免疫共沉淀技术正规版资料

免疫(miǎnyì)共沉淀技术第一页，共16页。定义及原理操作(cāozuò)流程优点和不足注意事项应用及实例展望第二页，共16页。定义(dìngyì)及原理免疫共沉淀定义免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP)也称免疫共吸附或免疫下拉技术，能够从细胞裂解物中特异性的分离(fēnlí)并富集目标蛋白。

CO-IP是通过抗原抗体之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法。也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。第三页，共16页。基本原理在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合(jiéhé)的偶联于sepharosebeads上的proteinA/G,与细胞中的抗体结合(jiéhé)，形成一种复合物：目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗体-proteinA/G,经过变性凝胶电泳，复合物分开。最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。第四页，共16页。原理(yuánlǐ)流程示意图第五页，共16页。操作(cāozuò)流程免疫共沉淀实验流程(1)蛋白样品准备（如果为细胞样品需先裂解）(2)抗原抗体结合反应(3)ProteinA/G与抗原抗体复合物结合

(4)免疫复合物与proteinA/G解离（2%SDS煮沸处理(chǔlǐ)）(5)分析鉴定（WesternBlot或质谱分析）第六页，共16页。实验(shíyàn)流程如图所示第七页，共16页。优点(yōudiǎn)和不足优点1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物2.蛋白的相互作用是在自然(zìrán)状态下进行的，可以避免人为影响。缺点和局限性1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用第八页，共16页。应用(yìngyòng)及实例应用领域：免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS和MS质谱分析鉴定准备样品。应用范围:1.寻找(xúnzhǎo)新的相互作用蛋白2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用第九页，共16页。一、固定在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机(suíjī)切断为一定长度范围内的染色质小片段。难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用阳性对照：如组蛋白抗体(kàngtǐ)验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用定义(dìngyì)及原理(4)免疫复合物与proteinA/G解离原理(yuánlǐ)流程示意图P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症一半由于该基因突变失活它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达(biǎodá)的关系。最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。寻找(xúnzhǎo)新的相互作用蛋白定义(dìngyì)及原理CO-IP是通过抗原抗体之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法。实例(shílì)鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白的分离和鉴定(jiàndìng)P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症一半由于该基因突变失活1.抗P53抗体与HEN1和HEN2细胞总蛋白进行免疫共沉淀。分离免疫沉淀复合物3.切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱分析，得到相应肽列标签4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究第十页，共16页。操作(cāozuò)流程将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物定义(dìngyì)及原理蛋白的相互作用是在自然(zìrán)状态下进行的，可以避免人为影响。不能够确定第三种蛋白的桥联作用(1)蛋白样品准备（如果为细胞样品需先裂解）也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。染色质免疫沉淀(CHIP)CHIP原理(yuánlǐ)抗P53抗体与HEN1和HEN2细胞总蛋白进行免疫共沉淀。验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段操作(cāozuò)流程(4)免疫复合物与proteinA/G解离染色质免疫沉淀(CHIP)研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达(biǎodá)的关系。第十一页，共16页。CHIP原理(yuánlǐ)在活细胞状态下固定(gùdìng)蛋白质－DNA复合物将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段对目的片断的纯化与检测第十二页，共16页。操作步骤一、固定在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机(suíjī)切断为一定长度范围内的染色质小片段。二、免疫沉淀利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。三、纯化与检测经蛋白质与DNA解偶联，DNA片段纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.第十三页，共16页。注意事项超声波破碎条件的选择抗体(kàngtǐ)量的选择PCR反应条件的选择Input对照阳性对照：如组蛋白抗体(kàngtǐ)阴性对照：阴性引物条件(tiáojiàn)选择对照设置第十四页，共16页。基因表达: