万古霉素产生菌的分离及育种课件

一株万古霉素产生菌的分离及育种文献来源：厦门大学学报文献作者：王明兹、黄翠莲、吴莹莹万古霉素的产生菌的选育技术路线实验内容

实验对象：一类稀有放线菌——拟无枝酸菌基本原理：

运用分子育种中的基因组重排技术技术选育万古霉素高产菌实验方法得出结论技术路线图

万古霉素（vancomycin）是由McCormick等于1955年从一株东方拟无枝酸菌（A.orientalis）的发酵液中分离得到的一种糖肽类抗生素。它能够抑制革兰氏阳性菌的生长，而对厌氧菌和革兰氏阴性菌无效。1958年获FDA批准上市.它是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）等引起的严重或致命感染的重要药物，对多重耐药性肠球菌感染性疾病也有突出疗效.随着对链霉菌的广泛筛选，大量生物活性物质被重复发现，从链霉菌得到新的生物活性物质的几率逐渐下降．因此，那些用常规方法较难分离到的稀有放线菌逐渐被重视，获得这些新型菌株可避免对产生已知生物活性物质的常见菌株的重复分离。稀有放线菌的分离成为获取新抗生素的重要途径之一，也是获得新种属和新物质的重要手段．

通过利用菌株的形态特征、生理生化特性和分子生物方法从土壤中分离万古霉素产生菌，并采用育种技术选育具备工业化潜力的万古霉素高产菌株，为进一步研究奠定基础。实验材料1.万古霉素产生菌：东方拟无枝酸菌ＸＭ０３０１由本实验从厦门集美土样中分离．2.指示菌：枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌购自中国医学细菌保藏管理中心．3.培养基枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌：ＬＢ培养基。拟无枝酸菌分离培养基：高氏一号培养基（含有万古霉素５０ｍｇ／Ｌ、重铬酸钾５０ｍｇ／Ｌ和制霉菌素５０ｍｇ／Ｌ），ＸＭ０３０１发酵培养基结果

通过利用制霉菌素、重铬酸钾和万古霉素分别抑制真菌、细菌和链霉菌等杂菌生长，高效地富集稀有放线菌，从来自厦门集美的２号土样中分离出XM0301，在高氏培养基上为草帽型放射状菌落，白色孢子。

3.生物活性鉴定采用抑菌圈法，分别以枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，测定分离菌株发酵液抗菌活性．

综合培养、形态、生理和生化等特征，初步判定筛选的XM0301为拟无枝酸菌属，进一步测定其16SrDNA序列［NCBI登录号为DQ990889］，与无枝酸菌属相似性达100％，比对分析结果表明XM0301为一株东方拟无枝酸菌。4.产物鉴定根据Ｄｉａｎａ等方法修改设计ＨＰＬＣ条件，以Ｓｉｇｍａ公司盐酸万古霉素为标样分别采用保留值法和内标法对XM0301发酵产物进行HPLC测定．通过ＨＰＬＣ分析，ＸＭ０３０１发酵液主要产物保留时间为6.2min左右（图Ｂ），与万古霉素标准样品的保留时间一样（图Ａ）．进一步采用内标法比较分析，在XM0301发酵液中添加万古霉素为内标后，6.2min峰强度明显增强，其他各峰基本不变，XM0301的主要产物为万古霉素，含量为860μｇ/mL（Ｂ、Ｃ）.实验步骤二获得高产菌株

通过育种技术提高万古霉素产生菌株的产量和产率，是获得更大经济效益的另一途径．本文采取原生质体诱变和基因组改组（基因组重排）技术选育万古霉素高产菌株。基因组改组技术是结合经典诱变育种和原生质体融合技术发展起来的一种育种新手段，在诱变产生遗传多质性的基础上，通过多亲本原生质体融合，使带有不同基因位点正向突变的数个亲本杂交，基因重组产生新的复合子，然后进行筛选，最后获得具有多重正向进化标记的高效菌株．ＸＭ０３０１原生质体诱变

参考Kieser等方法修改：调整原生质体浓度，确定合适的诱变剂量，加入NTG诱变。采用离心法终止诱变反应。筛选高产菌株-浓度梯度法

用双层法制成浓度梯度平板，在高浓度区域长出的菌落具备抗生素高产性能。最终从原生质体诱变再生平板上随机分离了10464个突变菌株．2.基因组改组（基因组重排）原生质体融合

选择诱变高产菌株为亲本进行基因组改组，各亲本菌株制备原生质体，分别用紫外或加热灭活亲本原生质体后等比例混合各亲本原生质体，用PEG作为融合剂，室温下融合，Ｐ液梯度稀释后再生，分离再生改组菌落，测定各菌株活性筛选高产菌株．高通量筛选模型-琼脂平板活性圈法

首先准备一块玻璃板，用含有枯草芽孢杆菌的琼脂在玻璃框上制备平板，然后将含有相应的突变菌株发酵液的牛津杯放置在琼脂平板上，培养。

最后测定各样品抑菌圈大小．通过比较各样品抑菌圈大小，可以快速筛选出产量提高的高产突变菌株．完整的筛选过程参见下图：万古霉素产生菌育种筛选流程图研究结果

利用稀有放线菌分离培养基高效地富集稀有放线菌．并从采自集美的土样中分离了产万古霉素的东方拟无枝酸菌，同时也有多株其他非链霉菌属放线菌。

对分离的XM0301先进行原生质体诱变，然后通过基因组改组，快速定向进化，最终获得万古霉素产量达到4210μg/mL的菌株。第一轮基因组改组后随机分离288个菌株，产