脲酶的测定方法

一、脲酶测定（比色法）脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9%,（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。（4）10%尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。2、操作步骤称取5g土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液（pH6.7）,仔细混匀。在37°C恒温箱中培养24h。然后用热至38°C的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上），摇荡，将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后，立即将混合物摇匀,20min后，将混合物稀释至刻度,在波长578nm处测定吸光值。服酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差，根据标准曲线求出氨态氮量。标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。3、结果计算

以24小时后1g土壤中NH3-N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）Ure=a•V,n/m式中:a为由标准曲线求得的N^-N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。补充：1）1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。2）无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照3）无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。过氧化氢酶测定（容量法）过氧化氢酶也叫接触酶，能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。几乎在所有的生物体内部有过氧化氢酶，在某些细菌里，其数量约为细胞干重的1%。土壤的过氧化氢酶活性，与土壤呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度。原理过氧化氢酶的测定有测压法和滴定法。测压法是测定过氧化氢分解时析出的氧量（反应式为：h2o2+h2o过氧化氢酶o2+h2O,方法简单，但准确性较差。后者则是定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量，反应式为2KMnO4+5H2O2+3H2SO4>2MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2，此法测定结果较好。试剂（1）0.3%H2O2:按1：100将30%的H2O2用水稀释。（2）3NH2SO4（也就是1.5mol/lH2SO4）:以配1000ml为例，需要的浓硫酸的体积为1.5*98.08/1.83=80.39ml，可以取80ml。KMnO4的分子量=158.026，当量=31.605.高锰酸钾水溶液受到水中还原物和杂质以及受

日光直射等影响能分解析出棕色的含水的二氧化锰沉淀，而有浓度的改变。因此在配制其标准溶液时必须使用棕色瓶盛装，以防日光直射作用.配制后并应放置一段时间，待与水中还原物完全作用后，滤去沉淀，然后进行标定，才能得到基本稳定不易变化的标准溶液。(3)0.1NKMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161克，溶于l升无CO2蒸馏水(沸水)中，溶解后，在暗处放置一周，然后用虹吸管将上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉滤过)保存，以备标定.注：C(1/5KMnO4)=0.1mol/l表示的就是0.1NKMnO4溶液。0.1NKMnO4溶液标定(GB/T601-2002)称取0.2g(准至0.0001g)于105〜110°C烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL(8+92)硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液[(1/5KMnO4)=0.1mol/l]滴定，近终点时加热至65C，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验(不加草酸钠，其他一样)。高镒酸钾溶液标准浓度按下式计算c(1/5KMnO4)=m*1000/[(V1-V2)*M]式中c(1/5KMnO4)一高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L；m——草酸钠之质量，g;V1—一滴定草酸钠消耗的高锰酸钾溶液之用量，mL；V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；M——草酸钠的摩尔质量的数值,单位为(g/mol)，[M(1/2Na2C2O4)=66.999]或者c(1/5KMnO4)=m/(V1-V2)*0.067000.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c(1/5KMnO4)=0.1mol/1相当的以克表示的草酸钠的质量。操作步骤：取2.0g土，置于100mL(或150ml)三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3%H2O2溶液。(B)同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢溶液，而不加土样。(A)将三角瓶放在往返式振荡机上120r/min振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1NKMnO4滴定至淡粉红色终点。结果计算用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B,用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。以20min后1g土壤消耗的0.1NKMnO4溶液的毫升数表示（以20min后1g土壤中的过氧化氢的毫克数表示？）。土壤过氧化氢酶活性=（A-B）XT/dwt式中，T——为高锰酸钾滴定度的校正值。dwt烘干土质量（g）滴定度：分析化学专属名词单位：g/ml、mg/ml表示符号：Ts：每毫升标准溶液中所含滴定剂（溶质）的克数。例如：THci=0.001012g/ml的HCl溶液，表示每毫升此溶液含有0.001012g纯HCl。Ts/x:指每毫升标准溶液相当于的待测组分的质量。S：代表滴定剂（标准溶液）的化学式。X：代表被测物的化学式。例如：THCl/Na2CO3=0.005316g/mlHCl溶液，表示每毫升此HCl溶液相当于0.005316gNa2Co3。例：用T（EDTA/CaO）=0.5mg/ml的EDTA标准溶液滴定含钙离子的待测溶液，消耗了5ml,则待测溶液中共有CaO2.5mg。计算方法：T=n*M/V或T=C*M土壤蔗糖酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一、原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4-2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80°C烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀(冰箱中4°C保存期约一星期)。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。3)3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml(保存期不过7天)。三、操作步骤标准曲线绘制分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂1mL混匀，于沸水浴中准确反应5min(从试管放入重新沸腾时算起)取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长508nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。土壤蔗糖酶测定称取1g土壤，置于50mL三角瓶中，注入3ml8%蔗糖溶液，1mlpH5.5磷酸缓冲液和200uL甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37C下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加1mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至7ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。四、结果计算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。蔗糖酶活性=(a样品一a无土一a无基质)Xn/ma样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；土壤多酚氧化酶活力的测定试剂配制1%邻苯三酚溶液乙醚0.5N盐酸（4）重铭酸钾标准溶液——0.75g重铭酸钾溶于1升0.5NHCl（相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素）（5）pH4.5柠檬酸——磷酸缓冲液。标准曲线的绘制：取重铭酸钾标准溶液，用0.5NHCI稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。投作步骤取1g土样（过0.25mm筛），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。取出后加4mlpH4.5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片。为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正。没食子酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。在无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。活性表示紫色没食子索的量，根据用重铭酸钾绘制的标准曲线查知。多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。纤维素酶活性测定一、试剂：1）醋酸缓冲液（pH5.5）：164.08g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1L。2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7g羧甲基纤维素钠盐溶于1L醋酸缓冲液，45°C下搅拌2h，此溶液在4C下可存放7天。3）还原糖试剂：试剂A：16g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1L。试剂B：0.5g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1L，贮于棕色瓶中。试剂C：1.5g硫酸铁铵（NH4SO4Fe2（SO4）2・H2O）、1g十二烷基硫酸钠（C12H2sO4SNa）和4.2ml浓硫酸溶于50°C去离子水，冷却后稀释至1L。4)水合葡萄糖溶液：28mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1L。二、仪器设备恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶三、操作步骤取10.00g(耕地)或5.00g(林地)新鲜土壤(V2mm)于100ml三角瓶中，加15ml醋酸缓冲液和15mlCMC溶液，盖上塞子，于50C下培养24h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15mlCMC溶液，并迅速过滤。取2.00ml滤液于50ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00ml稀释液于20ml试管中，加2.00ml还原糖试剂A和2.00ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100C水浴中加热15min后，立即至于20C水中冷却5min。加10.00ml还原糖试剂C，混匀，20C下静置显色60min，于690nm波长处比色测定(要求在30min内完成)。标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c)空白：无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。四、结果计算土壤纤维素酶活性(gg-g-1-(24h)-1)=(C*V*f)/dwt式中C为样品的葡萄糖含量(gg-ml-1)；V为土壤溶液体积(30ml)；f为稀释倍数(25)；dwt为烘干土壤质量(g)五、注意事项此