蛋白质的构件氨基酸

关于蛋白质的构件氨基酸第1页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六第2页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六第3页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。引言第4页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六本节学习重点与目标掌握α-氨基酸的一般结构掌握20种氨基酸的分类掌握氨基酸两性特点掌握氨基酸所参与的化学反应（显色反应）掌握氨基酸分离的方法和原理难点难点第5页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六一、蛋白质的化学组成和分类1.元素组成

蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。碳和氮元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳：50%;氮：16%。2.蛋白质的估算平均含氮量约为16%，所以，可以根据样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量=蛋白氮×6.253.氨基酸组成

蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子第6页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六4.蛋白质的分类1）按组成：简单蛋白质（表2－1）：缀合蛋白质（表2－1）：（注意辅基的组成）2）按生物学功能分：酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白等。3）按形状和溶解度：纤维状蛋白质：不溶于水,结构作用。如胶原蛋白，角蛋白等。球状蛋白质：易溶于水，细胞中大多属可溶性蛋白。如酶、转运蛋白、抗体等。第7页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六酸水解：H2SO4或HCI能使蛋白质完全水解；不引起消旋作用，但色氨酸完全被破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基；碱水解：NaOH能使蛋白质完全水解；色氨酸稳定，但大多数氨基酸遭破坏并引起消旋现象；酶水解：部分水解；不产生消旋，不破坏氨基酸；主要用于蛋白质一级结构分析，如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。二、蛋白质的水解

第8页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六①胰蛋白酶Lys——XArg——X②胰凝乳蛋白酶

Tyr——XTrp——XPhe——X③胃蛋白酶

Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)④Glu蛋白酶Glu——X（V8蛋白酶）④Arg蛋白酶Arg——X第9页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六有一个七肽经分析其氨基酸组成为Lys,Pro,Arg,Phe,Ala,Tyr和Ser。此肽DNFB不反应。用胰凝乳蛋白酶降解得到两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala,Tyr,Ser和Pro,Phe,Lys,Arg，这两个肽段与DNFB反应，分别生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶作用，同样生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别为Arg,Pro和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala。试推测此多肽的结构和氨基酸的顺序并说明推测理由。

习题第10页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六三、氨基酸的一般结构

结构通式：与羧基相连的Cα上都有一个氨基，氢原子和可变的R基。如图aa结构通式：除Gly外

,Cα是不对称C：1.具有两种立体异构体[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]第11页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六非极性中性疏水氨基酸极性中性氨亲水基酸酸性氨基酸碱性氨基酸四、氨基酸的分类*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:第12页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六1.

中性非极性氨基酸（7种）：

侧链为脂肪族或芳香族，无极性基团或仅极弱极性的基团，高度疏水。第13页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六2.

中性极性氨基酸（8种）：侧链有极性，但不解离（即不带电荷），或仅极弱的解离，有亲水性。 第14页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六3.酸性氨基酸（2种）：天冬氨酸、谷氨酸侧链有能解离的极性基团（-C00H），在中性溶液时显酸性，亲水性强。第15页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六4.碱性氨基酸（3种）：赖氨酸、精氨酸、组氨酸侧链有极性基团，且解离，在中性溶液中显碱性，亲水性强。赖氨酸：侧链有-NH2基。精氨酸：侧链有胍基。组氨酸：侧链有咪唑基。

第16页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六

另外，根据氨基酸的结构,氨基酸可分为脂肪族氨基酸,芳香族氨基酸和杂环氨基酸:

脂肪族氨基酸:

一氨基一羧基氨基酸:GlyAlaVal*Leu*Ile*

一氨基二羧基氨基酸:AspGluAsnGln

二氨基一羧基氨基酸:Lys*Arg

含硫氨基酸:CysMet*

含羟基氨基酸:SerThr*芳香氨基酸:TyrPhe*杂环氨基酸:HisProTrp*

第17页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（二）不常见的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸，这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。第18页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六第19页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（三）非蛋白质氨基酸不组成蛋白质，但有生理功能。（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。第20页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（一）氨基酸的解离氨基酸在晶体和水溶液中主要以两性离子形式存在，极少数为中性分子。氨基酸在两性离子时，氨基是以质子化(－NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(－COO-)存在。两性离子既有酸的作用，又有碱的作用。五、氨基酸的酸碱性质第21页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（二）氨基酸的等电点氨基酸分子的整体带电性质与溶液的pH有关，改变溶液pH可以使氨基酸带上正电荷，负电荷或者正好处于净电荷为零的兼性离子状态。

等电点：当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态，少数离解成数目相等的阴、阳离子。pH=pI时，氨基酸净电荷为零；pH>pI时，两性离子释放质子，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动；pH<pI时，两性离子质子化，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动。

第22页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六氨基酸的分步解离阳离子两性离子阴离子

正电荷负电荷PH>PIPH<PIPH>PI等电点（PI)正电荷负电荷第23页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六氨基酸的等电点可依其分子中氨基、羧基和R基的解离常数（pKa）值求出。第24页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六氨基酸等电点的计算公式可分为下列情况：1.非极性R基氨基酸和不带电荷的极性R基氨基酸（半胱氨酸除外）：pI=(pKa1+pKa2)/2

2.带负电荷的极性R基的氨基酸（酸性氨基酸）：pI=(pKa1+pKR-COO-

)/2半胱氨酸（Cys)不属酸性氨基酸，但其—SH具有弱酸性，在PH7.0时，Cys的—SH部分解离，故其PI按酸性氨基酸计算。

3.带正电荷的极性R基的氨基酸（碱性氨基酸）：pI=(pKa2+pKR-NH2)/2第25页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六例如：Glu的pKa1＝2.19，pKa2＝9.67，pKR＝4.25，计算其等电点?解：根据等电点的定义，近似求出pI=（pKa1+pKR)/2=(2.19+4.25)/2=3.22第26页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六六、氨基酸的化学性质1、ɑ-氨基参与的反应（1）与甲醛发生羟甲基反应氨基酸的氨基被羟甲基化后，碱性下降，可用酚酞作为滴定的指示剂，来测定氨基酸的浓度。第27页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（2）与亚硝酸反应RCHCOOHNH3+HNO2RCHCOOHOH+N2+H2O产生的氮气一半来自氨基酸，另一半来自亚硝酸，可测定氮气的体积计算氨基酸的量（VanSlyke法）第28页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（3）酰化反应R1-C-X+H2N-CHCOO-OR2OH-R1-C-HN-CH-COO-OR2X=Cl,OCOR氨基酸酰化产物R1-C-OH+H2N-CH-COO-OR2DCCR1-C-HN-CH-COO-OR2第29页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（4）烃基化反应亲核第30页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六②与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应第31页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六第32页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（5）生成西佛碱的反应E-NH2+O=CCH2OPO32-CH2OH+H+E-N=C+HCH2OPO32-CH2OH+H2O酶活性中心磷酸二羟丙酮质子化西佛碱第33页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（6）脱氨基和转氨基反应R-CH-COO-NH3+R-C-COO-O+NH4+-OOCCH2CH2-CH-COO-+CH3-C-COO-NH3+O-OOCCH2CH2-C-COO-O+CH3-CH-COO-NH3+氧化酶谷丙转氨酶α-酮酸谷氨酸丙酮酸第34页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六2、α-羧基参与的反应（1）成盐反应R—CH—COOH+NaOHNH2R—CH—COONa+H2ONH2（2）成酯反应R—CH—COOH+C2H5OHNH2HCl气R—CH—COOC2H5NH2.HCl当羧基变成乙酯后，羧基的化学性质就被掩蔽了，而氨基的化学性质就突出地显示出来。第35页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（3）形成酰卤的反应Y—NH—CRH—COOH+PCl5Y—NH—CRH—COCl酰化氨基酸酰化氨基酰氯使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的工作上常用。Y:保护基，可为酰基

（4）叠氮反应H2N-CHR-COOHYHN-CHR-COOHYHN-CHR-COOCH3酰化氨基酸酰化氨基酸甲酯NH2NH2（-CH3OHYHN—CHR—CO—NH—NH2酰化氨基酸的肼衍生物氨基酸的叠氮衍生物常作为多肽合成的活性中间体第36页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（5）脱羧反应

H2N—CHR—COOH脱羧酶CO2+RCH2NH2胺GABA是一种抑制性神经传导物质,缺乏容易导致紧张焦虑,易发于高压人群中!第37页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六3、α-氨基和羧基共同参与的反应（1）茚三酮反应:氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm。该反应可作为蛋白质定性、定量分析的基础。第38页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（2）成肽反应+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键第39页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六4、侧链基团的化学性质（1）巯基的性质A、弱酸性B、与卤代烃发生反应，生成烃基衍生物C、络合反应D、形成二硫键E、与DTNB反应F、被氧化成磺基丙氨酸第40页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六-OOC-CH-CH2-SH-NH3+C6H5CH2OCOClC6H5CH2ClICH2CONH2-OOC-CH-CH2-S-COOCH2C6H5NH3+-OOC-CH-CH2-S-CH2C6H5+HClNH3+-OOC-CH-CH2-S-CH2CONH2NH3+与卤代烃反应,生成稳定的烃基衍生物第41页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六氧化还原反应络合反应COO-Hg+HO-CysCH2SHCysCH2SCOO-Hg+第42页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六与DTNB(硝基苯甲酸二硫化合物)反应H3+NCHCH2S-+COO-SSCO2HNO2CO2HNO2H3+NCHCH2S-SCOO-CO2HNO2+NO2COO-HS其反应物在412nm波长处有强烈吸收,应用该反应可以用比色法测定半胱氨酸的含量.第43页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六被过氧甲酸氧化成磺基丙氨酸H3+NCHCH2SHCOO-HCO3HH3+NCHCH2SO3HCOO-磺基丙氨酸-OOC-CHCH2-S-S-CH2CHCOO-Cys

半胱氨酸二硫键HCO3HH3+NCHCH2SO3HCOO-磺基丙氨酸2第44页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（2）羟基的性质---N-CH-C--------HOCH2OPO32-丝氨酸磷酸酯第45页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（3）咪唑基的性质镍离子NHN咪唑环第46页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六NN咪唑环CH2-CH-COO-PO32-NH3+磷酸组氨酸HNNECH2+O2NSOOOCH3HN咪唑环N+ECH2CH3+O2NSO3-对硝基苯磺酸甲酯组氨酸残基(酶活性中心)第47页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（4）甲硫基的性质H2NCH(CH2)2SCH3+COO-14CH3I弱碱H2NCH(CH2)2SCOO-14CH3巯基试剂CH3H2NCH(CH2)2SCH3+COO-H2NCH(CH2)2S14CH3COO-第48页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（5）芳香环的性质本部分主要做了解掌握.明确三种氨基酸,苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸三种氨基酸中含有芳香环。第49页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六七、氨基酸的旋光性和光谱性质（一）氨基酸的旋光性和立体化学1.氨基酸的构型氨基酸构型：L型、D型。第50页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六除了苏、异亮有四种光学异构体,甘氨酸只为L型外，其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型。第51页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。L-苏和D-苏组成消旋物；L-别-苏和D-别-苏组成消旋物。第52页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六2.氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的pH值有关。比旋是α－氨基酸的物理常数之一，蛋白质中L型氨基酸的比旋光度见表2-3。Gly无手性C，无旋光性;

H2N—Cα—HCOOHH第53页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（二)氨基酸的光谱性质氨基酸的光吸收性20种基本氨基酸在可见光区都没有光吸收，在红外区和远紫外区有光吸收。在近紫外区（200-400nm）只有芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键）有光吸收。λ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103

蛋白质在280nm有最大紫外吸收光吸收，分光光度法鉴定。核磁共振（NMR）：在aa和Pro化学表征方面起重要作用。第54页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六蛋白质因含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般在280nm波长处有最大光吸收，因此能利用紫外吸收法鉴定并测定样品中蛋白质的含量。第55页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六紫外分光光度计的原理及应用分光光度计的构造

无论哪一类分光光度计都配有下列组成部分：光源、单色光器、比色皿、检测器系统以及各部分电源，其组成顺序如下:第56页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六7220型分光光度计外观及各部分名称及功能：

（正视图）（背视图）1.样品室门2.显示窗3.波长显示窗4.波长调节旋钮5.仪器电源开关

6.仪器操作键盘7.样品池拉手8.打印机输出接口9.电源插座7220型分光光度计示意图第57页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六仪器使用方法:1.使用前，应检查仪器各部件是否正常。

2.转动波长选择器（在波长显示窗上观察），选取所需波长。

3.打开仪器电源开关，方式选择指示灯应在透光率位置，选标样点应在第一点，预热10分种。

4.在样品池中，第一格放置空白杯，第二格放置挡光块，第三、四格放置待测样品杯。随手关好样品室门。

5.拉动样品室拉手，使空白杯处于光路中，按调100选择键，待显示100.0时，即表示已调好T=100％。

6.再拉动样品室拉手，使挡光块处于光路中，观察显示是否为零，如不为0.0，则按调零选择键使显示为0.0。

7.打开样品室门，取出挡光块，换入标准杯，关好样品窗口。

8.拉动样品室拉手，再使空白杯处于光路，按工作方式选择键为“测光密度”，此时显示应为0.000（如不为零再按一次调100选择键）。然后将其它比色杯送入光路，从显示窗口中读取相应的光密度值。

9.使用完毕，关好电源，关好样品室门，洗净比色杯并空干。第58页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六八、氨基酸混合物的分离和分析层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。第59页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。第60页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六（一）基于分配系数差异的分离方法—分配层析法

分配系数Kd=CACBCA：一种物质在A相（流动相）中的浓度

CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度原理：主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。固定相和流动相

混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况。第61页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六1、柱层析

层析柱中的填充剂或支持剂表面附着一层结合水作为固定相，沿固定相流过的与它互不相溶的溶剂是流动相。当用洗脱剂洗脱时，柱上端的氨基酸混合物在两相之间会按不同的分配系数以不同的速度向下移动。分部收集层析柱下端的洗脱液，然后分别用茚三酮显色定量，以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。加洗脱剂氨基酸样品支持剂层析柱分部收集1.00.50.1光吸收值

20406080100120流出液（毫升）第62页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六2、纸层析

固定相：滤纸纤维素上吸附的水流动相：展层用的溶剂层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。基本步骤：点样、展层、显色、定性（定量）层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容器中，用一种溶剂系统进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1～２cm时（约要40分钟），取出滤纸，作好前沿位置标记后，烘干滤纸（1分钟）。向滤纸上喷茚三酮显色液至显色，就会在滤纸上出现各种氨基酸的斑点。丁醇-醋酸氨基酸的滤纸层析图谱第63页，共72页，2022年，5月20日，7点49分，星期六

由于各种氨基酸具有不同的迁移率（Rf），因此它们就会彼此分开。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的成分。溶剂前沿氨基酸显色点滤纸原点