生化-第01章蛋白质结构与功能

蛋白质的结构与功能第一章Structure

andFunction

ofProtein教学目的在学习生物化学的研究内容、了解生物化学发展史的基础上，使学生理解生物化学与卫生相关学科的关系。在掌握蛋白质分子组成和分子结构的基础上，学习蛋白质结构与功能的关系及蛋白质的理化性质。教学要求掌握蛋白质的分子组成及其重要的理化性质。熟悉氨基酸的分类及其两性解离的性质；α-螺旋的特点、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。了解生物化学的定义、生物化学的研究对象。卫生相关学科的关系，了解生了解生物化学与物化学的发展史。了解蛋白质在生命活动过程中的重要性，蛋白质分子结构与功能的关系。教学内容生物化学的定义，生物化学的发展简史。生物化学研究的主要内容，生物化学与医学的关系。蛋白质在生命活动过程中的重要性。蛋白质的元素组成。蛋白质的分子组成。组成蛋白质分子的基本单位——氨基酸，氨基酸的结构，氨基酸的分类，氨基酸两性解离和等电点及其它理化性质。教学内容6．蛋白质分子结构肽键、肽键平面。谷胱甘肽及活性多肽。蛋白质的一级结构，蛋白质二级结构的主要形式α-螺旋及特点、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，超二级结构——模序，结构域，蛋白质的三级结构和四级结构，维持蛋白质空间结构的次级键。蛋白质结构与功能的关系，肌红蛋白和血红蛋白分子结构，别构效应。蛋白质的理化性质蛋白质的两性电离性质和等电点，蛋白质的胶体性质，蛋白质的变性作用。蛋白质的沉淀作用及常用的沉淀剂。蛋白质常见的呈色反应。9．蛋白质的分类，蛋白质的分离、纯化，多肽链中氨基酸序列分析及蛋白质空间结构的测定（

）。一、蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。作为生物催化剂（酶）代谢调节作用免疫保护作用物质的转运和运动与支持作用参与细胞间信息传递3.氧化供能2.蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质的分子组成The

Molecular

Component

of

Protein第一节组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g

%)=

每克样品含氮克数×6.25×1001/16%一、氨基酸——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成

蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。CHRH3丙甘氨氨酸酸L-氨基酸的通式C+NH3COO-H非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸*

20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:二、氨基酸的分类甘氨酸

glycineGly

G5.97丙氨酸

alanine

Ala

A6.00缬氨酸

valine

Val

V5.96亮氨酸

leucine

Leu

L

5.98异亮氨酸

isoleucine

Ile

I

6.02苯丙氨酸

phenylalanine

Phe

F

5.48脯氨酸

proline

Pro

P

6.301.

非极性疏水性氨基酸色氨酸

tryptophanTry

W5.89丝氨酸

serineSer

S5.68酪氨酸

tyrosine

Try

Y5.66半胱氨酸

cysteine

Cys

C

5.07蛋氨酸

methionine

Met

M

5.74天冬酰胺

asparagine

Asn

N

5.41谷氨酰胺glutamine

Gln

Q5.65苏氨酸

threonineThr

T5.602.

极性中性氨基酸天冬氨酸aspartic

acidAsp

D2.97谷氨酸

glutamic

acid

Glu

E3.22赖氨酸lysineLys

K9.74精氨酸

arginineArg

R10.76组氨酸

histidineHis

H7.593.酸性氨基酸4.

碱性氨基酸几种特殊氨基酸脯氨酸（亚氨基酸）CH2CHCOO-CH2NH2+CH2-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3半胱氨酸胱氨酸二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3+

HS-CH2-CH-COO-+NH3三、氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。等电点(isoelectric

point,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。pH=pI氨基酸的兼性离子pH>pI+H++H+pH<pI阳离子阴离子R

CH

COOHNH2NH3+R

CH

COO-

+OH-R CH

COO-NH2R

CH COOH

+OH-NH3+2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280

nm附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液

280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收3.茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。四、肽（一）肽(peptide)*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。ONH2-CH-CH

OH甘氨酸OHONH-CH-CH

H甘氨酸+-HOHNH2-CH-C-N-CH-COH

H

H

OH甘氨酰甘氨酸肽键O*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。氨基的一端N

末端：多肽链中有C

末端：多肽链中有羧基的一端多肽链有两端*

多肽链(polypeptide

chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端C末端牛核糖核酸酶（二）几种生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,

GSH)2GSHGSH过氧化物酶H2O22H2OGSSGGSH还原酶NADPH+H+NADP+体内许多激素属寡肽或多肽2.多肽类激素及神经肽蛋白质的分子结构The

Molecular

Structure

of

Protein第二节蛋白质的分子结构包括一级结构(primary

structure)二级结构(secondary

structure)三级结构(tertiary

structure)四级结构(quaternary

structure)高级结构一、蛋白质的一级结构定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构定义蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。主要的化学键：氢键（一）肽单元参与肽键的6个原子C1

、

C、O、N、H、C2位于同一平面，C1

和C2

在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元(peptide

unit)

。蛋白质二级结构的主要形式-螺旋(

-helix)-折叠(-pleated

sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random

coil)（二）

-螺旋（三）-折叠（四）-转角和无规卷曲-转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。（五）模体在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。三、蛋白质的三级结构（一）定义整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三

的排布位置。主要的化学键疏水键、离子键、氢键和Van

der

Waals力等。肌红蛋白(Mb)N

端C端纤连蛋白分子的结构域（二）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域( )

。NSH3SH2蛋白激酶C可被磷酸化酪氨酸残基细胞癌

src的表达产物Src结构展开图此蛋白是典型的非受体型酪氨酸蛋白激酶，含三个结构域：SH2、SH3和蛋白激酶。其C端含一个可被磷酸化的酪氨酸残基。SH2和SH3可分别识别蛋白质的相关结构，并与之相结合。蛋白激酶结构域具有蛋白激酶活性（见第十九章

细胞信号转导）。（三）分子伴侣分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的发生，使肽链正确折叠。分子伴侣也可与错误的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。亚基之间的结合要是氢键和离子键，疏水作用。四、蛋白质的四级结构血红蛋白的四级结构五、蛋白质的分类根据蛋白质组成成分单纯蛋白质结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分根据蛋白质形状纤维状蛋白质球状蛋白质蛋白质结构与功能的关系The

Relation

of

Structure

and

Functionof

Protein第三节（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键天然状态，有催化活性尿素、

β-巯基乙醇去除尿素、

β-巯基乙醇非折叠状态，无活性（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血HbA

β

肽链N-val

·his

·leu

·thr

·pro

·

glu

·glu

·····C(146)HbS

β

肽链N-val

·his

·leu

·thr

·pro

·

val·glu

·····C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构二、蛋白质空间结构与功能的关系Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线*

协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive

cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative

cooperativity)变构效应(allosteric

effect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。蛋白质空间构象改变可引起疾病阿尔茨海默病（Alzeimer，s

disease）帕金森病（Parkinson，s

disease）疯牛病第四节蛋白质的理化性质与分离纯化The

Physical

and

Chemical

Charactersand

Separation

and

Purification

ofProtein（一）蛋白质的两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*

蛋白质的等电点(isoelectric

point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。一、理化性质（二）蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1

万至100

万之巨，其分子的直径可达1

～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜++++++

+带正电荷的蛋白质———－－———带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+

+++

+

+++带正电荷的蛋白质—－

－——－－

－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固*

蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。变性的本质——

破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。造成变性的因素如加热、乙醇等 、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等

。应用举例临床医学上，变性因素常被应用来

及灭菌。此外,

防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如 等）的必要条件。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。天然状态，有催化活性尿素、

β-巯基乙醇去除尿素、

β-巯基乙醇非折叠状态，无活性蛋白质沉淀蛋白质从溶液中析出现象。1、盐析：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。2、 沉淀蛋白质：乙醇、

等3、重金属盐沉淀蛋白质：Pb2+、Hg2+、Ag+4、生物碱试剂沉淀蛋白质：鞣酸、、钨酸、三氯醋酸（四）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（五）蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrin

reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuret

reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。二、蛋白质的分离和纯化蛋白质的理化性质与常用的纯化方法蛋白质的理化性质

常用的纯化方法分子质量

离心凝胶过滤

透析、超滤电荷离子交换层析电泳等电聚焦溶解度调整pH调整离子强度降低介电常数特异结合部位亲和层析亲和洗脱其他性质吸附层析液相层析气相层析二、蛋白质的提取与纯化原理（一）改变蛋白质的溶解度盐析：高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉淀：降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间相互吸引而沉淀（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法离心(centrifugation)：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质进行分离根据转速分类：常用离心机<10

000rpm高速离心机20

000~25

000

rpm超速离心机>50000

rpm相对离心力（×g）=1.119×10–5

×（rpm）2×r

[g:gravity,rpm:

revolution

per

minut,r:离心半径]根据应用分类：分析型离心机型离心机透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。超滤（ultrafiltration）:磁力搅拌器待超滤的蛋白质溶液在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。加压的氮气超滤膜凝胶过滤（gel

filtration）：凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向动的路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒，通过胶粒间的空隙向动，其流动的路径短，移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分分开的目的洗脱液胶粒样品小分子大分子蛋白浓度洗脱体积试管走行方向各试管进行连续收集凝胶过滤分离蛋白质示意图凝胶过滤洗脱洗脱洗脱样品凝胶颗粒大分子先洗脱下来小分子后洗脱下来凝胶过滤分离蛋白质示意图根据各种蛋白质在一定的pH环境下所带电荷种类与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。常用的方法有：离子交换层析电泳等电聚焦。（三）根据蛋白质电荷性质的分离方法低盐浓度洗脱液高盐浓度洗脱液混合蛋白质离子交换层析柱

++

++++++++++++

++各试管进行连续收集离子交换层析分离蛋白质示意图试管走行方向离子交换层析(ion

exchangechromatography