《有机酸发酵》有机酸发酵工业进展课件

有机酸发酵工业进展有机酸发酵工业进展报告内容

一.有机酸发酵工业概况二.中国有机酸发酵工业现状及成就

三.中国有机酸发酵研究进展举例丙酸发酵

α-酮戊二酸发酵四.中国有机酸发酵工业展望报告内容一.有机酸发酵工业概况一、有机酸发酵工业概况

一、有机酸发酵工业概况柠檬酸乳酸乙酸丙酸苹果酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有机酸概述有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸,其酸性源于羧基

(-COOH)柠檬酸乳酸乙酸丙酸苹果酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有机酸概述有机酸Varioussubstancesthatcanbederivedfromsuccinicacidbychemicalconversion.TrendsinBiotechnology,2008:100-108有机酸概述有机酸也是重要的平台化合物VarioussubstancesthatcanbeRenewablerawmaterials全球有机酸的产量超过300万吨、产值超过50亿美元柠檬酸乳酸苹果酸葡萄糖酸醋酸衣康酸曲酸丙酮酸酒石酸丙酸C2C3C4C5C6丙烯酸富马酸酒石酸有机酸发酵概况Renewable全球有机酸的产量超过300万吨、产值超过5二、中国有机酸发酵工业现状及成就

二、中国有机酸发酵工业现状及成就中国有机酸发酵工业现状有机酸工业是发酵工业领域一个成熟的分支。2012年中国有机酸的总产量超过200万吨。柠檬酸乳酸苹果酸葡萄糖酸醋酸衣康酸曲酸丙酮酸食品和饮料医药工业化学工业建筑业例如:酸味剂例如:抗凝血剂例如:洗涤剂例如:混泥土日照鲁信金禾生化有限公司安徽丰原集团河南金丹乳酸科技股份有限公司潍坊英轩实业有限公司山东柠檬生化有限公司宜兴协联生物化学有限公司杭州宝晶生物化工有限公司青岛科海生物有限公司天富生化技术有限责任公司西王集团主要生产企业产品应用领域沈阳科纳提克公司酒石酸其他工业例如:显影剂琥珀酸安徽雪郎生物科技股份有限公司丙酸中国有机酸发酵工业现状有机酸工业是发酵工业领域一个成熟的分支中国有机酸发酵工业成就(1)自主创新能力显著增强研发投入加大:企业研发投入约占销售收入的3-5%。研究平台发酵技术国家工程研究中心生化工程国家工程研究中心粮食发酵工艺及技术国家工程实验室发酵行业技术创新服务平台衣康酸:2000年获国家科技进步二等奖。长链二元酸:2006年获国家科技进步二等奖。丙酮酸:2006年获国家科技进步二等奖。L-乳酸:2011年获国家科技进步二等奖。“丙酮酸发酵技术”被世界上最大发酵公司之一日本味之素公司购买,成为该公司从中国购买的第一个技术。中国有机酸发酵工业成就(1)自主创新能力显著增强研发投入加中国有机酸发酵工业成就(2)产品产量迅速提高、产品结构更趋合理近20年,我国有机酸发酵工业主要产品的总产量呈快速增长的态势。产品品种从早期2-3个发展到10余个。产品19921997200220072012柠檬酸162132.789107乳酸0.51.254.513衣康酸0.30.7523葡萄糖酸钠0.382550近20年有机酸主要产品产量单位:万吨中国有机酸发酵工业成就(2)产品产量迅速提高、产品结构更趋中国有机酸发酵工业成就(3)生产技术水平不断上升（以柠檬酸为例）12.3%发酵产酸16.5%1999年2012年77%提取总收率90%1999年2012年发酵周期72hr55hr1999年2012年成品粮耗1.86t/t1.59t/t1999年2012年汽耗12.5t/t4.3t/t1999年2012年电耗1985kW/t966kW/t1999年2012年水耗142m3/t16m3/t1999年2012年中国有机酸发酵工业成就(3)生产技术水平不断上升（以柠檬酸有机酸行业龙头近年来纷纷通过扩大优势产品的产能,提高抗风险能力,使得行业产业集中度呈现逐步提高态势,规模经济效应也使行业平均期间费用率呈现下降的趋势,这有利于保障行业的盈利能力提升与长期发展。中国有机酸发酵工业成就(4)企业规模扩大,产业集中度增强行业产量企业个数产量占总量比例(%)柠檬酸20万吨以上5>80乳酸2万吨以上273葡萄糖酸钠2万吨以上6>80衣康酸1万吨以上2>90我国有机酸发酵行业产业集中度有机酸行业龙头近年来纷纷通过扩大优势产品的产能,提高抗风险能中国有机酸发酵工业成就(5)新技术、新材料和新装备得到广泛应用酶技术、膜技术和计算机技术越来越多的被采用设备趋于大型化、连续化和自动化中国有机酸发酵工业成就(5)新技术、新材料和新装备得到广泛应三.中国有机酸发酵研究进展－丙酸三.中国有机酸发酵研究进展－丙酸丙酸的应用及市场2012:260mlbs(117,936tonnes)化学法:2万/吨发酵法:6万/吨（食品安全）丙酸钙价格06年全球产量37.7万吨75%用于谷物和饲料防腐丙酸的应用及市场2012:260mlbs(117,93筛选丙酸高产菌从奶制品厂取样低丙酸浓度富集高丙酸浓度初筛产量检测复筛242529303236菌种鉴定筛选野生型质粒细胞壁裂解条件优化

Blank12345678Lysozyme00.500.50.51110ProteinaseK000.50.510.5101Result---++++--条件:溶菌酶20mg/mL37oC,蛋白酶K2mg/mL56oC.“-”表示细胞壁没有裂解.“+”表示细胞壁被裂解.菌种是否含有质粒P.a×25×32√29×30×24×36×质粒电泳图质粒鉴定分析质粒ORF转录水平分析丙酸高产菌、野生质粒的筛选以及质粒分析筛选丙酸高产菌从奶制品厂取样低丙酸浓度富集高丙酸浓度初筛产量丙酸杆菌代谢工程改造策略过量表达甘油脱氢酶（gldA）,提高对甘油的利用速率过量表达苹果酸脱氢酶（mdh）,富马酸水合酶（fumC）,提高丙酸代谢途径通量gldAmdhfumC丙酸杆菌代谢工程改造策略过量表达甘油脱氢酶（gldA）,提高过量表达甘油脱氢酶电转化241000菌落PCR菌种鉴定Marker100012Marker151110001235371000Marker100012野生菌与工程菌分批发酵对比△:丙酸(PA),□:甘油浓度,▲:细胞干重(DCW),■:乙酸(AA),◆:琥珀酸(SA),ӿ:甘油脱氢酶比酶活.2929(pZGX03-gldA)菌株PA(g/L)YP/S(g/g)YP/A(g/g)rPA/Glycerol(g/g)生产强度(gL-1h-1)2922.0614.618.20.730.1529(pZGX03-gldA)28.23239.080.9410.20过量表达甘油脱氢酶电转化241000菌落PCR菌种鉴定Ma培养基及培养条件优化不同种类的碳源对丙酸发酵过程的影响不同种类的氮源对丙酸发酵过程的影响酵母粉浓度对发酵过程的影响PADCWPADCWSA最佳碳源为20g/L甘油,最佳氮源为酵母粉,最适浓度为10g/L。最佳接种量为10%,最佳接种龄为48-60h左右种子,最佳培养温度为30℃

。培养基及培养条件优化不同种类的碳源对丙酸发酵过程的影响不同种Control2.104.3712.3342.105.2711.4682.155.5912.46122.264.7811.63162.135.3411.59MgSO47H2O(mg/L)DCW(g/L)SA(g/L)PA(g/L)金属Mg2+对发酵过程影响金属Co2+对发酵过程影响DCW(g/L)SA(g/L)PA(g/L)Control1.644.0410.9841.664.5510.9881.673.9610.61121.614.0710.37161.573.7210.06ZnSO47H2O(mg/L)金属Zn2+对发酵过程影响金属Mn2+对发酵过程影响PASADCWMnSO4·H2O(mg/L)DCW(g/L)SA(g/L)PA(g/L)Control1.644.0410.9841.845.8111.0181.764.7111.27121.754.1410.75161.754.4211.30培养基及培养条件优化-金属离子最佳Co2+浓度为10mg/L

Control2.104.3712.3342.发酵模式研究-分批发酵甘油初始浓度对丙酸发酵过程的影响20g/L50g/L70g/L80g/L—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA甘油浓度对细胞比生长速率的影响甘油浓度对丙酸比合成速率的影响70g/L20g/L50g/L80g/L20g/L50g/L70g/L80g/L分批发酵过程中,随着甘油浓度的增加,菌体比生长速率及丙酸的比合成速率显著下降,说明较高的甘油浓度不利于菌体生长及丙酸的合成。发酵模式研究-分批发酵甘油初始浓度对丙酸发酵过程的影响20参数初始甘油浓度（g/L）20507080剩余甘油浓度（g/L）0.02±0.0010.03±0.00150.1±0.050.12±0.06发酵时间（h）120±6150±8300±17350±24细胞干重（g/L）1.86±0.063.79±0.132.13±0.072.01±0.05丙酸产量（g/L）15.72±0.4128.53±0.8229.21±0.7332.00±0.91乙酸产量（g/L）1.20±0.042.56±0.083.41±0.125.20±0.21琥珀酸产量（g/L）2.31±0.714.24±0.325.53±0.216.71±0.23丙酸/琥珀酸（g/g）6.81±0.336.73±0.305.28±0.324.77±0.23丙酸/乙酸（g/g）13.10±0.5311.14±0.628.57±0.426.15±0.31丙酸/甘油（%）79±3.957±2.842±2.140±1.8丙酸生产强度（g·L-1h-1）0.13±0.00520.19±0.00950.10±0.00310.09±0.0036发酵模式研究-分批发酵不同甘油浓度下过程动力学参数比较随着初始甘油浓度的增加,发酵时间明显延长,生产强度显著下降;菌体干重先升高后降低;初始甘油浓度在20g/L—50g/L时适合菌体生长。仅通过分批发酵难以实现丙酸发酵高产量、高得率和高生产强度的统一参数初始甘油浓度（g/L）20507080剩余甘油浓度（g/发酵模式研究-流加发酵注:A初始甘油浓度为20g/L,48h-96h恒速流加浓度为400g/L的甘油水溶液,流速控制为0.01L/h;B初始甘油浓度为30g/L,72h-120h恒速流加浓度为400g/L的甘油水溶液,流速控制为0.01L/h;C初始甘油浓度为50g/L,在96h时一次性添加质量为80g的纯甘油;D初始甘油浓度为40g/L,在84h一次性添加160g纯甘油;

—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA发酵模式研究-流加发酵注:A初始甘油浓度为20g/L,4参数培养模式ABCD剩余甘油浓度（g/L）0.02±0.0010.03±0.00150.1±0.050.12±0.06发酵时间（h）240±14220±11200±11250±15细胞干重（g/L）2.99±0.094.76±0.173.79±0.114.1±0.14丙酸产量（g/L）34.81±1.0144.62±1.1235.51±0.9243.50±1.21乙酸产量（g/L）2.71±0.082.42±0.082.81±0.092.51±0.06琥珀酸产量（g/L）4.21±0.123.52±0.234.52±0.214.11±0.13丙酸/琥珀酸（g/g）8.27±0.4012.68±0.517.86±0.3210.58±0.49丙酸/乙酸（g/g）12.85±0.6518.44±0.7812.64±0.5717.33±0.87丙酸/甘油（%）49±2.556±2.751±1.954±2.3丙酸生产强度（g·L-1h-1）0.15±0.00710.20±0.0080.18±0.00630.17±0.0068不同流加发酵模式下过程动力学参数比较发酵模式研究-流加发酵最佳流加策略:初始甘油为30g/L,72-120h进行恒速流加,流加速率为0.11L/h(甘油浓度为400g/L)参数培养模式ABCD剩余甘油浓度（g/L）0.02±0.00发酵模式研究-10m3发酵罐放大试验丙酸10m3罐中试发酵过程曲线—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA丙酸最高产量为47.28g/L,生产强度为0.197g·L-1h-1全球第二家采用发酵法生产丙酸发酵模式研究-10m3发酵罐放大试验丙酸10m3罐中试发三.中国有机酸发酵研究进展－α-酮戊二酸三.中国有机酸发酵研究进展－α-酮戊二酸

-酮戊二酸的应用降低病患机体损耗清除自由基,延缓衰老提高繁殖率,促进骨骼的生长有机中间体体格增强剂、运动饮料添加剂医药化妆品食品化工饲料-酮戊二酸的应用降低病患机体损耗清除自由基,延缓衰老提高

-酮戊二酸市场概况国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量约为1万吨

名称价格(RMB/Kg)纯度用途-酮戊二酸28098%医药、化工中间体L-精氨酸:-酮戊二酸钠盐(2:1)35099%运动饮料添加剂L-鸟氨酸:-酮戊二酸钠盐(1:1)65099%运动饮料添加剂-酮戊二酸市场概况国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量化学法发酵法筛选得到的菌种:解脂亚诺酵母

-酮戊二酸的生产方法生产效率低、环境非友好和有毒试剂使用,限制其在医药、保健品和食品等高附加值产品生产应用生产效率高环境友好食品安全性高化学法发酵法筛选得到的菌种:解脂亚诺酵母-酮戊二酸的生产食品安全级生物法生产-酮戊二酸土壤样品维生素B1缺陷型筛选500株微生物菌株0.1g/L13.4%0.1-1g/L74.4%1-10g/L6.4%10g/L5.8%菌落形态AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG18SrRNAYarrowialipolyticaWSH-Z06食品安全级生物法生产-酮戊二酸土壤样品维生素B1缺陷型筛选生物法生产-酮戊二酸的关键问题当以甘油为唯一碳源时,发酵6天后-KG产量可达30g/L左右,但是发酵液中同时会积累大量的副产物—丙酮酸(30g/L左右)。Y.lipolyticaWSH-Z06摇瓶发酵曲线-KG(■),Glycerol(●),Pyruvate(▲),DCW(▼)

存在的问题生物法生产-酮戊二酸的关键问题当以甘油为唯一碳源时,发酵61.辅因子调控3.节流2.开源4.调控转运蛋白解决方案——代谢工程改造解脂亚洛酵母1.辅因子调控3.节流2.开源4.调控转运蛋白解决方案——代代谢工程改造解脂亚洛酵母1.辅因子调控代谢工程改造解脂亚洛酵母1.辅因子调控调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累CONACS1/ACLCONACS1ACL过量表达ACS1基因使胞内ACS比酶活达到0.92U/mgprotein,过量表达ACL基因使胞内ACL酶活达到了1.51U/mgprotein,比对照分别提高了10.5和11.6倍,胞内乙酰辅酶A含量分别是对照的231.2%和244.2%。调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累CONACS1/调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累过量表达ACS1和ACL基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响■:-KG;●:Glycerol;▲:pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACS1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACL.提高16.2%提高28.6%Y.lipolytica-ACS1和Y.lipolytica-ACL中-酮戊二酸的产量分别为42.2g/L和46.7g/L,比对照菌(36.3g/L)分别提高了16.2%和28.6%。丙酮酸产量分别为14.5g/L和10.6g/L,比对照菌(21.2g/L)分别降低了31.6%和50%。调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累过量表达ACS1和A代谢工程改造解脂亚洛酵母2.开源代谢工程改造解脂亚洛酵母2.开源强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累6.5倍10.2倍CONScPYC1RoPYC2表达载体p0(hph)-ScPYC1和p0(hph)-RoPYC2的构建Y.lipolytica及其突变株胞内PC酶活转化子提取基因组进行PCR验证强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累6.5倍10.2倍C强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累过量表达ScPYC1和RoPYC2基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响■:-KG;●:Glycerol;▲:Pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ScPYC1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-RoPYC2.Y.lipolytica-ScPYC1和Y.lipolytica-RoPYC2中-酮戊二酸的产量分别为45.2g/L和49.1g/L,比对照菌(36.3g/L)分别提高了24.5%和35.3%。丙酮酸产量分别为10.2g/L和6.4g/L,比对照菌(21.2g/L)分别降低了51.9%和69.8%。提高24.5%提高35.3%强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累过量表达ScPYC15M3中试结果Timecourseoffed-batchfermentationbyconstantfeedingstrategyinpilotscale发酵156h,PA:24.6g/L;

-KG:64.2g/L5M3中试结果Timecourseoffed-bat四.中国有机酸发酵技术展望四.中国有机酸发酵技术展望技术发展1:基于组学分析构建获得优良菌种工业微生物基因组组学分析计算模拟分子改造新一代工业菌种基因组转录组蛋白质组代谢组结构设计途径设计网络设计数据集成基因组理性设计基因组网络重构全局扰动优化多位点快速进化基因组删减优化代谢途径优化技术发展1:基于组学分析构建获得优良菌种工业微生物基因组组学技术发展2:发展信息和控制技术提高装备水平发酵过程的自动控制基于实时代谢流分析的在线状态预测与控制基于智能控制系统的过程放大模拟系统基于人工智能技术的过程控制与优化细胞生理代谢与流场特性的结合生理代谢特征与代谢通量分析基于传递、混合与生物反应动力学计算流体力学、发酵罐流场的计算机模拟技术发展2:发展信息和控制技术提高装备水平发酵过程的自动控制技术发展3:技术集成提高产品质量和实现清洁生产高效分离单元及装备的开发与集成连续板框过滤技术、膜过滤技术人工智能模拟与控制的结晶技术生化反应与分离耦合技术资源和能量的高效利用发酵过程清洁生产技术和闭路循环工艺发酵食品生产废渣资源化和高值化工艺发酵废弃物和副产物的综合利用和资源化处理技术发展3:技术集成提高产品质量和实现清洁生产高效分离单元及有机酸发酵工业进展有机酸发酵工业进展报告内容

一.有机酸发酵工业概况二.中国有机酸发酵工业现状及成就

三.中国有机酸发酵研究进展举例丙酸发酵

α-酮戊二酸发酵四.中国有机酸发酵工业展望报告内容一.有机酸发酵工业概况一、有机酸发酵工业概况

一、有机酸发酵工业概况柠檬酸乳酸乙酸丙酸苹果酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有机酸概述有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸,其酸性源于羧基

(-COOH)柠檬酸乳酸乙酸丙酸苹果酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有机酸概述有机酸Varioussubstancesthatcanbederivedfromsuccinicacidbychemicalconversion.TrendsinBiotechnology,2008:100-108有机酸概述有机酸也是重要的平台化合物VarioussubstancesthatcanbeRenewablerawmaterials全球有机酸的产量超过300万吨、产值超过50亿美元柠檬酸乳酸苹果酸葡萄糖酸醋酸衣康酸曲酸丙酮酸酒石酸丙酸C2C3C4C5C6丙烯酸富马酸酒石酸有机酸发酵概况Renewable全球有机酸的产量超过300万吨、产值超过5二、中国有机酸发酵工业现状及成就

二、中国有机酸发酵工业现状及成就中国有机酸发酵工业现状有机酸工业是发酵工业领域一个成熟的分支。2012年中国有机酸的总产量超过200万吨。柠檬酸乳酸苹果酸葡萄糖酸醋酸衣康酸曲酸丙酮酸食品和饮料医药工业化学工业建筑业例如:酸味剂例如:抗凝血剂例如:洗涤剂例如:混泥土日照鲁信金禾生化有限公司安徽丰原集团河南金丹乳酸科技股份有限公司潍坊英轩实业有限公司山东柠檬生化有限公司宜兴协联生物化学有限公司杭州宝晶生物化工有限公司青岛科海生物有限公司天富生化技术有限责任公司西王集团主要生产企业产品应用领域沈阳科纳提克公司酒石酸其他工业例如:显影剂琥珀酸安徽雪郎生物科技股份有限公司丙酸中国有机酸发酵工业现状有机酸工业是发酵工业领域一个成熟的分支中国有机酸发酵工业成就(1)自主创新能力显著增强研发投入加大:企业研发投入约占销售收入的3-5%。研究平台发酵技术国家工程研究中心生化工程国家工程研究中心粮食发酵工艺及技术国家工程实验室发酵行业技术创新服务平台衣康酸:2000年获国家科技进步二等奖。长链二元酸:2006年获国家科技进步二等奖。丙酮酸:2006年获国家科技进步二等奖。L-乳酸:2011年获国家科技进步二等奖。“丙酮酸发酵技术”被世界上最大发酵公司之一日本味之素公司购买,成为该公司从中国购买的第一个技术。中国有机酸发酵工业成就(1)自主创新能力显著增强研发投入加中国有机酸发酵工业成就(2)产品产量迅速提高、产品结构更趋合理近20年,我国有机酸发酵工业主要产品的总产量呈快速增长的态势。产品品种从早期2-3个发展到10余个。产品19921997200220072012柠檬酸162132.789107乳酸0.51.254.513衣康酸0.30.7523葡萄糖酸钠0.382550近20年有机酸主要产品产量单位:万吨中国有机酸发酵工业成就(2)产品产量迅速提高、产品结构更趋中国有机酸发酵工业成就(3)生产技术水平不断上升（以柠檬酸为例）12.3%发酵产酸16.5%1999年2012年77%提取总收率90%1999年2012年发酵周期72hr55hr1999年2012年成品粮耗1.86t/t1.59t/t1999年2012年汽耗12.5t/t4.3t/t1999年2012年电耗1985kW/t966kW/t1999年2012年水耗142m3/t16m3/t1999年2012年中国有机酸发酵工业成就(3)生产技术水平不断上升（以柠檬酸有机酸行业龙头近年来纷纷通过扩大优势产品的产能,提高抗风险能力,使得行业产业集中度呈现逐步提高态势,规模经济效应也使行业平均期间费用率呈现下降的趋势,这有利于保障行业的盈利能力提升与长期发展。中国有机酸发酵工业成就(4)企业规模扩大,产业集中度增强行业产量企业个数产量占总量比例(%)柠檬酸20万吨以上5>80乳酸2万吨以上273葡萄糖酸钠2万吨以上6>80衣康酸1万吨以上2>90我国有机酸发酵行业产业集中度有机酸行业龙头近年来纷纷通过扩大优势产品的产能,提高抗风险能中国有机酸发酵工业成就(5)新技术、新材料和新装备得到广泛应用酶技术、膜技术和计算机技术越来越多的被采用设备趋于大型化、连续化和自动化中国有机酸发酵工业成就(5)新技术、新材料和新装备得到广泛应三.中国有机酸发酵研究进展－丙酸三.中国有机酸发酵研究进展－丙酸丙酸的应用及市场2012:260mlbs(117,936tonnes)化学法:2万/吨发酵法:6万/吨（食品安全）丙酸钙价格06年全球产量37.7万吨75%用于谷物和饲料防腐丙酸的应用及市场2012:260mlbs(117,93筛选丙酸高产菌从奶制品厂取样低丙酸浓度富集高丙酸浓度初筛产量检测复筛242529303236菌种鉴定筛选野生型质粒细胞壁裂解条件优化

Blank12345678Lysozyme00.500.50.51110ProteinaseK000.50.510.5101Result---++++--条件:溶菌酶20mg/mL37oC,蛋白酶K2mg/mL56oC.“-”表示细胞壁没有裂解.“+”表示细胞壁被裂解.菌种是否含有质粒P.a×25×32√29×30×24×36×质粒电泳图质粒鉴定分析质粒ORF转录水平分析丙酸高产菌、野生质粒的筛选以及质粒分析筛选丙酸高产菌从奶制品厂取样低丙酸浓度富集高丙酸浓度初筛产量丙酸杆菌代谢工程改造策略过量表达甘油脱氢酶（gldA）,提高对甘油的利用速率过量表达苹果酸脱氢酶（mdh）,富马酸水合酶（fumC）,提高丙酸代谢途径通量gldAmdhfumC丙酸杆菌代谢工程改造策略过量表达甘油脱氢酶（gldA）,提高过量表达甘油脱氢酶电转化241000菌落PCR菌种鉴定Marker100012Marker151110001235371000Marker100012野生菌与工程菌分批发酵对比△:丙酸(PA),□:甘油浓度,▲:细胞干重(DCW),■:乙酸(AA),◆:琥珀酸(SA),ӿ:甘油脱氢酶比酶活.2929(pZGX03-gldA)菌株PA(g/L)YP/S(g/g)YP/A(g/g)rPA/Glycerol(g/g)生产强度(gL-1h-1)2922.0614.618.20.730.1529(pZGX03-gldA)28.23239.080.9410.20过量表达甘油脱氢酶电转化241000菌落PCR菌种鉴定Ma培养基及培养条件优化不同种类的碳源对丙酸发酵过程的影响不同种类的氮源对丙酸发酵过程的影响酵母粉浓度对发酵过程的影响PADCWPADCWSA最佳碳源为20g/L甘油,最佳氮源为酵母粉,最适浓度为10g/L。最佳接种量为10%,最佳接种龄为48-60h左右种子,最佳培养温度为30℃

。培养基及培养条件优化不同种类的碳源对丙酸发酵过程的影响不同种Control2.104.3712.3342.105.2711.4682.155.5912.46122.264.7811.63162.135.3411.59MgSO47H2O(mg/L)DCW(g/L)SA(g/L)PA(g/L)金属Mg2+对发酵过程影响金属Co2+对发酵过程影响DCW(g/L)SA(g/L)PA(g/L)Control1.644.0410.9841.664.5510.9881.673.9610.61121.614.0710.37161.573.7210.06ZnSO47H2O(mg/L)金属Zn2+对发酵过程影响金属Mn2+对发酵过程影响PASADCWMnSO4·H2O(mg/L)DCW(g/L)SA(g/L)PA(g/L)Control1.644.0410.9841.845.8111.0181.764.7111.27121.754.1410.75161.754.4211.30培养基及培养条件优化-金属离子最佳Co2+浓度为10mg/L

Control2.104.3712.3342.发酵模式研究-分批发酵甘油初始浓度对丙酸发酵过程的影响20g/L50g/L70g/L80g/L—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA甘油浓度对细胞比生长速率的影响甘油浓度对丙酸比合成速率的影响70g/L20g/L50g/L80g/L20g/L50g/L70g/L80g/L分批发酵过程中,随着甘油浓度的增加,菌体比生长速率及丙酸的比合成速率显著下降,说明较高的甘油浓度不利于菌体生长及丙酸的合成。发酵模式研究-分批发酵甘油初始浓度对丙酸发酵过程的影响20参数初始甘油浓度（g/L）20507080剩余甘油浓度（g/L）0.02±0.0010.03±0.00150.1±0.050.12±0.06发酵时间（h）120±6150±8300±17350±24细胞干重（g/L）1.86±0.063.79±0.132.13±0.072.01±0.05丙酸产量（g/L）15.72±0.4128.53±0.8229.21±0.7332.00±0.91乙酸产量（g/L）1.20±0.042.56±0.083.41±0.125.20±0.21琥珀酸产量（g/L）2.31±0.714.24±0.325.53±0.216.71±0.23丙酸/琥珀酸（g/g）6.81±0.336.73±0.305.28±0.324.77±0.23丙酸/乙酸（g/g）13.10±0.5311.14±0.628.57±0.426.15±0.31丙酸/甘油（%）79±3.957±2.842±2.140±1.8丙酸生产强度（g·L-1h-1）0.13±0.00520.19±0.00950.10±0.00310.09±0.0036发酵模式研究-分批发酵不同甘油浓度下过程动力学参数比较随着初始甘油浓度的增加,发酵时间明显延长,生产强度显著下降;菌体干重先升高后降低;初始甘油浓度在20g/L—50g/L时适合菌体生长。仅通过分批发酵难以实现丙酸发酵高产量、高得率和高生产强度的统一参数初始甘油浓度（g/L）20507080剩余甘油浓度（g/发酵模式研究-流加发酵注:A初始甘油浓度为20g/L,48h-96h恒速流加浓度为400g/L的甘油水溶液,流速控制为0.01L/h;B初始甘油浓度为30g/L,72h-120h恒速流加浓度为400g/L的甘油水溶液,流速控制为0.01L/h;C初始甘油浓度为50g/L,在96h时一次性添加质量为80g的纯甘油;D初始甘油浓度为40g/L,在84h一次性添加160g纯甘油;

—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA发酵模式研究-流加发酵注:A初始甘油浓度为20g/L,4参数培养模式ABCD剩余甘油浓度（g/L）0.02±0.0010.03±0.00150.1±0.050.12±0.06发酵时间（h）240±14220±11200±11250±15细胞干重（g/L）2.99±0.094.76±0.173.79±0.114.1±0.14丙酸产量（g/L）34.81±1.0144.62±1.1235.51±0.9243.50±1.21乙酸产量（g/L）2.71±0.082.42±0.082.81±0.092.51±0.06琥珀酸产量（g/L）4.21±0.123.52±0.234.52±0.214.11±0.13丙酸/琥珀酸（g/g）8.27±0.4012.68±0.517.86±0.3210.58±0.49丙酸/乙酸（g/g）12.85±0.6518.44±0.7812.64±0.5717.33±0.87丙酸/甘油（%）49±2.556±2.751±1.954±2.3丙酸生产强度（g·L-1h-1）0.15±0.00710.20±0.0080.18±0.00630.17±0.0068不同流加发酵模式下过程动力学参数比较发酵模式研究-流加发酵最佳流加策略:初始甘油为30g/L,72-120h进行恒速流加,流加速率为0.11L/h(甘油浓度为400g/L)参数培养模式ABCD剩余甘油浓度（g/L）0.02±0.00发酵模式研究-10m3发酵罐放大试验丙酸10m3罐中试发酵过程曲线—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA丙酸最高产量为47.28g/L,生产强度为0.197g·L-1h-1全球第二家采用发酵法生产丙酸发酵模式研究-10m3发酵罐放大试验丙酸10m3罐中试发三.中国有机酸发酵研究进展－α-酮戊二酸三.中国有机酸发酵研究进展－α-酮戊二酸

-酮戊二酸的应用降低病患机体损耗清除自由基,延缓衰老提高繁殖率,促进骨骼的生长有机中间体体格增强剂、运动饮料添加剂医药化妆品食品化工饲料-酮戊二酸的应用降低病患机体损耗清除自由基,延缓衰老提高

-酮戊二酸市场概况国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量约为1万吨

名称价格(RMB/Kg)纯度用途-酮戊二酸28098%医药、化工中间体L-精氨酸:-酮戊二酸钠盐(2:1)35099%运动饮料添加剂L-鸟氨酸:-酮戊二酸钠盐(1:1)65099%运动饮料添加剂-酮戊二酸市场概况国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量化学法发酵法筛选得到的菌种:解脂亚诺酵母

-酮戊二酸的生产方法生产效率低、环境非友好和有毒试剂使用,限制其在医药、保健品和食品等高附加值产品生产应用生产效率高环境友好食品安全性高化学法发酵法筛选得到的菌种:解脂亚诺酵母-酮戊二酸的生产食品安全级生物法生产-酮戊二酸土壤样品维生素B1缺陷型筛选500株微生物菌株0.1g/L13.4%0.1-1g/L74.4%1-10g/L6.4%10g/L5.8%菌落形态AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG18SrRNAYarrowialipolyticaWSH-Z06食品安全级生物法生产-酮戊二酸土壤样品维生素B1缺陷型筛选生物法生产-酮戊二酸的关键问题当以甘油为唯一碳源时,发酵6天后-KG产量可达30g/L左右,但是发酵液中同时会积累大量的副产物—丙酮酸(30g/L左右)。Y.lipolyticaWSH-Z06摇瓶发酵曲线-KG(■),Glycerol(●),Pyruvate(▲),DCW(▼)

存在的问题生物法生产-酮戊二酸的关键问题当以甘油为唯一碳源时,发酵61.辅因子调控3.节流2.开源4.调控转运蛋白解决方案——代谢工程改造解脂亚洛酵母1.辅因子调控3.节流2.开源4.调控转运蛋白解决方案——代代谢工程改造解脂亚洛酵母1.辅因子调控代谢工程改造解脂亚洛酵母1.辅因子调控调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累CONACS1/ACLCONACS1ACL过量表达ACS1基因使胞内ACS比酶活达到0.92U/mgprotein,过量表达ACL基因使胞内ACL酶活达到了1.51U/mgprotein,比对照分别提高了10.5和11.6倍,胞内乙酰辅酶A含量分别是对照的231.2%和244.2%。调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累CONACS1/调控乙酰辅酶A