共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理

共聚焦激光扫描荧光显微镜共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第1页!

什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？

共聚焦激光扫描荧光显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM

）

以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统共聚焦系统细胞CT

共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第2页!荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线—荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)：

能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION):

发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI,Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):

组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。漂白(BLEACH)：

荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失—漂白。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第3页!二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。

带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490

长、短通滤色镜组合（LP+KP）：LP450+KP490

双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm520nmFITC450nm490nm共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第4页!共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台LeicaTCSSP-2MPAOBSConfocalSystem共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第5页!Nikon的EclipseC1Plus

1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（60x，100x），NA=1.49.。这是当前数值孔径最高的油浸物镜2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小，可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。3.时间间隔可变的TimeLapse:可以在拍摄过程中不同的时间段采用不同的时间间隔。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第6页!3.优点一.分辨率（0.18μm）二.可重构样品的三维结构三.无损伤、连续光学切片四.光谱扫描（分辨由光源波长，物镜参数和针孔直径等决定，如60X，NA1.4的物镜水平分辨率约为0.2

μm，垂直分辨率约为0.5μm。）（细菌细胞1-2

μm，原核生物细胞1-10μm）共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第7页!4.共聚焦原理利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第8页!共聚焦原理1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大）共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第9页!共聚焦原理消除衍射影响消除背景杂光共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第10页!共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，从上面的图可以看出，非焦平面点所成的像的光像被探测针孔挡住，不会进入光探头，所以焦平面点成像使像更清晰。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第11页!5.扫描模式一.X—Y轴扫描二.Z轴扫描共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第12页!X—Y轴扫描（1）单光束扫描模式共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第13页!X—Y轴扫描（2）多光束扫描共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第14页!同样可以实现

X—Z轴，Y—Z轴扫描共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第15页!光学切片

通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个完整的三维图象共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第16页!6.整体结构

光电倍增管扫瞄装置空气冷却氩激光器激发光滤器共焦针孔屏障滤光片(检流计物镜共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第17页!荧光显微镜的不足:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠7.只能在二维环境下观察。8.样品不能太厚。9.荧光的串绕无法回避。10.放大倍率小。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第18页!1.典型产品Nikon的EclipseC1Plus共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第19页!2.基本组成一、基本组成（一）激光器:多线氩离子(458nm,488nm,514nm)、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633nm)（二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第20页!优点共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第21页!共聚焦原理共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第22页!共聚焦原理假设是场照明（非共聚焦），会导致：一.发生衍射，使像模糊；

二.散射光干扰（即除了成像点外，其余点处有散射光进入探测针孔）；

而点照明则不会有这些问题。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第23页!共聚焦原理2.焦平面点成像共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第24页!共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像质量。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第25页!X—Y轴扫描（1）单光束扫描模式其中最常见的扫描安排结合了两个独立的扫描镜，具有中继光学系统。移动的垂直轴的反射镜即在试样上产生X—Y平面的扫描。但中间需要增加高级别的像差校正光学系统，导致发光效率降低。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第26页!X—Y轴扫描（2）多光束扫描（尼普可夫圆盘扫描）多光束扫描技术提供了一个替代的单光束扫描配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探测的针孔。由于磁盘扫描显微镜形成的实像，可以直接位于CCD照相机的图像平面中。尽管这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态过程，有几个缺点限制了磁盘扫描共聚焦系统的实际效用。其中最严重的是典型的依赖于传统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第27页!X—Y轴扫描奥林巴斯FluoView300激光共聚焦扫描系统光电倍增器双色镜激发和发射滤波滑动器强度调整密度塔激发发射和射柱准直仪电源X-Y检流计镜扫描控制器出入口透镜系统共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理共31页，您现在浏览的是第28页!Z轴扫描通常的方法是通过计算机控制的马达以预先设定的步距移动