流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件

流式细胞仪上海交通大学医学院丁磊副教授流式细胞仪上海交通大学医学院1流式细胞术(FCM)定义:

FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。FALSSensorLaser流式细胞术(FCM)定义:FALSSensorLaser2特点:

单细胞的流动的活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞特点:3一、流式细胞仪的分析及分选原理二、数据的显示与分析三、流式细胞仪分析的技术要求四、流式细胞术应用一、流式细胞仪的分析及分选原理4

一工作原理：

FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。流式细胞仪的分析及分选原理一工作原理：流式细胞仪的分析及分选原理5

1、液流系统样品流和鞘流2、光学系统激光、透镜组、光电倍增管等。3、数据处理系统(一）基本组成结构1、液流系统样品流和鞘流(一）基本组成结构6InjectorTip荧光信号激光束Sheathfluid样品流和鞘流1、液流系统Injector荧光信号激光束Sheath样品流和鞘流1、7流动室LaserFlowCell孔径50-200m

检测区离喷口200m有分选功能

流动室LaserFlowCell孔径50-200m8流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件9液流驱动系统（示意图）流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。

液流驱动系统（示意图）流速与压力的关系服从Bernoulli10PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

激光、透镜组、光电倍增管等。2、光学系统

PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBan11E0E0E0E1E1E1

吸收自发辐射受激辐射hvhvhvhvhv

当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚,发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向和恒定的位相关系,这种发射称受激发射.E0E0E0E1E1E1吸收自发辐射受激辐射hvhvhv12

球透镜和柱面透镜：20×200m椭圆形光，短轴和细胞流平行，长长轴与细胞流垂直。光束成形与细胞受照方式球透镜和柱面透镜：光束成形与细胞受照方式13激发光焦斑这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照

FCM的单细胞照明技术.光束成形与细胞受照方式激发光焦斑这种椭圆形光斑的光束成形与细胞受照方式14（二）基本工作原理（二）基本工作原理15单细胞流：流动室单细胞流：流动室16单细胞照明：激光488nmlaser单细胞照明：激光488nmlaser17488nmlaser单细胞检测：信号处理488nmlaser单细胞检测：信号处理18（一）前向散射光(fowordscatter)：FSC

信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（sidescatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关二散射光的测定（一）前向散射光(fowordscatter)：FSC二19FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.FALSSensorLaserForwardAngle2090DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.90DegreeLightScatterFALSSe21前向散色光FSC前向散色光FSC22侧向散色光SSC侧向散色光SSC23

利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。散射光的测定利用前向角和散射光的测定24

荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量

线性放大器对数放大器三荧光测量荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长三荧光测量25EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLinesEthidiumPEcis-ParinaricacidTe26DNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmDNAExcitationEmisson300nm27（二）荧光补偿

利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”（二）荧光补偿利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻28流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件29荧光补偿荧光补偿30（一）分选的基本原理488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector四细胞分选原理（一）分选的基本原理488nmlaser+-Charge31阳性选择MACS-MagneticCellSorting磁珠分离阴性选择阳性选择MACS-MagneticCellSorting321、分选速度：几千个细胞/秒2、分选纯度:99.5%左右3、分选收获率:90-95%4、分选得率（二）分选的技术要求1、分选速度：几千个细胞/秒（二）分选的技术要求33

分选纯度是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。分选收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。分选纯度34流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件35数据的显示和分析

一、参数前向散射光FS:反映颗粒的大小侧向散射光SS:细胞内部结构复杂程度荧光FL:细胞被染上荧光部分数量的多少数据的显示和分析一、参数36二、数据的显示方式（一）单参数直方图显示（二）双参数显示（三）三参数显示二、数据的显示方式（一）单参数直方图显示（二）双参数显示37

以分布直方图(distributionhistogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。(一)单参数直方图的显示Single-ParameterHistogramDisplays以分布直方图(distributionhist38X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.39流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件40流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件41流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件42(二)双参数数据的显示Two-ParameterDataDisplays

细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图(DotPlot)。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。(二)双参数数据的显示细胞双参数测定不仅能提供二43

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞1、点图纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量1、点图44双参数点图双参数点图45双参数点图双参数点图46

用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。2、二维等高图用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相2、二维47

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。3、假三维等高图纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数48

三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。(三)三参数直方图三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。(三)三参49

一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。（四）流式细胞仪的多参数分析一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)（四）流501、Region设置1、Region设置512、设置Gate2、设置Gate52

样品制备：单细胞悬液特定荧光染料的选择：光谱重叠阴性对照的设置:检测标本的重复性质量控制流式细胞仪免疫分析的技术要求样品制备：单细胞悬液流式细胞仪免疫分析的技术要求53细胞碎片细胞团块离心漂洗固定剂一、免疫检测样品制备细胞碎片一、免疫检测样品制备54流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件55

淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为1.0177±0.001的分层液).（一）外周血淋巴细胞样品的制备淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。（一）外周血淋56

利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血57单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。（二)培养细胞的样品制备单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法（二)培养细58

机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。表面活性剂处理法：Triton-x100、皂素等。机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。59

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。60防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但细胞表面荧光染色分析不受影响。(四）单细胞悬液的保存防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：(四）单细胞悬61

染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料荧光染料激发波长（nm)发射波长（nm)颜色FITC488525深蓝色PE(RDI)488575橙色ECD488620橙红色PeCy-5488670红色PeCy-7488755深红色PI488620橙红色APC633670红色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生荧光染料62

用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserCY5PECY5CY5488nm能量传递染料：用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在Lase63荧光染料与细胞成分的结合方式：结构亲和方式嵌入结合方式共价结合方式荧光抗体特异性结合方式1、直接免疫荧光染色2、间接免疫荧光染色（二）免疫荧光标记荧光染料与细胞成分的结合方式：（二）免疫荧光标记643、双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE488525、575绿色、橙色FITC+Tred488525绿色568615红色FITC+PeCy5488525、675绿色、红色FITC+ECD488525、625绿色、橙红色F+P+PeCy5488525、575、675绿、橙、红色F+ECD+PeCy5488525、575、675绿、橙红色、红色F+P+APC488525、575绿色、橙色633670红色荧光染料激发波长（nm)发射波长（nm)颜色3、双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE65

FITC的激发波长处于自发荧光的光谱区内，因此FITC荧光易受自发荧光的干扰。(三)细胞的自发荧光FITC的激发(三)细胞的自发荧光66（一）单细胞悬液制备的质量控制（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制

1、温度对荧光染色的影响2、pH对荧光发射强度的影响3、荧光染料浓度的控制4、固定剂对荧光染色的影响（三）仪器操作技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制（一）单细胞悬液制备的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控67

1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为同型对照（阴性对照）2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。（四）免疫检测的质量控制1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为（四）免疫检测68一、淋巴细胞及其亚群的分析流式细胞的应用二、淋巴细胞功能分析三、白血病免疫分型四、肿瘤耐药基因分析五、在AIDS病检测中的分析六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析一、淋巴细胞及其亚群的分析流式细胞的应用二、淋巴细胞69流式细胞仪上海交通大学医学院丁磊副教授流式细胞仪上海交通大学医学院70流式细胞术(FCM)定义:

FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。FALSSensorLaser流式细胞术(FCM)定义:FALSSensorLaser71特点:

单细胞的流动的活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞特点:72一、流式细胞仪的分析及分选原理二、数据的显示与分析三、流式细胞仪分析的技术要求四、流式细胞术应用一、流式细胞仪的分析及分选原理73

一工作原理：

FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。流式细胞仪的分析及分选原理一工作原理：流式细胞仪的分析及分选原理74

1、液流系统样品流和鞘流2、光学系统激光、透镜组、光电倍增管等。3、数据处理系统(一）基本组成结构1、液流系统样品流和鞘流(一）基本组成结构75InjectorTip荧光信号激光束Sheathfluid样品流和鞘流1、液流系统Injector荧光信号激光束Sheath样品流和鞘流1、76流动室LaserFlowCell孔径50-200m

检测区离喷口200m有分选功能

流动室LaserFlowCell孔径50-200m77流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件78液流驱动系统（示意图）流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。

液流驱动系统（示意图）流速与压力的关系服从Bernoulli79PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

激光、透镜组、光电倍增管等。2、光学系统

PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBan80E0E0E0E1E1E1

吸收自发辐射受激辐射hvhvhvhvhv

当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚,发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向和恒定的位相关系,这种发射称受激发射.E0E0E0E1E1E1吸收自发辐射受激辐射hvhvhv81

球透镜和柱面透镜：20×200m椭圆形光，短轴和细胞流平行，长长轴与细胞流垂直。光束成形与细胞受照方式球透镜和柱面透镜：光束成形与细胞受照方式82激发光焦斑这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照

FCM的单细胞照明技术.光束成形与细胞受照方式激发光焦斑这种椭圆形光斑的光束成形与细胞受照方式83（二）基本工作原理（二）基本工作原理84单细胞流：流动室单细胞流：流动室85单细胞照明：激光488nmlaser单细胞照明：激光488nmlaser86488nmlaser单细胞检测：信号处理488nmlaser单细胞检测：信号处理87（一）前向散射光(fowordscatter)：FSC

信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（sidescatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关二散射光的测定（一）前向散射光(fowordscatter)：FSC二88FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.FALSSensorLaserForwardAngle8990DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.90DegreeLightScatterFALSSe90前向散色光FSC前向散色光FSC91侧向散色光SSC侧向散色光SSC92

利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。散射光的测定利用前向角和散射光的测定93

荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量

线性放大器对数放大器三荧光测量荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长三荧光测量94EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLinesEthidiumPEcis-ParinaricacidTe95DNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmDNAExcitationEmisson300nm96（二）荧光补偿

利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”（二）荧光补偿利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻97流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件98荧光补偿荧光补偿99（一）分选的基本原理488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector四细胞分选原理（一）分选的基本原理488nmlaser+-Charge100阳性选择MACS-MagneticCellSorting磁珠分离阴性选择阳性选择MACS-MagneticCellSorting1011、分选速度：几千个细胞/秒2、分选纯度:99.5%左右3、分选收获率:90-95%4、分选得率（二）分选的技术要求1、分选速度：几千个细胞/秒（二）分选的技术要求102

分选纯度是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。分选收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。分选纯度103流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件104数据的显示和分析

一、参数前向散射光FS:反映颗粒的大小侧向散射光SS:细胞内部结构复杂程度荧光FL:细胞被染上荧光部分数量的多少数据的显示和分析一、参数105二、数据的显示方式（一）单参数直方图显示（二）双参数显示（三）三参数显示二、数据的显示方式（一）单参数直方图显示（二）双参数显示106

以分布直方图(distributionhistogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。(一)单参数直方图的显示Single-ParameterHistogramDisplays以分布直方图(distributionhist107X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.108流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件109流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件110流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件111(二)双参数数据的显示Two-ParameterDataDisplays

细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图(DotPlot)。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。(二)双参数数据的显示细胞双参数测定不仅能提供二112

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞1、点图纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量1、点图113双参数点图双参数点图114双参数点图双参数点图115

用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。2、二维等高图用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相2、二维116

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。3、假三维等高图纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数117

三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。(三)三参数直方图三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。(三)三参118

一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。（四）流式细胞仪的多参数分析一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)（四）流1191、Region设置1、Region设置1202、设置Gate2、设置Gate121

样品制备：单细胞悬液特定荧光染料的选择：光谱重叠阴性对照的设置:检测标本的重复性质量控制流式细胞仪免疫分析的技术要求样品制备：单细胞悬液流式细胞仪免疫分析的技术要求122细胞碎片细胞团块离心漂洗固定剂一、免疫检测样品制备细胞碎片一、免疫检测样品制备123流式细胞仪-上海交通大学医学院医学检验系课件124

淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为1.0177±0.001的分层液).（一）外周血淋巴细胞样品的制备淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。（一）外周血淋125

利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血126单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。（二)培养细胞的样品制备单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法（二)培养细127

机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。表面活性剂处理法：Triton-x100、皂素等。机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。128

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。129防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但细胞表面荧光染色分析不受影响。(四）单细胞悬液的保存防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：(四）单细胞悬130

染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料荧光染料激发波长（nm)发射波长（nm)颜色FITC488525深蓝色PE(RDI)488575橙色ECD488620橙红色PeCy-5488670红色PeCy-7488755深红色PI488620橙红色APC633670红色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生荧光染料131

用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserCY5PECY5CY548