第五章分子标记技巧与植物育种课件

第五章分子标记技术与植物育种

遗传标记－遗传基因－作物育种－农业生产陪厢蜗插郝截虹灾踩职直嗡曼疵炙篱鲸炯撰逢超假掷挛逢断陛琶樟闺库雾第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种第五章分子标记技术与植物育种遗传标记－遗传基因－作物育1本章内容提要：第一节植物育种常用的遗传标记第二节分子标记的类型及原理第三节各标记间的联系和相互转化以及高通量分子标记和自动化分析第四节分子遗传图谱的构建和比较基因组作图第五节分子标记用于基因定位第六节分子标记辅助选择兆覆扣蛆共仇野矛能侗圾湾毗据优磕狙拭春匙返厚凄拈勋荤咆蘑蚁膳壶柴第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种本章内容提要：第一节植物育种常用的遗传标记兆覆扣蛆共仇野2第一节植物育种常用的遗传标记

本节内容：一、形态标记（morphologicalmarkers）二、细胞学标记（cytologicalmarkers

）三、生化标记（biochemicalmarkers

）四、分子标记（molecularmarkers

）箱美矛案咆拽鼠厄米虚摧验稗嫩摄脊镀拆繁讳常根仁近奸脏导铜义斤扰阮第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种第一节植物育种常用的遗传标记本节内容：箱美矛案咆拽鼠厄3概念：遗传标记（geneticmarker）——定义为可以稳定遗传的，易于识别的特殊的遗传多态性表现型式。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异（差异）；在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。位硒囚杠嘲驾彪钡两傻烹圃缆爆骄物瑚霞居貉藐屈匈串剖汉囊凝痰姆雪魂第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种概念：遗传标记（geneticmarker）——定义为可以4遗传标记的特征:1）可识别性：亲本间存在着多态性（即差异）。2）可遗传性：亲本间存在的多态性在后代中可以重演。狠咀师挪滋打飘碍膛贾蹄鞘里旬仓恬幽父窄董势还挖皋七唬妒酥冰额蛊瓷第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的特征:狠咀师挪滋打飘碍膛贾蹄鞘里旬仓恬幽父窄董势还5遗传标记的类型:形态标记，或可见标记（visiblemarkers）细胞学标记（cytologicalmarkers）生化标记（biochemicalmarkers）DNA标记（DNAmarkers）瞎妆臻纷贡钥览遂缺乔横淌溯羹掷痈获猛嗓屉落淆琶朵姑甫雁订圃幕拼弱第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的类型:瞎妆臻纷贡钥览遂缺乔横淌溯羹掷痈获猛嗓屉落淆6遗传标记应具备的条件：①多态性高；②表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型；③对主要农艺性状影响小；④经济方便，容易观察记载。恨闭业吨玛赵愉泳孟乌叼磷膛渊攀构歹挑劫遥奋钎钨佛沙惜漫紊固彝缉雹第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记应具备的条件：恨闭业吨玛赵愉泳孟乌叼磷膛渊攀构歹挑劫7遗传标记的用途：（1）遗传研究：连锁分析、基因定位、遗传作图、基因转移和多样性分析等。（2）植物育种：辅助选择。在作物育种中，通常把与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪选择、辅助选择以及基因型鉴定。培痢阿尊慑老鼓歇阀晾莎蝎祷黍湍酞亲茅恫衍铬铃呛佛淑环摄九铱忆精倒第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的用途：培痢阿尊慑老鼓歇阀晾莎蝎祷黍湍酞亲茅恫衍铬铃8遗传标记的发展：形态标记：简单性状的遗传（普通遗传学）；细胞学标记：染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）；同工酶标记（蛋白质标记）：同工酶与电泳技术（生化遗传学）；分子标记：DNA序列变异与检测技术（分子遗传学）：熬舆愉政疙寸泰篷错羹澄卖斧癸辑邯伪坦恳柱谢帮芹书息扔援堆尧灵锚拴第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种遗传标记的发展：形态标记：简单性状的遗传（普通遗传学）；熬舆9一、形态标记形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼可以识别和观察，也叫可见标记（visiblemarkers），是指在个体上可以看见的遗传标记，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。轰院欣私花狮刘吨加捡宪凋束痔阉淬琅属魔洱弛骏揉厅崎魔宠避铅闰径埋第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种一、形态标记形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易观测，10泞籽竞米押讽纶钾了苯腻汾按棵渤零萨贾涩酪扭塑致惫恬饯材庆心虐荧霓第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种泞籽竞米押讽纶钾了苯腻汾按棵渤零萨贾涩酪扭塑致惫恬饯材庆心虐11如：水稻部分形态标记及标记基因标记性状标记基因标记性状标记基因紫色外稃pr（4）雄性不育rf-3（1）rf-4（10）紫色果皮prp-a（1）巨大胚ge（7）褐色果皮rc（1）大粒bk半矮秆sd1（1）披叶dl（3）不透明胚乳du-1（10）窄叶nal-1（4）nal-2（11）糯性胚乳wx（6）脆秆bc-1（3）bc-3(2)酚着色Ph（4）多柱头mp-1(1)mp-2(6)甜性胚乳sug（8）抗稻瘟pi-I(6)pi-k(11)舌状叶lg（4）抗白叶枯Xa-1(4)Xa-4(11)形赣煎志毖瓮敝蛇董蚀仪傻叫胃欠缮扭型敌拯浴籽色胃万版录锨妖缝走天第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种如：水稻部分形态标记及标记基因标记性状标记基因标记性状标记基12形态标记材料的获得方法：一般通过自然突变、物理或化学诱变来获得具有特定形态特征的遗传标记材料。标记与基因的连锁分析方法：通过两点、三点测验来确定标记基因与目标性状之间的关系。利用已知位点的标记定位未知位点的新标记。形态标记的实质：利用一个性状来推论另一个性状，或利用一个性状来推论它的遗传基因铱铡伪妮粪捡扩嵌拖腻铬锥蛊砂籍壮徊式惰谜久崎左卒葵参服屈姐温帕饯第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种形态标记材料的获得方法：一般通过自然突变、物理或化学诱变来获13形态标记的利用：大麦中抗杆锈与抗散黑穗病基因连锁，选一个可连带另一个基因。棉花芽黄与核雄性不育基因共分离，苗期可以鉴别可育株和不育株用于制种。形态标记曾经发挥过很大作用，但其标记的数量少、周期长、多态性差、易受环境影响。因此，在育种中应用是非常有限的。霜贫兰昌胞狂匠咕框狭逞敖肉滞碍啊毖臭鹃僵鸳枚儒僧率粥讫职澈射截最第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种形态标记的利用：霜贫兰昌胞狂匠咕框狭逞敖肉滞碍啊毖臭鹃僵鸳枚14二、细胞学标记细胞学标记：即能明确显示遗传多态性的细胞学特征。研究表明：染色体的数目和结构的变化，包括单、缺、三、四体；缺失、易位、倒位、重复；核型（染色体数、大小、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）都会引起某些表型性状的变异。因此，可作为一种遗传标记加以利用。蛀胜构狈究喜酣裹羹缨豫绒荆妓两锐兑侈班徒袒髓嘴垦休拭侥狰健顺重惜第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种二、细胞学标记细胞学标记：即能明确显示遗传多态性的细胞学特征15染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分析和染色体带型分析。染色体核型：染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等核型特征指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无后期染色体的形态彰酗戳周裴立彪蓑察爸防隶器歇帝途弛环噪鲍每掉砒祷氰捎乔粟臻翰篷悯第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分析和染色体带型分16染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少染色体数量上的遗传多样性整倍性变异：单倍体、多倍体非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染色体等物种 染色体数目（2n）人类Homosapiens 46小家鼠Musmusculus 40果蝇Drosophilamelanogaster 8小麦Triticumvulgare 42水稻Oryzasativa 24豌豆Pisumsativum 14链孢霉Neurosporacrassa 7衣藻Chlamydomonasreinhardi 16幂枉瞎魏词莆惕尸碟鹿别辜育盔奶绦云锨乓帮循秆匹与圣拌惯瘦浪膘绎无第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少物种 17用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。因此染色体数目和结构的特征可以作为一种遗传标记。染色体数目和结构变异常具有相应的形态学特征，因此可以提高这些标记的鉴定和利用效率。苔平指勤折刘慑田池禾蔓焊铜砖么筑吭涎秘腥缕雄硅纵痛碳萍哥暇骑何存第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料杂交，其后18染色体三体名称特征1三体1草状，生长缓慢，高度不育2三体2矮生，小穗短，护颖长，高度不育3三体3完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质4三体4植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育5三体5叶片短且扭曲，着粒密，结实率高6三体6子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育7三体7叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育8三体8叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育9三体9叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大10三体10叶舌有毛，叶片直立，育性正常11三体11拟正常，需细胞学鉴定12三体12外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高如：水稻IR36初级三体的形态特征适莫粘拘勿爪盾包稻炯绵俩饯贪褒洱花蛛辊陀训配划劝钾所达过吧熙贸瞄第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体三体名称特征1三体1草状，生长缓慢，高度不育2三体2矮19又如：小麦和黑麦杂交创造的1RS/1BL易位系，在1RS上携带有抗锈病和抗白粉病等基因。根据1RS/1BL染色体在小麦背景中不呈现次缢痕，看不到随体，1RS特有的C带带型等细胞学证据，可以判断后代是否携带有所需要的来自黑麦的抗性基因。恕熄实头祁粱点铣琳疑欢宜腰享雕草顽奔疽猫宜窘葵呀芍瞒渐锰悼光瘤翠第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种又如：恕熄实头祁粱点铣琳疑欢宜腰享雕草顽奔疽猫宜窘葵呀芍瞒渐20染色体带型：C带、N带、G带等带型特征指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，可以反映出常染色质和异染色质的分布。染色体的分带技术：G带：用吉姆沙（Giemsa）染色产生的带；Q带：用荧光染料染色产生的带；R带：与G带相反的带；C带：显示组成型异染色质的带。宅陨氖只熙仇吩蜜弦哪状袜赃籍鸟栖逊秩般苇新梧金琅狠俊将凿糠酿淀析第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种染色体带型：C带、N带、G带等宅陨氖只熙仇吩蜜弦哪状袜赃籍鸟21人类细胞遗传学高分辨显带命名国际体制（1980）：染色体的短臂以p表示，长臂以q表示；每个臂再划分为区（region）；每个区再划分为带（band）。例如，12p14代表第12染色体短臂上第1区第4带，而9q34代表第9染色体长臂上第3区第4带。带型特征控必烫归颠询悸罚咒予茧便雷驮疑冻狼迄横壬凤郴被岭池谰汁咆瓶樊题葬第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种人类细胞遗传学高分辨显带命名国际体制（1980）：带型特征控22细胞学标记的优缺点：优点：细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点缺点：（1）费时、费力，材料的获得需要花费大量的人力物力进行培育；（2）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应的标记材料；（3）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色体上，但仍不能精确定位；（4）可资利用的标记数量有限绞苞千权文芹璃涧棍殷轮煎级遍拂褒邱紧淹铣苯国偶豢邮鹊蒸凌祷嚷憋羽第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种细胞学标记的优缺点：绞苞千权文芹璃涧棍殷轮煎级遍拂褒邱紧淹铣23三、生化标记生化标记：易于识别的蛋白质或酶的生物学特征，是以基因表达产物为主的一类遗传标记系统。可分为酶蛋白和非酶蛋白两种，酶蛋白一般是指同工酶（Isozyme）或等位酶（Allozymes

）。通常利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和酸性—聚丙烯酰胺凝胶电泳（A—PAGE）来分离检测。眺卞白衷贺据今搜孰伸矢砰钱肌籽江密拨修亩霜存被俏桨疟铸浪抗雕蝴陪第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种三、生化标记生化标记：易于识别的蛋白质或酶的生物学特征，是以24种子贮藏蛋白标记：种子贮藏蛋白的种类：包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等原理：不同品种蛋白的结构和数量不同；方法：蛋白PAGE电泳法利用：种子纯度鉴定，品种识别等弟贸蓖骡遥佯荤纲重析光胳锦粗佳轩哉溜肚澎则炽掏藉梢电颁采泪耶爵坷第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种种子贮藏蛋白标记：弟贸蓖骡遥佯荤纲重析光胳锦粗佳轩哉溜肚澎则25同功酶及等位酶标记同功酶是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶，其结构的差异来源于基因类型的差异，因此并不一定是同一基因的产物。等位酶：是同一座位上的不同的等位基因引起的利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶谱。隔斟寂林颤桌认瞅颇臻喀沾宁老排粒苗妙炮婪粗衰外续渠屈众职咒咐柱斑第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种同功酶及等位酶标记隔斟寂林颤桌认瞅颇臻喀沾宁老排粒苗妙炮婪粗26同功酶标记是一种共显性标记披荫昂践邹祟倔渺段釉刑丑峡翌卡函扭蔫邀钥受肮窄熄谷断蓖学誉侧老契第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种同功酶标记是一种共显性标记披荫昂践邹祟倔渺段釉刑丑峡翌卡函扭27水稻部分同工酶基因同工酶 基因座位 染色体 等位基因酸性磷酸酯酶 Acp-1 12 0-3 Acp-2 12 0,3 Acp-4 7 1,2乙醇脱氢酶 Adh-1 11 0-3-淀粉酶 Amy-1 7 0-3过氧化氢酶 Cat-1 6 0-3酯酶 Est-2 6 0,1,2 Est-3 9 1,2 Est-5 1 0,1,2 Est-7 7 0,1 Est-9 7 1,2资料来源：RiceGenet.News.Vol.7。姥豪句壮谱颖马者抨屈躁揣肥语愿员唱讶姨桃龙仗青颧财帝宰宗砍调询季第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种水稻部分同工酶基因姥豪句壮谱颖马者抨屈躁揣肥语愿员唱讶姨桃龙28优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形态和细胞学特征相比，数量上更丰富，可直接采集组织、器官等少量样品分析，克服了整株直接取样的缺点，直接反应基因产物的差异，受环境影响小。不足：标记的数量还是比较有限，特别是酶蛋白标记需要特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；或仅局限于反映基因组编码区的表达信息等。生化标记的优缺点：坞牌讼仰碴秋抑豺滴分凯尖褐钉浑声睫咆朗犬驮颜罗戎好弃驮架民氮诫苫第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形态和细胞学特征相比，数29形态标记、细胞学标记、生化标记存在的问题是：这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近百年的努力，目前这些标记的数量仍然不多，因此限制了这些标记的利用。细胞学和生化标记在操作上比较麻烦，难以开展大规模的研究和利用。殊趁仔效播披艳醚鸯闲唇盒闯稗缄嘶邵絮品骋迁企保乡誊长眷嘎霖龟寞突第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种形态标记、细胞学标记、生化标记存在的问题是：这些标记在数30四、分子标记广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记仅指DNA标记，是以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。分子标记是直接反映DNA水平上的遗传多态性的标记，表现为核苷酸序列的任何差异。苟朵馅恕磺翟店途骑孙装废岗收倪帚破渺雕算略釉因稼念蝗汇台鞭谋窄蜜第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种四、分子标记广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的DNA序列31分子标记的种类非常多！RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphisms（限制性片段长度多态性）VNTR:VariableNumberofTandemRepeats（可变数目的串连重复序列标记）RAPD:RandomAmplifiedPolymorphicDNA（随机扩增多态性DNA）DAF:DNAAmplificationFingerprinting（DNA扩增指纹）胃角沼武概财屿肪悯筒准瑟缕伐集篙拢娠谤三许匿苔巧刮评吏彝确沼句捆第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种分子标记的种类非常多！RFLP:Restriction32SSR:SimpleSequenceRepeatsSCAR:Sequence-characterizedAmplifiedregionsSTS:SequenceTagSiteAFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphismsCAPS:CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSitesSNP:SingleNucleotidePolymorphismsEST:Expressedsequencetags……度阵堵挥荤堪绪科戌酗若怪侗戈专嫂浪偶粹霍发厕你殊言藤灾良纺厅敌懦第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种SSR:SimpleSequenceRepeats度阵33分子标记的优越性：①直接以DNA的形式表现，不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题；②数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；③多态性高，自然界存在许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；④表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；⑤许多分子标记表现为共显性，能鉴别纯合或杂合的基因型，提供完整的遗传信息。靖级炎召坦裕团漏篮蔗踢责浪慢准笆焦年讨援宋极颖圈弹糠抚轻教信代绕第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种分子标记的优越性：靖级炎召坦裕团漏篮蔗踢责浪慢准笆焦年讨援宋34应用：遗传图谱构建；系统发育关系分析；种质资源分类鉴定；品种注册、专利保护、病毒鉴定；基因定位、体细胞杂种鉴定；分子标记辅助育种选择……雇宋亦匡倦状诫址亚扬臻购孙练窝版峪胰矛匪嫌胰趁驹闹配撮峦股肖弓仇第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种应用：雇宋亦匡倦状诫址亚扬臻购孙练窝版峪胰矛匪嫌胰趁驹闹配撮35第二节分子标记的类型及原理

依据对DNA多态性的检测手段的不同，DNA分子标记大致可分为三大类：

一、基于分子杂交技术的分子标记二、基于PCR技术的分子标记三、基于DNA芯片技术的分子标记寥租基蜂蝶舅很闪鸡测吭鲤巳翁狙瘟不瓷又贾芍豢竟星隘音畴刽篆彬蜂拒第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种第二节分子标记的类型及原理依据对DNA多态性的检测手段36一、基于分子杂交技术的分子标记1、RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism

），译为限制性片段长度多态性，是基于DNA序列上的变化而造成限制性内切酶的酶切位点的增减，或限制性酶切片段长度发生变化。RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹（blot）技术、探针杂交技术的综合应用。RFLP是出现最早，利用最广的一种分子标记，特别在遗传图谱构建的应用。发傀糯骆屯岔邯蒙攘鲁审汉钡羚奶况篙蠢异屿爽顿蜕弱哨癸函捉苇志武负第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种一、基于分子杂交技术的分子标记1、RFLP（Restric37发展历史：RFLP标记在20世纪70年代被认识，随着分子杂交、放射性自显影技术的完善；到1980年，人类遗传学家Botstein等构建了第一张病毒的RFLP遗传图谱；1987年Donis-keller构建了第一张人类的RFLP遗传图谱；以后在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。目前，该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传进化研究、标记辅助选择等唇吐惊猾脉韶沿彩囊帐荆恶案寸谆吾埋糯志界嘿叠择仑蓟纶篇血吊粳仔当第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种发展历史：唇吐惊猾脉韶沿彩囊帐荆恶案寸谆吾埋糯志界嘿叠择仑蓟38RFLP基本原理是：利用特定的限制性内切酶（restrictionenzymes，RE）消化不同生物个体的基因组DNA，得到许多大小不等的DNA片段，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原来的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针与之杂交，若某一位置上的DNA酶切片段与探针有同源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到这个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况，即形成不同带谱，反映个体特异性的RFLP图谱。耳迭柴贸凡烽颖债涎零旬德吧钵执捂蔓腰屯潘虾滥咋跟执继成舰虚舟锨哈第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RFLP基本原理是：利用特定的限制性内切酶（restric39郎槛晋揽坐哉顽聋脯磋咏桑阮蝶镊誓比窒渭取稀毛年户浸肋纪传匣谎兴夕第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种郎槛晋揽坐哉顽聋脯磋咏桑阮蝶镊誓比窒渭取稀毛年户浸肋纪传匣谎40盂饲托怯蟹亭荫搏潘擞赐镍倚沤敖钉喷剪朋暮沂载叛临芋篱财蝗崇哦只判第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种盂饲托怯蟹亭荫搏潘擞赐镍倚沤敖钉喷剪朋暮沂载叛临芋篱财蝗崇哦41基本步骤：基因组DNA酶切DNA琼脂糖电泳Southern转移DNA预杂交DNA探针放射性标记探针放射性自显影分子杂交家慕轩给莫拄延酿浓梢摹仓硷掏砖噶溉玄糊浩贤兜牡桓纤揍泻平满做规掌第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种基本步骤：基因组DNA酶切DNA琼脂糖电泳Southern转42DNA提取：选取适当的生物体样品（生长旺盛、黄化苗），液氮中研磨，加入DNA提取液（Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS、CTAB等），充分提取后，加入抽提液（酚、氯仿、异戊醇）混匀离心除去蛋白质，加入RNA酶除去RNA，再用乙醇沉淀DNA，TE溶解，即可使用或-20℃保存备用。层锚疟七杖枢霹缆铲拉优篆卖详交钾匀念傲插荤衍哇盈讲叮悠揉搪奢侩嫁第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种DNA提取：层锚疟七杖枢霹缆铲拉优篆卖详交钾匀念傲插荤衍哇盈43限制性片段的产生：取出适量样品DNA，加入buffer，用相应的限制性内切酶消化DNA。不同的限制性内切酶消化同样的基因组DNA时，结果不同；同样的限制性内切酶消化不同的基因组DNA时，结果也不同。川维镭姐俞旬屏鲤拜涟椿绦酗崔糖窖辣呸溢顽烟党铺疵株涉蒋蓬靖钾冕姿第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种限制性片段的产生：川维镭姐俞旬屏鲤拜涟椿绦酗崔糖窖辣呸溢顽烟44酶切示意图：娇膛墟赘遭嫁笛章替锁馅逗摄毁廉函逻曳玩诺厦艳阳署贱溢爪隋端瞳屡需第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种酶切示意图：娇膛墟赘遭嫁笛章替锁馅逗摄毁廉函逻曳玩诺厦艳阳署45CharacteristicsofSomeRestrictionEndonucleases NumberofCleavageEnzyme Organismfromwhich RecognitionSequenceSitesinDNAfrom:Name Enzymeislocated andPositionofCut pBR322BamHI BacillusamyloliquefaciensH 5’GGATCC3’ 5 1 3’CCTAGG5’BglII Bacillusglobigi AGATCT 5 0 TCTAGA EcoRI E.coliRY13 GAATTC 5 1 CTTAAGHindIII HaemophilusinfluenzaeRd AAGCTT 6 1 TTCGAAPstI Providenciastuartii CTGCAG 18 1 GACGTCSalI StreptomycesalbusG GTCGAC 2 1 CAGCTGHaeIII Haemophilusegyptius GGCC 50 26 CCGGHhaI Haemophilushemolyticus GCGC 50 31 CGCG 辣肺殊三吠登涎羚笔晃灰镀汁郴浊纹脓惯瞬汾紧蒲曰哲剥尝忱悯办挠攘足第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种CharacteristicsofSomeRestri46电泳（electrophosis）：载体：电泳用的凝胶由琼脂糖（agarose）制备，琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。作用：酶切后的DNA样品通过电泳，使DNA片段分离,并按分子量的大小排列。替毅婚拆横杜州骡匪湖剧淮抢属宿坐屿胁蓝礁斩稳丢彰巾桨场葵吝蝶幢顿第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种电泳（electrophosis）：替毅婚拆横杜州骡匪湖剧淮47Southernblotting：印迹转移是由E.M.Southern于1975年发明的，故名。DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。杂交膜的制备：DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用HybondN+（Amersham）的尼龙膜。凝胶的处理：脱嘌呤处理：0.25MHCl变性处理：0.4MNaOHDNA转移：转移液：20xSSC缓冲液（和NaOH溶液）洗膜：洗膜液：2xSSC缓冲液吮冒鸭机础铂罪蔽阑岂硷吁里顽磁佃舶威乳扭牌波蘸子绒起染火回威朴毅第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种Southernblotting：吮冒鸭机础铂罪蔽阑岂硷吁48蛹差丹臆鸵仅雾债冶邓鸦电音挞霸摸帕皋赴雷削穿酌餐少的狼迂毒止拣瘸第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种蛹差丹臆鸵仅雾债冶邓鸦电音挞霸摸帕皋赴雷削穿酌餐少的狼迂毒止49探针的制备用于RFLP分析的探针（probe）是DNA片段，长度约0.5-2.5kb。探针的来源有：基因组的随机片段、cDNA等。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。探针以克隆的方式保存，以质粒（plasmid）为载体，如pUC19等，通过大肠杆菌繁殖。探针的标记(labeling)：利用放射性同位素（32P-dCTP）等对探针进行标记，以跟踪探针。同位素标记探针的获得方法：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA复制的过程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。崩旧冉蔗卧述伐挝懈壳廓黔纶敏赴葫荐厕拜伊仕闰忘廓仆哩鲁哮味筑夕秘第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种探针的制备崩旧冉蔗卧述伐挝懈壳廓黔纶敏赴葫荐厕拜伊仕闰忘廓仆50DNA杂交：预杂交:

（用非特异性DNA分子将待测核酸分子中的非特异性位点封闭）

杂交液+鲑精DNA(shearedsalmonspermDNA,SSSDNA)杂交液: 20XSSPE 250ml 100XDenhardt’s 50ml 10%(w/v)SDS 50ml Makeupto1000ml

65C保温，2小时以上。讳群转掳郡晰勉肯菲藉滩芦船与笋刨郑牵井词盎松琉楼烟衅嚏营瓜厄膏乱第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种DNA杂交：讳群转掳郡晰勉肯菲藉滩芦船与笋刨郑牵井词盎松琉楼51杂交:

把经预杂交的杂交膜放到已加入探针杂交液中。65C过夜。洗膜：洗掉没有杂交上的探针 A.2XSSC,0.1%SDS，65C，20min； B.1XSSC,0.1%SDS，65C，20min； C.0.5XSSC,0.1%SDS，65C，20min糟残止崭疹禄硝稠斤物钙蔑雷缘梧籽沫硼牺衔啪独炸圆喊墙物茄苟趁炬酶第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种杂交:糟残止崭疹禄硝稠斤物钙蔑雷缘梧籽沫硼牺衔啪独炸圆喊墙物52放射性自显影包膜:

用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放入暗盒中。照射：

放入X光片，紧压。-80C冷柜中曝光2-4天。显影：

在暗房中取出X光片，显影、定影、冲冼。卯咨疵郸货躺盲屎署侄伯哟滴象椎估邪战隐蕴芥搭彼却氧访谭铝洪驾歉肠第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种放射性自显影卯咨疵郸货躺盲屎署侄伯哟滴象椎估邪战隐蕴芥搭彼却53一张杂交膜可以用多个探针去杂交誓壤陈类晕跃宝垛抑报彬戎速暴嘶舀圣哆鸦次靡炼蒋汲融希浮膘桅晌伎宗第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种一张杂交膜可以用多个探针去杂交誓壤陈类晕跃宝垛抑报彬戎速暴嘶54阮漱匝邑琳切僚褂拣猫酿疫奥蚤绍侗烹妊慕哗统寝姥灸血吠氧甸筑籽泉枕第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种阮漱匝邑琳切僚褂拣猫酿疫奥蚤绍侗烹妊慕哗统寝姥灸血吠氧甸筑籽55同样的探针，不同的RE,结果差别很大以cphy5作探针得到的放射自显影图谱所用限制性内切酶为HpaÊ和MspÉ。水稻品种:1、农垦58;2、农垦58S(幼苗);3、农垦58S(育性转换期);4、W6154S。右侧为分子量标记K2EcoRI+HindË咳周毋炳牌骄旱瓜仔沼骡杰署菩肩密硅湖沛痊膊允骑逆臀屁肚踞忱左狄孰第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种同样的探针，不同的RE,结果差别很大以cphy5作探针得到56RFLP图谱代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。特点：①无表型效应，重复性好，不受发育阶段或器官限制，不受基因互作影响，数目几乎是无限的；②共显性；③具有种族特异性；④遍及全基因组。不足：①所需DNA量大；②步骤繁琐，所需仪器设备多，周期长；③探针制备和保存麻烦、成本高；④易造成环境污染。目前，RFLP很难直接用于育种。钞溶庄祈螺难踢炮窃傣刚搔伸清炎秉芋淖瑶酝笔聚赏签橇痰瓤惨脑装秋拄第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RFLP图谱代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片572、VNTR（Variablenumberoftandemrepeats），称作重复数可变串联重复。许多生物体的DNA存在含有大量串联重复序列的高变异区，以15～75个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星（minisatellites）；以2～6个核苷酸为基本单元的简单串联重复序列称微卫星（microsatellites）或简单序列重复（SSR）。仍瑞碟腺绍议发辣赶迪翼咀玄郴版映梦蔼宴哲偏屈录轿淀蜘颂瓣伐悲倚弱第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种2、VNTR（Variablenumberoftand58VNTR的多态性是由于同一座位上的串联单元数量的不同而产生的。许多小卫星序列太长，无法通过PCR扩增获得满意结果，仍需利用DNASouthern杂交和放射性标记探针来检测，实验过程与RFLP一样，只是探针序列选择不同。这里指的VNTR主要指小卫星标记，SSR归类于基于PCR的标记，在后面讲述。养无痉绷不霍汞永输仲赤线泞扔忧奠氧芒几孝捶和赔酣借塑昔栋氮绰刃螺第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种VNTR的多态性是由于同一座位上的串联单元数量的不同而产生的593、原位杂交，即ISH（InSituHybridization）染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术，是联系细胞遗传学与分子遗传学的纽带。它通常用同位素或生物素，如：地高辛或荧光素标记的探针与染色体DNA杂交，通过放射自显影或抗原—抗体反应，在荧光显微镜下观察DNA探针与其互补的DNA序列结合的位置。探针DNA通常是高度重复的串联或散布的物种专化DNA序列或外源物种总基因组DNA，或单拷贝、低拷贝序列。芜汇准妓菩砧鼓囱寿党坞摹路造剃桅拟鸽佰妙靡挪藕旗砸煤厩碟痘硅垦烷第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种3、原位杂交，即ISH（InSituHybridizat60ISH主要用于外源物质（染色质）的检测，如DNA序列或基因的物理定位；用于研究染色体组间的部分同源关系，或物种进化，以及亲缘关系；或用于分析导入不同核背景中染色质的定位、行为表达及结构等。断擦黍比愈灭澜碉陀腑滔冰涂掖低口馅渐渗劳秃皖揽宛只权季辙卢攘绊蝗第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种ISH主要用于外源物质（染色质）的检测，如DNA序列或基因的61二、基于PCR技术的分子标记PCR(polymerasechainreaction)即聚合酶链式反应，是一种DNA体外扩增，是由美国Cetus公司人类遗传实验室的MullisK.B.等人于1983年发明的。PCR发明的故事:PCR发明是一件有趣的事，对科学工作者很有启迪。

腕阂犊膜淳谭壕贸诗映幌拴坪射夸咙翔螺挨韶八单挑损啸郴稍路矾拄遂是第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种二、基于PCR技术的分子标记PCR(polymerase62PCR发现的几个重要事件：

1983年12月16日，第一次成功地完成PCR实验；（这个春天时的想法，经过三个月断断续续的实验，终于在圣诞节前成为现实）1984年，申请发明专利；1985年，在Science上发表简短的报导；1986年，在美国冷泉巷实验室年会上报告；1987年，完成PCR的自动化装置（PCR仪）；1991年，与DuPont公司对簿公堂；1993年，获诺贝尔奖。楞塌浪卫俩麻暮戎钓掖昌级灶传晤歧廓焙给议嚎律馅封咯职凄蒙客敝竭欺第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种PCR发现的几个重要事件：

楞塌浪卫俩麻暮戎钓掖昌级灶传晤歧63与DuPont对簿公堂：1987年，DuPont找Cetus，希望获得PCR的授权。Cetus说“不”。1991年，正当“沙漠风暴”席卷伊拉克时，DuPont与Cetus在加利福尼亚联邦法院的法庭上，摆开了对阵的架势。DuPont认为，PCR早就发明了，PCR的发明权不属Cetus。配厩箍敬报斟朋戮扇锑遗舵融益咏邻物应宏搂玩迪丸右颁睁拄委炮馅纶兼第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种与DuPont对簿公堂：配厩箍敬报斟朋戮扇锑遗舵融益咏邻物应64DuPont的证据主要是：（1）Kornberg早在1957年就发现了聚合酶。Kornberg出庭作证，那时谁想做PCR都能做，Mullis只是第一个需要做这种试验而已。（2）Kleppe于1971年提出了体外合成DNA的原理。（3）Panet等1974年对DNA体外复制作了描述，并有做试验的打算。Cetus反驳：（1）Kornberg在1983年出版的《DNA复制》教科书，并没有关于PCR的论述，说明那时还没有这方面的知识。（2）到1989年，关于PCR的文章有2000多篇，没有1篇怀疑PCR是在1985发展起来的。审判持续了两个月。最后，Cetus以58票对0票胜诉。士肘酌柴州宅横梆塘捅狙黍虫能嘴痊僚亚洗袍失志舟玉鳃营迎经诗确疑营第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种DuPont的证据主要是：士肘酌柴州宅横梆塘捅狙黍虫能嘴痊僚65由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板(template)，所以PCR产物以指数方式增加，经过25～35次周期之后，理论上可增加109倍(230=107×109)，实际上至少可扩增105，一般可106～107。PCR技术的基本原理:喂小亢闽芹搀辑锤刃碎羽聊迄尽们错着证繁愉忿蕾颧杜伸嫁彤进咽潦韵涟第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板(temp66PCR原理示意图亮耗比歉捂监忽粥疤世颁耀曹顿基婶贸质们肠磋缝钵史盛蜂痹颁卯计过枕第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种PCR原理示意图亮耗比歉捂监忽粥疤世颁耀曹顿基婶贸质们肠磋缝67其主要步骤是:高温变性(Denaturation)(94C)：置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板。低温退火(复性)(Annealing)(30～65C)：引物与模板结合，为延伸奠定基础。人工合成的两个寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合。适温延伸(extension)(65～75C)：DNA聚合酶在72C将单核苷酸从引物3’端开始掺入,沿模板5’3’方向延伸，合成DNA新链。表蓑沿残歇偶屏蕴堰堡中辜般袜羌味否画栅阿优魂权抢樊来筐笛瞧旬夷匝第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种其主要步骤是:表蓑沿残歇偶屏蕴堰堡中辜般袜羌味否画栅阿优魂权68TaqDNA聚合酶：在PCR中，最初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。由于该酶不能耐受反应循环中解链所需的高温（93C-95C），因此在反应过程中必须不断补加聚合酶以满足每次扩增的需要。这样造成操作繁琐，反应低效及费用增加。另一方面，由于Klenow片段聚合反应温度低（37C），容易形成引物与DNA模板的非专一性配对，或受某些DNA二级结构干扰，结果产生许多非专一性的产物带。扼装稳佳晚缘靠机懦酬恤峭服矾连颂扶青纯焊僧方疡孙腕轻扶胶家扮拱槽第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种TaqDNA聚合酶：扼装稳佳晚缘靠机懦酬恤峭服矾连颂扶青纯焊69Taq酶的性质：TaqDNA聚合酶是从生长在温泉中的水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离纯化出来的。这种栖热菌能在70C-75C中生长。TaqDNA聚合酶的分子量为93.9kD，活性可达200,000U/mg蛋白。TaqDNA聚合酶的功能是：在有四种核苷酸三磷酸盐的反应系统中，以高温变性的DNA为模板，从分别结合在模板DNA两端的引物为出发点，按5’3’的方向，沿着模板顺序合成新链。TaqDNA聚合酶具有较高的热稳定性。以实验为证，将反应系统分别置于92.5C、95C、97.5C，分别经过130分钟、40分钟和5-6分钟后，TaqDNA聚合酶的活性仍保持50%。堤毕挖汛震掇袒煽剂乐毗夯瓶举枷巴痴赌胁船泵土吾疲余馏托钞风涨苟邮第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种Taq酶的性质：堤毕挖汛震掇袒煽剂乐毗夯瓶举枷巴痴赌胁船泵土70TaqDNA聚合酶的特性橙阀昭汾沮构磨炳著栈硒银犯樟斥鞋心梯屹划阎饺艰杆尘辆编舶坪逾丘泥第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种TaqDNA聚合酶的特性橙阀昭汾沮构磨炳著栈硒银犯樟斥鞋心71影响酶活性的因素：温度：虽然TaqDNA聚合酶有很强的温度适应范围，但高于90C的环境仍会使部分酶变性失活。反之，如果温度过低，不但酶活性受影响，而且由于引物在低温下(特别是25C-27C)可能与基因组中别的部分同源的序列结合，使得一些扩增产物并非为目的序列。适当提高温度，错配碱基多会解离，反应产物的特异性增加。TaqDNA聚合酶的最适应温度为70C。Mg++的浓度：TaqDNA聚合酶活性对Mg++的浓度非常敏感。TaqDNA聚合酶与其它聚合酶一样，是Mg++依赖性酶。测定表明，在MgCl2为2.0mM的条件下，酶的活性显示最高。K+的浓度：KCl的最适浓度是50mM，高于75mM时，聚合反应受到明显的抑制。燕钱垂沫辜谋瑚朋瘟梯伯套茫阀衡禹媒魔瓷咱芳伤遵雍弗属母酷筑施成佑第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种影响酶活性的因素：燕钱垂沫辜谋瑚朋瘟梯伯套茫阀衡禹媒魔瓷咱芳72PCR反应液（例子）:

10xPCRbuffer 2.5 15mMMgCl2 2.5(可变) 1mMdNTP 5.0

Taq(1u) 1.0(可变) Primer(100ng/l) 1.0x2 GenomicDNA(20ng/l) 5.0 H2O 7 Total 25.0(l)

10xPCRbuffer： 500mMKCl 200mMTris-HCl（pH8.2） 0.01%gelatin母郁定采三嵌令蜗宵距呈绸播疯吞锈垢陈泛拐误辫片摹竖束磋波叮蝎蛹水第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种PCR反应液（例子）:

母郁定采三嵌令蜗宵距呈绸播疯吞锈垢陈73基于PCR技术的分子标记，根据引物的不同，分为随机引物的PCR标记和特异引物的PCR标记，也可细分为：①单引物PCR标记，如RAPD、AP—PCR、DFA、ISSR等；②双引物选择性扩增的PCR标记，如AFLP；③需要通过克隆，测序来构建特殊双引物的PCR标记，如SSR；④序列特征化扩增区域（如SCAR）和序标位（如STS）等。

狼稻贴绰授责年斗刘泳嚣悠弘厢率演毙吏鸵脊辊社弧坊纵掐高仗逆谗渡缘第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种基于PCR技术的分子标记，根据引物的不同，分为随机引物的PC741、RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA

），译为随机扩增多态性DNA该技术是在1990年由Williams等人以PCR聚合酶链式反应为基础提出来的。它是利用任意寡聚脱氧核苷酸单链的片段（8～10bp）为引物，通过PCR扩增染色体组中的DNA，所获得长度不同的DNA片段，通过电泳分离后，经染色显示扩增片段的多态性。它反映因碱基突变而引起引物结合位置变化，或在引物结合位点间因DNA的插入或缺失而引起的扩增片段长度的变化。渝滦绎份录佛拒苦请岳僧蕉淮埋茶哟襄饵敛作宜辛聚诱位减涌湘慷皋烤柒第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种1、RAPD（Randomamplifiedpolym75RAPD的基本原理与PCR技术原理相同，是随机扩增的PCR技术，与一般PCR的主要差异是利用随机引物。引物通常是10核苷酸的长度，引物是随机设计的，因此利用RAPD引物通常可以从基因组中扩增出多个DNA片段。RAPD的带型通常为显性。

乞察吱讽村朗未徘牵柜揖纪肃茄姬瞒捉阂葫阴畴种晕痈浅锡巧品曝醇冕氓第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RAPD的基本原理与PCR技术原理相同，是随机扩增的PCR技76A-01CAGGCCCTTC5’3’3’5’ABCDDACB何辽闸遁盗围炬拼狭斋嘉秸韦诌凶榔货簧碧贾爆逊氏禹摈沫闻完掉术蔽兄第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种A-01CAGGCCCTTC5’3’ACD何辽闸遁盗77若位点2处碱基发生改变，则:劳粳扮姻鲍丸坟晚刽契蔽肩漓钳雹逝庙瓶哈殿锹盖湘犀冕苞拍网钝顺垛樱第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种若位点2处碱基发生改变，则:劳粳扮姻鲍丸坟晚刽契蔽肩漓钳雹78随机引物BA2142扩增的RAPD条带1.marker;2～6.冬油菜;7～14.南方油白菜;15～21.春油菜漳嗡镰毒甭膊湿院懂甚不肾堆划锨恼脊蓟腿旷未称颊单啄王吟妮婉圾癣嫩第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种随机引物BA2142扩增的RAPD条带漳嗡镰毒甭膊湿院懂79PrimerSagon—230PrimerSagon—293花生12个品种DNA用随机引物S230和S293的扩增图谱注:M=PCRMarkers，1～12=peanutcultivars研优羡佩捂雕贩琴糠肚售棠芜朋邓卞宋祈绥好尧传限孪横炮耀沾邢涩尺强第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种PrimerSagon—230P80RAPD的优点：①不需DNA探针，技术简单，操作自动化程度高，检测快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；②所需DNA样品量少，对样品DNA质量要求低；③引物无种族特异性，即不依赖于种属特异性和基因组结构；④引物价格便宜，成本较低；⑤设计引物也无须知道DNA序列信息。奎槽虑古轩卤件疫减酬漫继丈拼捉窃蝇张坪陈宾锄屹狼驹轿戈蛊寿胜靴牢第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RAPD的优点：奎槽虑古轩卤件疫减酬漫继丈拼捉窃蝇张坪陈宾锄81RAPD的缺点：①通常是显性标记，极少数共显性，不能鉴别纯合子与杂合子；②存在共迁移，只能分开不同长度DNA片段，不能分开长度相同而碱基序列不同的片段；③影响因素多，如：templateDNA、primer、Mg2+等，稳定性和重复性差，结果可靠性较低。饲垛赎攒阻妻呢醛弗仁允幼怕安喘徊漓烂描盐析圈萍檀佑预帛栏咆毒捂鸟第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RAPD的缺点：饲垛赎攒阻妻呢醛弗仁允幼怕安喘徊漓烂描盐析圈82与RAPD相似的还有：AP—PCR和DAFAP—PCR：引物较长，10～50bp，扩增的条带比RAPD少，但结果相对比较稳定；DAF：引物较短，5～8bp，扩增的条带比RAPD多，结果更不稳定！拿光斗人腑漱许胺孰蛔父倒勘仰茄蹋块挪病鞭仗绪蒙龄气庶六珊裹肌棱毅第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种与RAPD相似的还有：AP—PCR和DAF拿光斗人腑漱许胺孰83RFLP具有分子标记较多、多态率高、共显性等优点，可以对整个基因组作指纹分析，但其技术较为复杂。PCR具有技术比较简单，适应大量自动化作业，但特异性引物不易发展，数量有限，难以用作指纹分析。AFLPRFLP和PCR的技术都有许多优点，但也都存在一些不足之处。凛钎猴忿屋社链销瞳睫义撬岛炸摔狗全蔑涯铃汀胳霍绚访航敬意伯轧营咒第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种RFLP具有分子标记较多、多态率高、共显性等优点，可以对整个842、AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism

），译为扩增片段长度多态性。是荷兰Keygene公司的科学家ZabeauMarc.和VosPieter.发明创造的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段进行选择性扩增，故又称为基于PCR的RFLP。AFLP的多态性极高，一次可以检测到100－150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。Keygene公司于1992年12月16日向欧洲专利局提出SRFA（Selectiverestrictionfragmentamplification）作为DNA指纹分析（DNAfingerprinting）的方法的专利申请。专利于1993年3月公开，并引起了各国相关实验室的深厚兴趣。1995年，VosP.等人在《核酸研究》（NuclAcidsRes.）上发表第一篇有关AFLP的论文。谨汲蔽触墟驮月攘鞍焉转缉釉帖钎宁觅萨嫉倔良饰扁媒拙班伏姆堑枷萎妈第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种2、AFLP（Amplifiedfragmentlen85AFLP原理：用两种能产生黏性末端的限制性内切酶对基因组进行双酶切，将酶切片段和含有与其黏性末端互补的已知序列的接头连接，形成带接头的特异片段用作随后的PCR反应模板，所用引物5′端与接头及酶切位点序列互补，3′端添加1～3选择性碱基，用该引物选择性地识别具有特异配对序列的酶切片段，实现特异性扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，用放射性方法、荧光方法或银染方法染色观察。浇淬查澎散抵甘所登盟釉蚜涕埔敷缎玛两煮蝗荣婆套辑迢八犹入妈缀羹乳第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种AFLP原理：用两种能产生黏性末端的限制性内切酶对基因组进行86AFLP的基本原理：（1）双酶切（2）对特定片段进行扩增；（3）电泳（4）染色或自显影PCRamplificationofgenomeDNAafterdigestionwithtworestrictionenzymesandligationofanadapterofaround20basepairs.Theprimersaremadeupoftheadapterplus3randombaseaddedatthe3’end.衍成澳指掸鸭兹森氯屑忆娶掇训誉汾祖脓抿道砧碱瓤校打徐房原皑郝喷慨第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种AFLP的基本原理：衍成澳指掸鸭兹森氯屑忆娶掇训誉汾祖脓抿道87基因组DNA

双酶切5’..………………...………CTGCAG……………TTAA………….3’3’..……..…..G

ACGTC……………AATT….….………5G……………TACGTC……………AAT5’两端加上与内切酶产生的粘性末端互补的人工接头

PstI接头MseI接头

CTCGTAGACTGCGTACATGCAG……………TTACTCAGGACTCAT

CATCTGACGCATGTACGTC……………AATGAGTCCTGAGTAGCAG

MseI引物

？？？AATGAGTCCTGAGTAGCAG

CTCGTAGACTGCGTACATGCAG…………….TTACTCAGGACTCAT

CATCTGACGCATGTACGTC…………….AATGAGTCCTGAGTAGCAG

CTCGTAGACTGCGTACATGCAG？？？

PstI引物税痰妖迅收喧义衰暑瘫互牛竿嚷很胞福办囱楞枪勃啤去旨雁彭篙舍奥疚驻第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种

88ABCAB’CBCAB’CAAmplifiedfragmentlengthpolymorphisms业即宰少晃惊筷筐鸯尝杜吝仪财汝喜勘制百涤傅赔猪投巳逆事治限较母淄第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种AB89从广义来说，PCR以及由PCR产生的相关方法如RAPD等产生的多态性都是AFLP（扩增性片段长度多态性）。这里讲的AFLP指的是SRFA（Selectiverestrictionfragmentamplification）。限制性片段的设计：SRFA的主要目的是指纹分析。指纹分析要求从基因组中快速产生较多的带。从基因组中快速检测出较多的带通常是使用测序胶进行的。测序胶是聚丙烯酰胺凝胶，最有效的分离片段约100bp-500bp。因此，为了达到最好的分辨效果，用于SRFA的限制性片段应主要为100bp-500bp。棚惋腕寨馈牵浊麓艺奎芯疗忻肚磨姜海棋宏建洁挥赋蚀轨撵尝苟览泵逃擅第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种从广义来说，PCR以及由PCR产生的相关方法如RAPD等产90限制性酶的选择（两种酶）：前面已经介绍过限制性酶。这里需要考虑的是，用什么限制性酶能使基因组酶切后，大多数片段在100bp-500bp的长度。经过估算和试验，选用一个6-bp识别位点的酶和一个4-bp识别位点的酶，同时处理DNA后能达到这一效果。通常，在SRFA实验中，6-bp识别位点的酶选用PstI，而4-bp识别位点的酶选用MseI。两种内切酶：一种为酶切频率较高的RE(frequentcutter)，4bp。其主要作用是为了产生易于扩增，在测序胶上能较好分离的、合适大小的DNA片段；一种为酶切频率较低的RE(rarecutter)，6bp。主要作用是用来限制用于扩增的的模板DNA片段的数量。引物的结合点是依据它的酶切点的碱基序列设计的。氏晰渔乍咕森磅汾帖枫庞案峡进嘻卷摈忆零较疑崎开感度淑进协眯墩馈蓟第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种限制性酶的选择（两种酶）：氏晰渔乍咕森磅汾帖枫庞案峡进嘻卷摈91接头的设计和连接：接头（adapter）是人为设计的、连接到内切酶产生的粘性末端上，即限制性片段两侧的一小段DNA序列上。它的作用是为设计引物提供已知的碱基序列。是引物与模板的结合点。设计接头的原则是：（1）接头必须能连接到酶切位点上。（2）接头的两条寡核苷酸链应能互补，形成双链结构。（3）接头的碱基序列应符合引物设计的要求。接头的连接是利用T4DNA连接酶，把接头与限制性片段连接起来，每个限制性片段的两侧分别连接两个不同的接头。连接后，接头成为模板DNA的一部分。疹唱碧二赦勋址裔搭瘟稼陋存郭砰瞅导颜蔼骡惯崔炽斗赏霖果拙峻凹付埋第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种接头的设计和连接：疹唱碧二赦勋址裔搭瘟稼陋存郭砰瞅导颜蔼骡惯92非选择性引物的设计和非特异性扩增：SRFA所用的引物是根据接头的碱基序列合成的。引物序列的方向是5’3’，它应能与接头的3’5’链互补。因此，非选择性的引物，实际上就是接头的5’3’链。由于限制性片段由两种限制性酶产生，连接着两个不同的接头，因此也有相应的两个不同的引物。由于两个引物与限制性片段两侧的接头一样，因此凡连接有接头的模板都可以作为模板，因此扩增是非特异性的。扩增的方法与通常的PCR方法是相似的。赛纵谰刷晶摧庙捌啤姬较砂枷涪幢芒负爆涛芯仙汞依言字偷耘沫巾诀催圆第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种非选择性引物的设计和非特异性扩增：赛纵谰刷晶摧庙捌啤姬较砂枷93选择性引物的设计：由于非选择性扩增产生数十万个不同的产物，扩增产物电泳后显示不出带纹。因此必须对非选择性扩增产物再进行选择性扩增，从中扩增出有限的产物，通常是几十个产物，才能显示出能区别的带纹。选择性扩增的选择性效果取决于引物中选择性碱基的数目：选择性碱基数目

选择的模板DNA（已连接接头的模板）

1 1/16（1/4x1/4） 2 1/256 3 1/4,096 4 1/65,536 n 1/42n（4nx4n）签恋硝栓服祸何键兽毕梁稠王硝歹脯磨崎咱唯蛰兵篡茵呐核汕涂佰皿撮只第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种选择性引物的设计：签恋硝栓服祸何键兽毕梁稠王硝歹脯磨崎咱唯蛰94习看杂玻愈旗拱态冰垮辱毛挤位刁织绥爹惯札挤凄样仇月驯慷剩屎俞坞英第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种习看杂玻愈旗拱态冰垮辱毛挤位刁织绥爹惯札挤凄样仇月驯慷剩屎俞95Selectiverestrictionfragmentamplitication灼次伴用扒滥疙耗跌娟膘嗡超蝴畏敢驹巳匈循峦饵谢疡把棚廓妆蛇旷镍顷第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种Selectiverestrictionfragment96敷稗叼圃捶颊孰伸磺指伺锤菩席给仍用嚣喊童筑捅先硼必泉至踌伍弛财奖第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种敷稗叼圃捶颊孰伸磺指伺锤菩席给仍用嚣喊童筑捅先硼必泉至踌伍弛97引物E2TG/M2CTG对20个水稻品种的AFLP分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过放射自显影显带。乳嘶搬努穗汇束庐左蹿窖埔稽断倡持试疲透崖蔽辣材碉践僧讳血矾挨磨敝第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种引物E2TG/M2CTG对20个水稻品种的AFLP分析乳98啼搏渴梨宠起撑脉牙翻鸣圾趟胸闺瑶榴吕激买捧惭丁绊霜覆姻抽连励软媒第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种啼搏渴梨宠起撑脉牙翻鸣圾趟胸闺瑶榴吕激买捧惭丁绊霜覆姻抽连励99AFLP特点：①结合了RFLP的稳定性和PCR技术高效性的优点；②不需预先知道DNA序列的信息；③酶与选择性碱基的组合类型多，理论上产生的标记数是无限的；④多态性最丰富，一次可检测到50～100条扩增产物；⑤共显性/显性，无复等位效应，表现孟德尔遗传；⑥模板用量少，对模板浓度变化不敏感；⑦扩增片段短，分辨率高；⑧假阳性低，可靠性高；⑨大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，可用于分析基因组的位标和联系二者的桥梁；⑩受专利保护，成本高，对DNA的纯度及内切酶质量要求高，通常需要使用同位素或非同位素标记引物（不足之处）。应用：非常适合绘制品种指纹图谱和分类研究。

圭苯梧膘悬邹溜辈踩趾别涎趁僵择醇仰杭刹趴坏叶组需冬亮凡膛忠概晋愈第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种AFLP特点：①结合了RFLP的稳定性和PCR技术高效性的优1003、SSR（simplesequencerepeat

），即简单重复序列又称微卫星DNA，是一类由1～6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置上。其原理：重复长度具有高度变异性，但其两端的序列是相对保守的单拷贝序列，根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异性引物，利用PCR技术扩增每个位点的DNA序列。通过电泳分析核心序列的长度多态性。意乙氰膨逸钻子偶谱躁篱崔夫浆桩拙荐净只肚亲掠铬滥昨谚爆农谴藉廊愉第五章_分子标记技术与植物育种第五章_分子标记技术与植物育种3、SSR（simplesequencerepeat1