原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨课件

原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨北京全式金生物技术有限公司比较pET、pMAL、pGEX

表达系统表达和纯化的优缺点。介绍pET

表达系统表达条件的优化，纯化技巧。离子交换纯化技巧未知蛋白如何选择纯化方法，纯化方法如何组合？三大表达系统比较pET系列(T7promoter,Novagen公司)T7/lac启动子，IPTG诱导表达，6XHis,标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)Tac强启动子，MBP融合，可溶性表达，纯化难以控制，Maltose一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,需要去掉MBP

。pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)Tac强启动子，GST融合，可溶性表达，纯化难以控制，GST一步洗脱，得到的蛋白纯度较低。需要去掉GST.His咪唑浓度梯度洗脱，纯化效果理想。杂蛋白咪唑梯度/mM204080120160目的蛋白His纯化pET载体诱导表达——经典的表达系统表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？温度对表达的影响培养基对表达的影响（e.g.Glucose对表达的影响）菌株的选择不同克隆表达水平的差异溶氧量与培养体积1243不同培养基表达比较pET28a

BL21(DE3)pLysSLane1：表达LBLane2：LBLane3：SOBLane4：TB表达LB：LBadd0.2%glucose目的蛋白不同菌株对表达量的影响不同菌株对蛋白表达的影响1243pET28aLane1：BL21(DE3)Lane2：BL21(DE3)pLysSLane3：Rosetta(DE3)Lane4：BR21CodonPlusRIL目的蛋白蛋白表达的菌株选择菌株启动子特性BL21tac(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统，适用于毒性蛋白的表达BL21(DE3)T7(pET)适用于T7、T7/lac的表达系统，适用于非毒性蛋白的表达BL21(DE3)pLysST7(pET)含有质粒pLysS，具氯霉素抗性，该质粒含有表达T7溶菌酶的基因，可降低目的基因的背景表达水平。适用于毒性和非毒性蛋白的表达Rosetta(DE3)T7(pET)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平BL21CodonPlusRILT7(pET)适用于富含AT的真核生物基因的表达BL21CodonPlusRPT7(pET)适用于富含GC的真核生物基因的表达OrigamiT7(pET)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。包涵体成因：蛋白合成速度过快，无法正确折叠解决办法选择不同的菌株与载体的组合降低蛋白表达的速度

影响蛋白积累的速率：温度，转速，IPTG浓度，诱导OD值……Origami宿主菌

thioredoxin

reductase/glutathionereductase

双突变，帮助形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。His蛋白纯化基本原理影响纯化的因素

咪唑浓度与pH值——咪唑对蛋白纯化的影响

离子强度

去垢剂、还原剂与螯合剂常见问题带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上Ni-chelating分离纯化的效果不好;目的蛋白目的蛋白咪唑梯度/mM10204080120咪唑梯度/mM10204080120Buffer中咪唑初始浓度0Buffer中咪唑初始浓度10mMBuffer中咪唑初始浓度对His纯化的影响蛋白不结合His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5mMEDTA来去除重金属离子的干扰His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）纯化效果不好样品没有很好细心去除不溶性物质——可以离心或过滤重复使用前树脂没有洗干净——充分洗净树脂并再生较多杂蛋白

——提前终止表达引入的杂蛋白，可采用C端融合

——链间二硫键的存在导致杂蛋白出现，可加入还原剂（β-ME）

——去垢剂（Triton、Tween、NP40）

——甘油与NaCl离子交换选择离子交换剂根据序列计算等电点分离纯化的Buffer应使蛋白稳定。根据BufferpH与等电点的大小选择纯化填料洗脱方式：改变pH值或增加盐浓度

——阴离子交换剂：降低pH值，洗脱增加

——阳离子交换剂：升高pH值，洗脱增加

——增加盐浓度，洗脱增加（常用）等电点吸附于阳离子交换剂吸附于阴离子交换剂BufferpH值蛋白质净电荷+-蛋白净电荷与pH关系及交换剂选择选择起始Buffer中的离子强度离子强度越低，蛋白与离子交换剂结合越紧密

但是，也会增强其它蛋白的非特异性结合离子强度越高，蛋白与离子交换剂结合越困难

但是，也会抑制其它蛋白与离子交换剂结合，增进特异性结合，有助于纯化。需要通过实验摸索合适的条件，优化纯化工艺NaCl浓度NaCl浓度初始NaCl浓度20mM初始NaCl浓度50mM初始NaCl浓度100mM初始NaCl浓度对离子交换纯化(DEAE)的影响目的蛋白未知蛋白纯化方法的选择根据载体选择纯化方法根据蛋白质性质

热稳定蛋白---热变性初分离

抗体-抗原，底物-抑制剂，例如RNaseInhibitor

纯化----CNBr-activatedSepharose硫酸铵沉淀与透析蛋白的稳定与活性——Glycerol不同纯化方法的组合纯化方法的组合需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的