导学案 血红蛋白的提取和分离

高二年级生物选修1导学提纲（六）专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离班级____________学号__________姓名_______________一、课题目标本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。二、课题重点与难点课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。三、学习过程A、自主学习（一）、基础知识一、凝胶色谱法1、概念：也称做；是根据分离蛋白质的有效方法。2、原理：(1)由构成的凝胶，内部有许多贯穿的的。⑵当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，从而使不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液1、作用：在一定范围内，抵制的对溶液pH的影响，维持pH。2、配制：由种缓冲剂溶解于中配制而成，通过调节缓冲剂的就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。三、电泳1、概念：指在电场的作用下发生的过程。2、原理：在一定的下，、等生物大分子的可解离基团会带上或，在的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中的分离。4、方法：常用的电泳方法有和。测定蛋白质分子量时通常使用。四、实验操作1、样品处理:通过、、等操作收集血红蛋白溶液。(1)红细胞的洗涤：目的是。分离时采取，直至上清液中没有，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放：在和的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把离心后，将试管中的液体用过滤、除去，于中静置片刻后，分离出下层的。2、粗分离：即透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入，将放入一定量适宜浓度的中，透析。(2)目的：将的杂质除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作。(2)凝胶色谱柱的装填①材料：本实验使用的是。②方法：凝胶用充分溶胀后。配成，一次性倒人色谱柱内。不能有存在；不能发生流干，露出凝胶颗粒的现象。(3)样品的加入和洗脱①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口。b、加样：用小心地将1mL透析后的样品加到的顶端，注意不要破坏。c、加样后：打开下端出口，使样品渗入内。②洗脱：加入，打开下端出口，进行。4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是。五、操作提示1、红细胞的洗涤：、与十分重要。过少，无法除去血浆蛋白；过高和过长会使等一同沉淀，达不到分离效果。2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在中膨胀，可以将加入其中的用加热，加速膨胀。3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的，降低。4、蛋白质的分离：如果红色区带地移动，说明色谱柱制作成功。B．重点、难点突破⑴是否完成对血液样品的处理观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。⑵凝胶色谱柱的装填是否成功。由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。⑶血红蛋白的分离是否成功如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。⑷你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。⑸课后练习1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。【典例导析】类型一凝胶色谱法分离蛋白质【例l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是，原因是。(2)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是。(3)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是。【思路点拨】(1)a；相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。(2)因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(3)相同；凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。类型二探讨电泳的原理【例2】蛋白质分子中，氨基酸的α-氨基和α-羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α-氨基和α-羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题：根据等电点的不同，你能用方法将不同种类的蛋白质分子分开。【思路点拨】根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。C．反馈矫正1．凝胶色谱法可以有效的分离蛋白质的根据是A．分子的大小 B．相对分子质量的大小C．带电荷的多少 D．溶解度2．利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是A．相对分子质量大的 B．溶解度高的C．相对分子质量小的 D．所带电荷多的3.凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是A.糖类化合物B.脂质C.蛋白质D.核酸4．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个5．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快6．能进入凝胶内部通道的蛋白质是指A．相对分子质量大的B．吸附性高的C．相对分子质量小的D．溶解度低的7．凝胶色谱法中移动得快的是 A．相对分子质量大的B．溶解度高的C．相对分子质量小的D．溶解度低的8．缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的A．温度B．pHC．渗透压D．氧气浓度9．初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为A．H2CO3一NaHCO3缓冲液B．NH4OH—NH4Cl缓冲液C．CH3COOH—CH3COONa缓冲液D．H3PO4缓冲液10．蛋白质提取和分离分为哪几步A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定11.血红蛋白因含有什么物质而呈红色 A.O2B.COC.CO2D.血红素12.将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是 A.甲苯B.血红蛋白水溶液C.脂溶性物质的沉淀层D.其他杂质的沉淀13．分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于A．一B．二C．三D．四14.下列操作正确的是A.分离红细胞时采用低速长时间离心B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h15．使用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的迁移速度完全取决于A．电荷的多少 B．分子的大小C．肽链的多少D．分子形状的差异16．洗涤红细胞的目的是A．去除血清 B．去除杂蛋白C．除去血小板D．除去水17．洗涤红细胞时，分离所用的方法为A．低速长时间离心B．低速短时间离心C．高速长时间离心D．高速短时间离心18．SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是A．增大蛋白质的相对分子质量B．改变蛋白质的形状C．掩盖不同种蛋白质问的电荷差别D．减少蛋白质的相对分子质量19．制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是A．移液管头部5cm B．移液管尾部5cmC．移液管头部3cm D．移液管尾部3cm20．下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是 A．先加入1mL透析后的样品B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功 D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水21．在下列哪一种条件下生物大分子具有的可解离的基团会带上正电或负电A．一定温度 B．一定pHC．一定压强 D．一定容器22．电泳时带电粒子在电场的作用下，移动所向的电极的方向与其所带电荷是 A．桕同 B．相反 C．相对 D．相向23．装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应 A．先打开后关闭B．关闭 C．先关闭后打开 D．打开24．D亚铁血红素基团可携带A．一分子COB．一分子NO C．一分子O2或CO2 D．一分子NO225．人体正常的血红蛋白中应含有Fe2+，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe2+。转化为Fe3+，产生高价铁血红蛋白而中毒。服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反应中A．亚硝酸盐是还原剂 B．维生素C是氧化剂C．亚硝酸盐被氧化 D．维生素C将Fe3+还原为Fe2+26．加有少量柠檬酸钠(防止血液凝固)的猪血分装于标号①、②、③的试管中，随后依次加入质量分数为0．3％、0．9％和1．5％的氯化钠溶液稀释，30min后离心。下列叙述中，正确的是A．①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞B．②和③试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有皱缩的红细胞C．①和③试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞D．②和③试管的上清液是血清27．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C．防止血红蛋白被02氧化D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能28．在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明A．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动B．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动C．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动D．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动29．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂A．NaCIB．甲苯C．蒸馏水D．柠檬酸钠30.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度31.红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：（1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：________、________、________和_________。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。①加入柠檬酸钠的目的是__________________。②以上所述的过程即是样品处理，它包括______________、______________、离心等操作收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。①透析的目的是___________________________________。②透析的原理是____________________________________________________。（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。①样品纯化的目的是______________________________。②血红蛋白有什么特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？附：课题1DNA的粗提取与鉴定的参考答案A、自主学习（一）、基础知识思考题1、DNA在氯化钠溶液中的溶解度，随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出；思考题2、DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。2蛋白质DNA60-8080洗涤剂3蒸馏水思考题3、DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，所以可用二苯胺作鉴定。思考题4、不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。柠檬酸钠思考题5、加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。思考题6、使氯化钠溶液浓度接近0．14mol/L，使DNA最大限度地析出。思考题7、不一样；这次过滤是为了去除溶于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。思考题8、除去含有DNA滤液中的杂质；思考题9、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。思考题10、去除溶于酒精的杂质；思考题11、可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNA；降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。思考题12、确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；实验组试管中可看到溶液变蓝色。C．反馈矫正：1．B2．C3．B4、C5、C6、B7、C8、C9．C10．AC11．（1）②中“20ml／L的氯化钠溶液”错误，应改为“20ml蒸馏水”②中“经滤纸过滤”错误，应改为“经纱布过滤”④中“直到溶液中出现丝状物为止”错误，应改为“直到溶液中丝状物不再增加时为止”（2）凝集DNA溶解其他细胞物质12．13、（1）DNA（2）使血细胞吸水涨破，释放出核物质DNA（3）使DNA溶解于NaCl溶液中（4）使DNA的溶解度下降而析出（5）二苯胺蓝色14、⑴含细胞核；红；DNA⑵无细胞核；肝细胞有细胞核⑶研磨15、⑴蒸馏水⑵2mol/LNaCl溶液⑶蒸馏水⑷冷却的95%的酒精⑸二苯胺附；课题3血红蛋白的提取和分离的参考答案（一）、基础知识一、凝胶色谱法分配色谱法相对分子质量的大小糖类化合物通道相对分子质量较小较长较慢较大外部较短较快相对分子质量 二、缓冲溶液外界酸和碱基本不变1-2水比例三、电泳带电粒子迁移PH多肽核酸正电负电电场相反带电性质大小形状迁移速度各种分子琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳四、实验操作洗涤红细胞血红蛋白的释放离心去除杂蛋白低速短时间离心黄色蒸馏水甲苯混合液滤纸脂溶性沉淀分液漏斗红色透明液体透析袋中透析袋磷酸缓冲液12h分子量较小交朕葡聚糖凝胶蒸馏水凝胶悬浮液缓慢气泡洗脱液缓冲液凝胶面吸管色谱柱凝胶面凝胶床柜适宜浓度的磷酸缓冲液洗脱SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳五、操作提示洗涤次数离心速度离心时间洗涤次数离心速度时间白细胞洗脱液湿凝胶沸水浴洗脱次序分离效果均匀一致C．反馈矫正1B2A3A4B5D6C7A8B9D10C11D12C13C14D15B16B17B18C19A20C21B22B23D24C25D26C27D28A