蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。（二）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。卵清蛋白分离提取及纯化的具体试验步骤一、实验目的与原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。二、材料与试剂：材料：新鲜鸡蛋2只2：仪器：抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器3：试剂：10%TCA，用固体NaOH调调PH至1.05-1.10，需要50ml、5NHCL、5NNaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50mlpH8.0,0.1MTris-HCL缓冲液三、操作步骤1，取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25°C—30°C，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸一丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5,再继续搅拌30min，然后在4C冰箱中放置过夜。次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。边搅拌边加入4。。预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4C放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min，去除不溶物。抗菌蛋白分纯的步骤准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。操作步骤：取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2〜8°C12000Xg离心10分钟弃上清。用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2〜8°C7500Xg离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。真空抽十蛋白质沉淀5〜10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50C温浴使其完全溶解，不溶物2〜8C10000Xg离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20C保存备用。注意事项：蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2〜8°C一个月以上或-5至-20C一年以上。用0.1%SDS在2〜8C透析三次，lOOOOXg离心10分钟取上清即可用于WesternBlot。常见问题分析：得率低：样品裂解或匀浆处理不彻底。最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。Y球蛋白分离，纯化，鉴定的方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项）［原理］血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、P-球蛋白和Y-球蛋白，其中Y-球蛋白含量约占16%,100ml血清中约含1.2g左右。首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中（常用硫酸铵）溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有Y-球蛋白的粗制品。用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中.因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。a一球蛋白、p-球蛋白的PI<6.0；Y一球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的a一球蛋白和P-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的Y一球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有Y一球蛋白，从而使Y一球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：用上述方法分离得到Y一球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的Y一球蛋白进行电泳比较而鉴定之。［操作］盐析一一中性盐沉淀：取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9%氯化钠溶液2.0ml,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min,3000r/min离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5〜1.Oml使之溶解。此液即为粗提的Y一球蛋白溶液。脱盐凝胶柱层析装柱洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20%磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。纯化一一DEAE纤维素阴离子交换层析：用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。浓缩一一经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的Y一球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的Y一球蛋白溶液2ml,按每ml加0.2〜0.25gSephadexG一25十胶，摇动2〜3min,3000r/min离心5min。上清液即为浓缩的Y-球蛋白溶液。鉴定一一乙酸纤维素薄膜电泳取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的Y-球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十四：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。［注意事项］凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l：l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。本法是利用Y-球蛋白的等电点与a-、&-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。电泳注意事项见实验二十四。凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02%叠氮钠。保存于4°C冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存。脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽十后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若十时间，最后一次用95%乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽十后，于60〜80C烘干贮存。离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4ho离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0.02%叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。浓缩Y-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯毗咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10°C以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如SephadexG一25十胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。［试剂］饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80C水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结品，上清液即为饱和硫酸铵溶液。葡聚糖凝胶G一25的处理：按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G一25十胶25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻混匀，置于90〜100C水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2〜3次，然后加0.017mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g称取，每克加0.5mol/L盐酸溶液15ml，搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽十)，直至上清液pH>4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)A液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H20)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000ml。B液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)6.269g，