细菌内毒素检测 2、《中国药典》 2015年版BET法

《中国药典》2015年版BET法湛江安度斯生物有限公司2016年6月实验助手APP授权发布1《中国药典》

2015年版BET法四部通则1143综述BET实验21.综述部分•

细菌内毒素检查法的定义及方法学分类•

细菌内毒素标准品和检查用水•

BET操作和器具的要求•

供试品溶液的制备•

内毒素限值的确定•

最大有效稀释倍数和最小有效稀释浓度的计算32.实验部分•

凝胶法•

光度测定法–

鲎试剂灵敏度复核试验–

干扰试验–

标准曲线的可靠性试验–

干扰试验–

检查法–

检查法•

凝胶限度试验•

凝胶半定量试验43.2015年版与2010年版ChPBET法主要不同点明确仲裁方法项目2010年2015年仲裁方法

以凝胶法结果为准以凝胶限度试验结果为准操作要求

应防止微生物和内毒

应防止内毒素的污染”；素的污染”

删除“微生物”。避免误解细菌内毒

用于标定、复核、仲

用途增加：干扰试验及检素国家标

裁鲎试剂灵敏度和标

查法中编号

B

和

C

溶液的准品用途

定细菌内毒素工作标

制备、凝胶法中鲎试剂灵准品的效价敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。5项目2010年2015年细菌内毒素

用于试验中的鲎试剂灵

用于干扰试验及检查法中工作标准品

敏度复核、干扰试验及

编号B和C溶液的制备、用途各种阳性对照

凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验供试品溶液

供试品溶液的pH值在

供试品溶液和鲎试剂混合pH值的要求

6.0～8.0的范围内后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内λc=antilg（∑X/n）；n

为每个浓度的平行管数λ

计算公式

λ

＝antilg（∑X

/4

)cc干扰试验方法：溶液C各平行4管

方法：溶液C各平行2管判断：0.5λ≤Es≤2λ；

判断：溶液C和溶液B的0.5Es≤Et≤2Es结果，符合鲎试剂灵敏度复核试验的要求。6项目2010年2015年凝胶半定量结果判断系列溶液A中每一系列平行

系列溶液A中每一系列的终点管的终点稀释倍数乘以λ，为

稀释倍数乘以λ，为每个系列每个系列的反应终点浓度，

的反应终点浓度，如果检验所有平行管反应终点浓度的

的是稀释过的供试品，则将几何平均值即为供试品溶液

终点浓度乘以供试品进行半的内毒素浓度〔按公式定量试验的初始稀释倍数，C

=antilg（∑X/2）〕。即得到每一系列的内毒素浓E若内毒素浓度小于规定的限

度C。值，判定供试品符合规定。

若每一系列内毒素浓度均小若内毒素浓度大于或等于规

于规定的限值，判定供试品定的限值，判定供试品不符

符合规定。每一系列内毒素合规定。浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度〔按公式C

=antilg（∑C/2）〕。若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值，则判定供试品不符合规定。E7项目2010年2015年凝胶限度

供试品溶液：稀释倍

供试品溶液：稀释倍数不试验数为MVD超过MVD结果判断：/增加：若供试品的稀释倍数小于

MVD

而溶液

A

出现不符合规定时，需将供试品稀释至

MVD

重新实验再对结果进行判断。动态浊度

是检测反应混合物的

是检测反应混合物的浊度法定义浊度到达某一预先设

到达某一预先设定的吸光定的吸光度所需要的

度或透光率所需要的反应反应时间，或是检测

时间，或是检测浊度增加浊度增加速度的方法。

速度的方法。8项目2010年2015年动态显色

动态显色法是检测反

动态显色法是检测反应混法定义应混合物的色度达到

合物的吸光度或透光率达某一预先设定的吸光

到某一预先设定的检测值度所需要的反应时间，

所需要的反应时间，或检或检测色度增长速度

测值增加速度的方法。的方法。光度法结

当阴性对照的反应时

阴性对照的吸光度或透光果判断

间大于标准曲线最低

率小于标准曲线最低点检浓度的反应时间测值或阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间；9供试品溶液pH值的要求2010年版2015年版•一般要求供试品溶液的pH值

•必要时，可调节被测溶液在6.0～8.0的范围内。对于过（或其稀释液）的pH值，一酸、过碱或本身有缓冲能力的

般供试品溶液和鲎试剂混合供试品，需调节被测溶液（或

后溶液的pH值在6.0～8.0的其稀释液）的pH值，可使用范围内为宜，可使用酸、碱酸、碱溶液或适宜的缓冲液调

溶液或适宜的缓冲液调节pH节pH值。值。10供试品溶液PH值的要求鲎试剂本身具有缓冲能力，可以将大部分供试品的pH值调节至6.0～8.0的范围内；对于供试品pH值的调节不是必须的；检测供试品溶液和鲎试剂1：1混合后溶液的pH值11凝胶法干扰试验结果判断方法2010年版只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C

的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。Es=antilg（∑Xs/4）；Et=antilg（∑Xt/4）式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）。当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。12凝胶法干扰试验结果判断方法2015年版只有当溶液A

和阴性对照溶液D

的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验的要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验的要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。13凝胶法干扰试验结果判断方法试验有效性的判断一致；判为无干扰的条件不同；2010年版：•

0.5λ≤Es≤2λ；0.5Es≤Et≤2Es；2015年版：•

系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验的要求；14最理想的无干扰状况，Et=Es。溶液C（Es）表a平行管数2λ＋＋＋＋λ½λ－－－－¼λ－－－－1234＋＋＋＋溶液B（Et）平行管数SE2λ＋SEλ＋＋＋＋SE½λ－SE¼λ－1234＋＋＋－－－－－－15不符合2010年版要求，但符合2015年版要求表b溶液C（Es）平行2010年：管数2λ＋＋＋＋λ½λ＋＋＋＋¼λ－Es=½λ;1234＋＋＋＋Es=

λ,½

¼－

2Es=λ;－

Et=2λ，存在－

干扰作用！溶液B（Et）平行管数

SE2λ2015年：SEλ－－－－SE½λSE¼λ－λB=2λ，无干扰作用！但实际可能存在抑制干扰作用。1234＋＋＋＋－－－－－－－16不符合2010年版要求，但符合2015年版要求溶液C（Es）表c平行管数2010年：Es=2λ;2λ＋＋＋＋λ----½λ¼λ－－－－1234----½Es=λ,2Es=4λ;Et=½λ，存在干扰作用！溶液B（Et）平行管数

SE2λ2015年：SEλSE½λ

SE¼λλB=½λ，无干扰作用！但实际可能存在增强干扰作用。1234＋＋＋＋++++++++－－－－172010年版无法判断，不符合2015年版要求溶液C（Es）表d2010年：平行管数2λ＋＋＋＋λ½λ＋¼λ

Es=

λ;½1234＋＋＋＋－－－Es=

λ,½

¼2Es=λ;＋Et≤0.42λ，无－

法判断！＋＋溶液B（Et）平行2015年：λB≤0.42λ，存在干扰作用！管数

SE2λSEλ＋＋＋＋SE½λSE¼λ＋1234＋＋＋＋＋＋＋＋－－－18凝胶法干扰试验结果判断方法2010年版的判断方法存在：干扰无干扰无法判断2015年版，避免了无法判断的情况，但是可能存在误判的情况！需要谨慎对待判断结果，出现表b和表c的结果应调整试验条件，重新试验。19凝胶半定量试验结果判断方法2010年版系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度〔按公式CE=antilg（∑X/2）〕。若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不符合规定。20结果判断方法2015年版系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，如果检验的是稀释过的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到每一系列的内毒素浓度C。若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定。每一系列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度〔按公式C

=antilgE（∑

/2）〕。C若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值，则判定供试品不符合规定。21结果判断方法•

2010年版：将溶液A中的两个平行管反应终点浓度的几何平均值与限值进行比较，几何平均值大于限值则判定为不符合规定。•

2015年版：

将溶液A中的两个平行管反应终点浓度分别与限值比较，当两个平行结果中有任何大于限值时判定为不符合规定。22结果判断方法主要区别1/8MVD

1/4MVD

1/2MV

MV供试品反应终点浓度DD+++

+

≥L+

-

1/2L结果++2010年版：CE≥0.707L，无法判断！2015年版：其中有一管≥L，不符合规定。23重要！北京

7月

14日-17日

苏州

7月

21日-24日特邀药检系统老师、柴海毅老师主讲新版药典微生物检验合规性标准实验室实际操作技术学习，老师演示，每位学员亲自动手操作，老师现场指导。理论讲解与实际操作相结合，为保证实操学习效果，严格限制

40人，按报名顺序额满为准。实际操作助教与实验耗材由北京中检院三药科技开发公司支持与提供。另外：天津

8月

04日-06日

制药企业

QC实验室精益管理与数据完整性保障学习班；贵阳

7月

28日-30日

2015版《中国药典》微生物检测合规性、洁净区环境监测与微生物菌种管理；以下为微生物实操学习班主要课题内容。有意了解详情请联系：郭阳

微生物基础知识：微生物基础、微生物理念；2、

菌种管理技术：微生物的接种技术、菌种传代、菌种保藏；3、

菌种鉴定技术：革兰氏染色、细菌的生化反应。实际操作（分组）：a)

13:30-13:40微生物实验注意事项；b)

13:40-14:40显微镜检：第一天主讲①

革兰氏染色镜检；省市级药品检验所下午13:3016:30②

酵母菌镜检（用于区分酵母与细菌）c)

14:40-15:40

微生物接种技术：①

斜面接种（低层斜面

TSA；高层斜面

TSI）；②

平板接种（分别划线接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌于相应鉴别平板）d)

15:40-16:30定量试验（取定量微球逐级稀释并完成计数试验）。理论讲解上午09:0012:00