现代基因工程-05怎样获得特定基因的克隆课件

基因工程

第五讲：怎样获得特定基因的克隆HowtoObtainaCloneofaSpecificGene

基因克隆实验中，成败的关键往往取决于能否设计出一个合适的方案，将目的基因直接或间接地从其他重组体中挑选出来。一旦解决了这个问题，获得了目的基因的克隆，分子生物学家就能利用多种技术从这个基因中获取各种有用的生物信息。讲课提纲5.1筛选的难题5.2直接筛选目的基因5.3从基因文库中鉴定克隆5.4鉴定克隆的方法5.1.1两种获得目的基因的基本策略虽然获得目的基因的方法有多种，但都是由两种基本的方法演变而来。

(1)直接筛选目的基因

即在克隆实验中所获得的所有克隆都是目的基因的克隆。绝大多数情况，筛选是在平板检出阶段进行。

(2)从基因文库中鉴定目的基因

需要对基因文库的单个克隆进行分析，以选择所需的目的基因。直接筛选目的基因的方法：因其快速、清晰的优点受到青睐。但不能应用于所有的基因。在当前很多生物的完整基因组文库已经建立的情况下，需要用后一种方法获得目的基因的克隆。

质粒R-5带有4种抗生素的抗性基因：卡那霉素、氯霉素、链霉素和磺胺类药剂。

EcoRI酶切产生的13个片段中，有一个含有卡那霉素抗性基因。首先将R6-5的EcoRI所有酶切片段插到某个载体上的EcoRI位点(如pBR322)。连接物中混合有这13个不同重组体的多拷贝，其中一组携带有卡那霉素抗性基因。trpA-突变株可用于克隆正常的trpA基因首先从一野生型菌株中纯化出完整的DNA，用一个限制性内切酶酶切后，再连于载体上。这样产生出的无数重组DNA分子中将会有一个携带了完整的trpA基因[图8-4(a)]。而该基因来自于野生型菌株，是有功能的trpA基因。

用这些连接混合物转化营养缺陷型的大肠杆菌TrpA-细胞[图8-4(b)]，绝大多数转化体仍然是营养缺陷型，只有少数转化体的质粒才含有正常的ttrpA基因拷贝。这些非营养缺陷型重组体不再依赖培养基中的色氨酸，因为转化进去的trpA基因可以直接产生色氨酸合成酶[图8-4(c)]。将这些转化体接种于基本成分培养基上(无任何添加成分，特别是无色氨酸)，就可以进行直接筛选[图8-4(d)]。营养缺陷型转化体不能在该培养基上生长，出现的菌落就是含有克隆的trpA基因的转化体。5.2.2标志获救的范围与局限虽然标志获救可用于获得许多基因，但仍有两方面的局限性。

(1)必须要有与待测基因对应的突变株。

(2)需要只有野生型才能生长的培养基。标志获救适用于多数编码生物合成酶的基因，因为这些基因的克隆可通过类似用于trpA的方法在基本培养基上筛选出来。这一技术并不局限于大肠杆菌，甚至不局限于细菌；在酵母和丝状真菌的营养缺陷型菌株中，利用标志获救同样可以筛选克隆基因。大肠杆菌的营养缺陷型菌株也可以作为宿主筛选来源于其他生物体的基因。通常，来自其他细菌或酵母的酶，因与大肠杆菌中相应的酶有着足够的相似性，能够在大肠杆菌中发挥同样的用，使得克隆的基因可以把宿主恢复成野生型。5.3.1基因文库基因组文库(图6-4)：是某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆的数目足够大，使这一生物体的每一个基因都能包含进去。基因组文库的制备需以下步骤：纯化全细胞DNA，部分限制性酶切得到适当大小片段，插入到合适的载体上。通常选用的载体有：

λ置换载体、黏端质粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或者P1载体(图8-5)。5.3.2并非所有的基因都同时表达大部分多细胞生物体的一个典型特征是细胞的特化。每种细胞都含有完整而相同的所有基因，但在不同的细胞类型中，有的基因开启而有的基因是关闭的。因为任何一种细胞中都只有部分基因表达，利用这一事实来制备基因文库：制作文库的起始材料不是DNA而是mRNA。以mRNA为起始材料所得的克隆只包含整个细胞所有基因的一部分。当目的基因在某一细胞类型中高表达时，这种利用mRNA的克隆方法显得特别有用。例如，麦醇溶蛋白是小麦中一种重要的营养蛋白，在发育的小麦种子中，编码的麦醇溶蛋白基因高水平表达。这些细胞中总mRNA的30％是麦醇溶蛋白的mRNA。显然，如果从小麦种子中克隆mRNA，将会得到大量特异表达麦醇溶蛋白的克隆。5.3.3mRNA可通过cDNA进行克隆信使RNA本身是不能与载体相连的，但它可以通过合成cDNA(complementaryDNA)转变为DNA双链。关键：逆转录酶（以RNA单链为模板合成互补的DNA多核苷酸链)。一旦合成cDNA后，杂交链中的RNA可用RNaseH处理使之降解。剩余的RNA片段可作为引物，在DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二条链。形成的双链DNA片段可连接到载体上进行克隆。得到的cDNA克隆代表了最初制备时的mRNA。在从小麦种子中提出的mRNA而建立的cDNA文库中，麦醇溶蛋白的mRNA克隆占了很大比例。其他的克隆虽然也存在，但此时筛选麦醇溶蛋白cDNA克隆远比在整个小麦完整的基因组中进行筛选容易。5.4鉴定克隆的方法制备好合适的文库后，可利用许多方法对目的克隆进行鉴定。虽然有一些方法是通过检测克隆基因的翻译产物来鉴定重组体的，但往往直接鉴定正确的重组体DNA分子更为容易。这将用到一项重要的技术—杂交探针(hybridizationprobing)技术。5.4.1互补核酸链的相互杂交任意两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势。但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定。但如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。这一现象不仅仅发生在单链DNA分子之间形成DNA双螺旋，单链RNA分子之间以及单链RNA与单链DNA之间也可以杂交。如果用目的基因的互补DNA或RNA作探针，就可利用核酸杂交(nucleicacidhybridization)鉴定出特定的重组体克隆。5.4.2用于菌落和噬菌斑的杂交探针技术重组体DNA分子无论是存在于菌落中还是存在于噬菌斑中，都可以用杂交探针技术鉴定出来。由于一项20世纪70年代发展而来的新技术，我们并不需要纯化每一个重组体。这项技术就是原位杂交技术。首先把菌落或是噬菌斑转移到硝酸纤维膜或是尼龙膜上，处理除去杂质，只留下DNA。通常以上处理步骤同时会使DNA分子变性，双螺旋之间的氢键会断裂。如所用的是硝酸纤维膜，短时间的80℃的加热会使这些单链DNA分子牢牢结合到膜上；如果使用的是尼龙膜，处理方法相应的改为紫外光照射。DNA分子与膜结合的部分是它们磷酸化的五碳糖主链，这样它们的碱基是自由的，可以和互补的核酸分子配对。方法：然后把探针加上标签，加热变性，再加到适宜核酸退火的化学溶液中与膜结合。经过一段时间，等杂交已经发生后，洗去没有结合的探针，干燥，现在就可以检测结合的探针的位置。传统的方法是给探针标记上放射性的核苷酸。标记的方法：缺口翻译、末端填平、随机引物法(randompriming)[图8-10]。其中随机引物法可以产生高活性的探针，能够探测出与膜结合得很少量的DNA分子。用以上方法，杂交信号的位置可以通过放射自显影探测出来。不过，放射性标记已不再流行，部分是因为它对研究人员身体的伤害，部分是因为实验产生的放射性污染物的处理问题。已开发出来的大量的非放射性方法，图8-11解释了其中两种操作流程。第一种方法：使用dUTP和生物素(biotin)反应；生物素是一种有机分子，与抗生物素蛋白(或亲和素，avidin)有很高的亲和性。再用反应产物去标记探针，使探针带上生物素。杂交后，用结合荧光标记的抗生物素蛋白去检出探针的位置。这种方法与放射性标记具有相同的敏感度，正变得越来越流行。另一种方法：将探针DNA分子用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)标记;

辣根过氧化物酶有降解鲁米诺(氨基苯二酰肼)的活性，同时伴有化学荧光信号的发出。与放射自显影类似，这种荧光信号可以被普通胶卷记录下来。5.4.3杂交探针实际应用的例子从菌落或是噬菌斑中鉴定某个特定重组体的方法能否成功的一个前提：是否可以得到合适的核酸分子作探针。探针至少与被克隆的基因有着部分序列的互补性。当试验的目的是要获得某个原本不了解的基因时，要用什么来作为探针呢?

实际上，可以通过已有的有关该基因的信息来确定探针的性质。可以考虑以下3个可能性：

(1)目标基因在某种细胞类型中高表达，可以考虑从这种特定细胞类型的文库中筛选该基因。

(2)该基因编码蛋白质的氨基酸序列已知或者部分已知。

(3)该基因属于某个已知的家族。用高丰度重组体作探针分析cDNA文库

当我们想获得在某种类型的细胞中有相对较高的表达量的基因克隆时，则先制备该细胞的cDNA文库。如制备正在发育的小麦种子的cDNA文库中，有相当大比例的克隆是麦醇溶蛋白基因的mRNA。鉴定麦醇溶蛋白克隆：用文库中的某一个cDNA克隆作探针去检测文库中的其他克隆(图8-12)。随机选择一个克隆，纯化重组DNA分子，作上标记，用作探针检测其他克隆。用不同的克隆作探针重复以上步骤，直到发现某一个克隆可以与文库中相当大比例的克隆相杂交。这个丰富存在的cDNA被认为很可能是麦醇溶蛋白，并进一步作更细致地分析以确定，如进行DNA测序或是分离它的表达产物。用于编码特定表达产物的基因的寡核苷酸探针由于蛋白质测序技术已经发展了四十多年，很多蛋白质的序列也是已知的。如果已知氨基酸序列，就可以用遗传密码来预测相应基因的DNA序列。这种预测通常是不精确的，因为只有甲硫氨酸和色氨酸对应一个三联体密码，其他所有的氨基酸都至少由两个密码子编码。然而，在大多数情况下，编码同一个氨基酸的密码子是有一定联系的。例如丙氨酸，被GCA，GCT，GCG和GCC编码，三联体密码的三分之二可以很明确地预测出来的。以细胞色素c为例说明细胞色素c是一种需氧生物的呼吸链中起重要作用的蛋白质。早在1963年，就测出了来源于酵母的细胞色素c的氨基酸序列，结果显示在图8-13中。这个序列包含一个片段，从第59个氨基酸起分别是Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met。由遗传密码可知，编码这个六肽的DNA序列是TGG-GAT／C-GAA／G-AAT／C-AAT/C-ATG。尽管存在16种不同的可能序列，但18个核苷酸中有14个是可以精确地预测出来的。

实验室中，长度小于50bp的寡核苷酸序列是可以很容易被合成出来的(图8-14)。据预测的核苷酸序列，可以合成所需的寡核苷酸探针，有可能用这个探针鉴定目的基因。细胞色素c这个例子中，合成编码Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met的16种可能的寡核苷酸序列；分别使用16种探针或是混合作为一个探针库，检测酵母的基因组或是cDNA文库(图8-15)。其中将会有一个探针是正确的序列，能够和细胞色素c基因的那个区域相杂交，而杂交的信号将指示出是哪一个克隆携带了该基因。从细胞色素c的蛋白序列中选出另外一个不同的片段，据此合成另一套寡核苷酸探针，用来检验第一次检出的结果。但是第二个片段的选择一定要注意：例如紧挨着上次选择的另一个六肽Ser-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn，可能被几千种不同的18bp的DNA序列编码，很明显不是一个合适的选择。用于鉴定相关基因的异种探针技术比较来源于不同生物、编码同一种蛋白质的两个基因时，通常会发现它们有着很高的序列相似性，这反映了在进化过程中基因结构的保守性。因此，根据其中一个物种基因合成的探针往往也能够与另一个物种基因进行很牢固的杂交。尽管两个DNA分子并不是完全互补的，只要能够形成足够多的核苷酸配对，杂交双链仍然是很稳定的[图8-16(a)]。异种探针技术(heterologousprobing)：利用这种不同来源的DNA分子相应序列间的杂交鉴定克隆的。例如，前面用寡核苷酸探针技术鉴定出了酵母的细胞色素c，可以作为杂交探针来鉴定其他生物中的细胞色素c基因，如脉孢菌(Neurosporacrassa)中的细胞色素c基因。尽管它们并不完全配对，但足够多的氢键保证了杂交结构的形成，通过放射自显影探测出杂交信号[图8-16(b)]。试验的操作条件会有一些变化，因为杂交结构并不是很稳定，有可能在放射自显影前丢失掉探针。异种探针技术还可以用来鉴定同种生物内的相关基因。例如，前面部分鉴定出了小麦的麦醇溶蛋白的cDNA克隆，用它作探针检测整个小麦的基因组文库，它杂交的不仅仅是它自身的基因，还会有一些其他的基因[图8-16(c)]。它们都是与麦醇溶蛋白cDNA相关的基因，只在核苷酸序列上有着轻微的不同。这是因为麦醇溶蛋白和相关蛋白，形成了一个多基因家族(multigenefamily)成员编码的复杂群体。一旦克隆了这个家族中的一个基因，用异种探针技术可以把该家族中的其他成员分离出来。5.4.4基于检测克隆基因产物的鉴定技术要从一个基因文库中鉴定某一特定的重组体，通常会优先考虑杂交探针技术。这项技术有着很好的操作性，而且由于近几年来的