为为10.5%，已超过了了绝对该变变量允许的的范围，故故该组分比比例调节的的范围是±10%，即25%～45%，则流动相相系统比例例的调节范范围是50:45:5至70:25:5。对于5%的组分，其其最大相对对改变量为为1.5%，该组分比比例调节的的范围是±1.5%，即3.5%～6.5%，则流动相相系统比例例的调节范范围是58.5:35:6.5至61.5:35:3.5。4.5杂质检查查时色谱谱参数的的设置在进行杂杂质检查查时，选选择适宜宜的检测测灵敏度度和设定定适宜的的积分参参数非常常重要。。国内药药品质量量标准中中，通常常制备与与杂质限限度相当当浓度的的