植物组培实验报告-高睿

植物组培实验报告-高睿不同激素配比对烟草叶片外植体分化的影响摘要:培养基是调控烟草叶片外植体分化途径的一个重要因素，以不同激素配比的培养基比较其对烟草叶片外植体分化的影响，研究不同激素浓度配比对外植体分化的影响。实验结果表明：在NAA/6-BA激素配比中，MS+NAA(0.5mg/L)+6-BA(1.5mg/L)为出芽最优培养基;在IAA/6-BA激素配比中，MS+IAA(Omg/L)+6-BA⑵Omg/L)是最优生根培养基。得出一结论：当NAA浓度低时(即6-BA浓度高时)有利于芽的分化，当IAA浓度高时(即6-BA浓度低时)有利于根的分化。关键词:激素配比，烟草叶片，外植体，愈伤组织刖g烟草(Nicotianatabacum)属茄科烟草属的一年生草本植物，原产于美洲和大洋洲|。烟草作为重要的经济作物和工业原料作物，具有药用、工业用、保健美容等价值，不仅对国民经济的发展起着重要作用，而且作为模式植物在植物研究中得到广泛应用。目前，烟草一般采用有性繁殖，但繁殖的烟苗不均衡，易发生变异，而且易感病菌，造成多种病害发生，品质退化，从而影响经济收入。而通过组织培养技术，可以保持烟草优良品种的优良性状，减少病虫害，从而达到高产优质的目的[2,4,5]。由于其易进行组织培养得到再生植株，被广大学者誉为植物组织培养的理想植物，也是研究植物细胞分化和脱分化的理想材料，故此烟草在植物组织分化研究中占据了重要的地位。激素是植物组织培养的关键因素，调节激素水平和配比，已成为提高组织分化频率的有效手段，人们利用植物愈伤组织研究激素调节工作已有许多报道[4,6,7]。但在具体试验中，激素的种类、浓度和配比，十分错综复杂。因此，在实际试验中需对培养条件进行筛选，以求得最适激素种类、浓度和配比。本实验以烟草叶片组织为外植体进行组织培养，主要研究不同植物激素配比的MS培养基上烟草愈伤组织诱导的情况。材料方法1实验材料无菌烟草苗叶片2实验试剂MS培养基母液，NAA,6-BA,IAA,70%乙醇，Imol/LNaOH,1mol/LHClo3实验仪器超净工作台，高压灭菌设备，手术剪、长柄剪子，解剖刀，酒精灯，电子天平，无菌吸水纸，标签纸，记号笔，烧杯，培养皿，三角瓶，线绳，，封口膜，移液抢等。4实验设计表1不同激素配比5试验方法(1)MS培养基配制取一个大烧杯，加入一定量的水，再分别加入四种MS培养基母液、蔗糖30g/L,琼脂7g/L,进行加热溶解。用蒸储水定容至1000ml,再用1mol/L的NaOH和HCl将pH调至5.8。将培养基平均分装入10个100ml三角瓶内，贴上标签。(2)将培养基放入高压灭菌锅,0.11Mpa,121?下灭菌20min。(3)接种a、接种前打开超净工作台紫外灯照射30min,之后关闭紫外灯打开送风开关并通风lOmin;b、用70%乙醇溶液擦拭超净工作台台面和手，将培养基及接种工具放入超净工作台台面两侧;C、根据实验设计表1植物激素配比添加激素，倒板（超净工作台下进行）；d、取无菌烟草苗的嫩叶片作外植体。将无菌烟草叶片放入无菌碟子中,每片叶子用解剖刀切去边缘后再切成5mm见方小块,在火焰上方接入到各个培养基中，每个培养皿中可接种3-4个小块（超净工作台下进行）；e、将各个培养基贴上标签，放到培养室中培养。（4）进行实验观察记录，并照相。实验结果经过30天的观察，对不同的激素配比外植体的发育情况进行了记录。.愈伤组织分化的形态发生接种培养1周后，培养基内的叶片边缘慢慢上卷，叶片外植体明显膨大，培养2周后，切口边缘处形成淡绿或浅黄色的愈伤组织，；愈伤组织首先发生在叶片边缘，为淡绿色颗粒状，随着进一步培养，出愈伤不断加大。但多是叶片边缘形成的愈伤不断扩增，叶片中央形成少量愈伤。培养3周后，形成大块的，质地紧密的浅绿色半透明的愈伤组织，并且愈伤组织上出现绿色芽点。再继续培养至30天，进行观察。.激素对愈伤组织分化的影响本实验以MS培养基为对照，对3种激素设置了两种组合，每种激素组合含5个浓度配比，每组处理3次重复。在MS对照培养基上，叶片慢慢变黄，枯萎至死，未形成愈伤组织（图1）。图1MS对照培养基2.2在第1组NAA与6-BA激素配比中，叶片外植体均产生了愈伤组织9愈伤组织诱导率为100%。其中，编号1号和2号培养基中，愈伤组织诱导分化出茎芽，2号培养基诱导分化出的茎芽要多于1号培养基(图;3号和4号培养基愈伤组织无任何分化，5号培养基其愈伤组织诱导分化出少量的根(图3)。AB图2A为1号培养基:NAA?6-BA为0?2.0((mg/L)B为2号培养基:NAA?6-BA为0.5?1.5(mg/L)CDE图3c为3号培养基:NAA?6-BA为1.0?1.0(mg/L)D为4号培养基:NAA?6-BA为1.5?0.5(mg/L)E为5号培养基:NAA?6-BA为0?2.0(mg/L)2.3在第2组IAA与6-BA激素配比中，叶片外植体均产生了愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%。其中，编号1号培养基中，愈伤组织诱导分化出茎芽，2号、3号和4号培养基愈伤组织无任何分化，5号培养基其愈伤组织诱导分化出大量的根(图4)。12345图41、2、3、4、5分别代表培养基编号，与表1中2组IAA/6BA的配比相对应。讨论实验结果表明，外源激素对愈伤组织的分化有着至关重要的作用，适量的外源激素能够在外植体分化初期和内源激素相互作用诱导外植体分化，外源激素量过高或者过低都能阻碍转基因烟草外植体分化。本试验中，在不含任何激素的MS对照培养基上，发现烟草叶片外植体慢慢变黄至死亡，不能形成愈伤组织。在NAA/6-BA与IAA/6-BA激素配比不同的情况下，培养基均产生了愈伤组织，并具有愈伤组织诱导分化出茎芽和根的现象。其中，在NAA/6-BA激素配比影响下，MS+NAA(Omg/L)+6-BA(2.Omg/L)与MS+NAA(0.5mg/L)+6-BA(1.5mg/L)适合愈伤组织诱导分化出茎芽，且MS+NAA(0.5mg/L)+6-BA(l.5mg/L)为出芽最优培养基;MS+NAA(2.Omg/L)+6-BA(Omg/L)能够诱导愈伤组织分化出少量的根，根具有白色的根毛。在IAA/6-BA激素配比中，MS+IAA(0mg/L)+6-BA(2.0mg/L)中诱导分化出茎芽，被认为是最优生芽培养基;MS+IAA(0mg/L)+6-BA(2.Omg/L)中诱导分化出大量的具白色根毛的根，被认为是最优生根培养基。当培养基中NAA/6-BA比值高时促进根的分化，比值低时促进芽的分化，2种激素浓度相当时\诱导愈伤组织占优势或不分化。本实验中，当NAA浓度高时，有利于根的分化，当6-BA高时，有利于芽的分化。曾有研究表明:6-BA对芽器官形成有强烈的促进作用[8],但附加2mg/L的NAA后，则抵消BA对芽形成的促进作用而明显促进愈伤组织的形成。本文的研究结果与其一致。据报道，在培养过程中，当IAA的相对浓度较高时，则有利于根的分化和细胞增殖[9]。本实验中，IAA/6-BA的激素配比中，最大IAA浓度下产生了大量的根，这与报道相一致。由试验结果可以看出，在植物激素诱导愈伤组织形成和茎芽分化中，激素的配比是很重要的，不同的激素配比，对外植体材料产生愈伤组织和根芽分化影响很大[10]o在该试验中，一些培养皿中的外植体无分化，还有一些外植体感染了细菌。因此，要想减少外界因素的干扰，应注意以下4点：(1)接种用的工具要在酒精灯火焰上灼烧。应尽量使外植体切口接触培养基。培养皿边缘应斜向火焰，在酒精灯火焰附近操作。(2)封口时用封口膜将培养皿封紧密，以免微生物进入，造成污染，导致培养失败。灭菌工作至关重要。(3)在进行植物组织培养前，将培养基和接种所需的物品放在高压蒸气灭菌锅中灭菌。(4)接种前，操作者要用肥皂清洗双手，擦干，再用酒精棉球擦拭双手和超净工作台。参考文献[1]周仕顺，掏志章.烟草的组织培养[J].云南农业科技，2005,(1).[2]肖军,张云霄，刘伯峰.烟草的组织培养技术研究[J].泰山学院学报,2009,06:94-98.[3]施和平,等.烟草叶片组织培养及植株再生[J].亚热带植物科学，2003,32(4).[4]康实.烟草的组织培养研究进展及应用前景[J].楚雄师专学报，1999,14(3).[5]何川生，王晓云，雷永和.烟草快速繁殖及培养的研究[J].云南农业大学学报,1998(4):392-395.[6]崔澄.植物激素与细胞分化及形态发生的关系.细胞生物学杂志，1983,5⑵：「5[7]陈辉，姚志恒.烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证[J].安徽农业科学,2009,14:6333-633