第2课时引物及探针设计注意事项

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Real-time12312344最重要、最关键的步骤：引物/探针的设Realtime-PCR所用引物与普通PCR引物设计的区普通PCR引目的是获得目 ，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格Realtime-的 ，扩效、异及物聚。结论：Realtime-PCR对引物设计要求严重要原扩增片段大重要原扩增片段大＜200bp(80-150bp最佳引物长★18-GC★40%-60%(45%-55%最佳退火温上下游Tm尽量接近引物序★1的保守区域整体上碱基不能过偏避免多个重复的碱基引物3’★末尾5个碱基＜2个末位碱基最好为避免出现3个及以上连续相同的碱互补引物避免3个碱基以上的互补序列引物3’端避免2两条引物间避免3个碱基以上的互补序列特异Blast检索RT-PCR尽量跨过内含子，设计在两个不同的外显子重要原探针长25-重要原探针长25-65-72℃，高出引物★1的保守区域且富含2避免多个重复的碱基引物5’不能为探针避免3个碱基以上的互补序列与两条引物间避免3个碱Blast检索★尽量靠近上游引物，最佳距离为1第一步：查找序 软件：NCBI以NCBI为演示打开找到gene选输入ERCC1，点击Search查找找到human点击，进入页面的基本信息介绍ERCC1在组织的表达情况ERCC1SNP汇总。其他的相互SNPSNP 组信mRNA及蛋白的信ERCC1mRNA有3种剪接剪接体2和点击进入mRNA页面，点击 核苷酸序列至txt上txt上不同剪接体的序列用>号隔开★★，保存到指定位置第二步：序列比对，找到保守区软件：BioEdit、MEGA、DNAman（1）打开BioEdit软点击file，下拉菜单，找到找到保存好的BioEdit（4）点击AccessoryApplication，下单，找到ClustalWMultiple勾选outputClustalformat点击RunClustalW，点击比对结果（表示碱基序列相同结论：181bp-892bp范围内碱第三步：设计引PrimerBlast等以ERCC1的190bp-890bp之间的序列为板，设计引（1）打开Primer5.0软2点击File，下拉菜单New，点击 模板碱基序列，Ctrl+V粘贴S：上游引A：下游引F:5'GAGAGACGCCCAACCAGGR:5'CGCACGAACTTCAGTACGGPro:5'FAM-距离上游引物

F:5'TCAGAGCCCCTGGCAGGAGAGR:5'GGGATTGCCCCTCTGCCGAGG引物F:5'AGAGACGCCCAACCAGGCCCTR:5'GGGATTGCCCCTCTGCCGAGGF:5'TCCAACAGCATCATTGTGAGCR:5'GGAATTACGTCGCCAAATTCC软件：NCBI打开NCBI，拉至底部，找将上下游引 过去勾选Human+transcript选勾选Somewhatsequence(blastn)选点击（8）分析结结果：与ERCC1匹配度100%，其他为 点击每一个结果，可看到具体比对序 由大约22个核苷酸组成的单链miRNA长度过于短小无法直接应用常规的PCR技术扩必须要延长待测miRNA的长度，构建出一个足够长的PCR模板方法：茎环法和加尾法（逆转录方法有差异加尾对miRNA进行加PolyA尾处理，改造成的结构，再采用mRNA常用的oligo(dT)反转录引进行反转录，从而得到较长的模板链茎环设计一种特殊的茎环结构的反转录引物，反转录反应中直接完成模板链的引物设计原“一对“一对”是指PCR扩增的上下游引物“半”是反转PCR扩增引物的设计原则遵守常规PCR引物设计原则数据库miRBase打开miRBase，输hsa-miR-21，点击提交加尾 下游引物为公司提供，根据RT引物的同下游引物可通用下游引物是5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT上游引物采用Primer5.0设计，设计过程同一般上游引物与RT引物中miRNA的序列不得超过两个，防止非特异性结miR-21的引物F:R:5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT 发叉结