N(as)实时荧光定量PCR课件

实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR1Outline实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理实时荧光定量PCR在临床和科研上的应用实时荧光定量PCR实验实例Outline实时荧光定量PCR基本原理2实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR基本原理3常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析MJResearch常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量4常规vs实时优缺点比较优势来自：实验数据及定量分析方法荧光实时监测产物浓度实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分析每一次循环产物凝胶电泳分析终产物精确计算初始模板浓度，灵敏度高，检测单拷贝模板通过终产物定性分析模板浓度计算机自动纪录分析检测方法费时费力常规vs实时优缺点比较实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分5实验数据指数扩增期实时荧光PCR荧光曲线图循环数，荧光值指数扩增期数学规律非指数扩增期扩增产物荧光曲线背景期实验数据指数扩增期实时荧光PCR荧光曲线图非指数扩增期扩增产6PCR的数学知识理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXnn：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率PCR的数学知识理想的PCR反应：n：扩增反应的循环次数7阈值与C(t)值阈值(Xn)：荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准（PCR扩增产物量的标准）C(t)值(n)：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04阈值与C(t)值阈值(Xn)：荧光扩增曲线指数增长期设定一个8PCR的数学知识理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： logX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率PCR的数学知识理想的PCR反应：n：扩增反应的循环次数9C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复910荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标11定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值12荧光化学监测荧光化学物质反应产物浓度荧光监测方法分类非特异性SYBRGreenI特异性MolecularBeaconTaqMan荧光化学监测荧光化学物质反应产物浓度13SYBRGreenI结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计无序列特异性，可用于不同模板便宜，灵敏缺点与非特异性产物结合，干扰实验结果SYBRGreenI结合双链DNA分子小沟14MolecularBeacon颈环结构，与特异产物配对荧光素，淬灭剂FRET（荧光谐振能量传递）优点对目标序列有很高的特异性低背景缺点设计复杂只能用于一个特定目标价格较高MolecularBeacon颈环结构，与特异产物配对15TaqMan水解型荧光素，淬灭剂FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点对目标序列特异性高设计相对MolecularBeacon简单缺点只适用于一个目标价格较高探针5‘端不能是G（切下后淬灭）TaqMan水解型16荧光化学监测方式总结化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应用范围SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中否延伸熔解曲线分析定量和检测目标基因MolecularBeacon发夹型杂交探针有复性SNP分析定量和检测目标基因TaqMan水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤SNP分析定量和检测目标基因荧光化学监测方式总结化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应17小结实时荧光定量PCR各种荧光监测方法的原理实时荧光数据结果的初步分析C(t)值线性关系小结实时荧光定量PCR18实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量19绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷贝数转基因的拷贝数相对定量：计算初始反应模板的相对含量差异表达分析芯片评估转基因生物的检测基因型检测绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（D20实时荧光PCR绝对定量方法标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值unknown104103实时荧光PCR绝对定量方法标准品，标准曲线unknown1021SYBRGreenI方法SYBRGreenI方法22反应体系的建立按照常规PCR方法配制反应体系，并加入SYBR染料程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.Goto2repeat397.72c5min8.4cforever9.End问题：PCR的不特异性产物；SYBRGreenI的非特异结合解决：熔链曲线分析，决定读板温度Meltingcurveanalysis反应体系的建立按照常规PCR方法配制反应体系，并加入SYBR23熔链曲线分析逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度-dIdTTm熔链曲线分析逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系24熔链曲线分析决定读板温度Non-specificproductspecificproductspecificproduct熔链曲线分析决定读板温度Non-specificprodu25优化的程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.85c1sec7.ReadPlate8.Goto2repeat399.72c5min10.Meltingcurveanalysis11.End优化的程序1.95c5min26使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势敏感性高检测低拷贝数样品：单拷贝区分小差异样品：24，48，96，……大范围拷贝数样品同时检测100—1010省时有效使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势敏感性高27实时荧光相对定量相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题解决样品材料不均一造成的差别解决加样过程中的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小对目的基因进行均一化：目的基因拷贝／每一个内标基因拷贝实时荧光相对定量相对定量的目的28实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR29Outline实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理实时荧光定量PCR在临床和科研上的应用实时荧光定量PCR实验实例Outline实时荧光定量PCR基本原理30实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR基本原理31常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析MJResearch常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量32常规vs实时优缺点比较优势来自：实验数据及定量分析方法荧光实时监测产物浓度实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分析每一次循环产物凝胶电泳分析终产物精确计算初始模板浓度，灵敏度高，检测单拷贝模板通过终产物定性分析模板浓度计算机自动纪录分析检测方法费时费力常规vs实时优缺点比较实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分33实验数据指数扩增期实时荧光PCR荧光曲线图循环数，荧光值指数扩增期数学规律非指数扩增期扩增产物荧光曲线背景期实验数据指数扩增期实时荧光PCR荧光曲线图非指数扩增期扩增产34PCR的数学知识理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXnn：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率PCR的数学知识理想的PCR反应：n：扩增反应的循环次数35阈值与C(t)值阈值(Xn)：荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准（PCR扩增产物量的标准）C(t)值(n)：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04阈值与C(t)值阈值(Xn)：荧光扩增曲线指数增长期设定一个36PCR的数学知识理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： logX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率PCR的数学知识理想的PCR反应：n：扩增反应的循环次数37C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复938荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标39定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值40荧光化学监测荧光化学物质反应产物浓度荧光监测方法分类非特异性SYBRGreenI特异性MolecularBeaconTaqMan荧光化学监测荧光化学物质反应产物浓度41SYBRGreenI结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计无序列特异性，可用于不同模板便宜，灵敏缺点与非特异性产物结合，干扰实验结果SYBRGreenI结合双链DNA分子小沟42MolecularBeacon颈环结构，与特异产物配对荧光素，淬灭剂FRET（荧光谐振能量传递）优点对目标序列有很高的特异性低背景缺点设计复杂只能用于一个特定目标价格较高MolecularBeacon颈环结构，与特异产物配对43TaqMan水解型荧光素，淬灭剂FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点对目标序列特异性高设计相对MolecularBeacon简单缺点只适用于一个目标价格较高探针5‘端不能是G（切下后淬灭）TaqMan水解型44荧光化学监测方式总结化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应用范围SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中否延伸熔解曲线分析定量和检测目标基因MolecularBeacon发夹型杂交探针有复性SNP分析定量和检测目标基因TaqMan水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤SNP分析定量和检测目标基因荧光化学监测方式总结化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应45小结实时荧光定量PCR各种荧光监测方法的原理实时荧光数据结果的初步分析C(t)值线性关系小结实时荧光定量PCR46实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量47绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷贝数转基因的拷贝数相对定量：计算初始反应模板的相对含量差异表达分析芯片评估转基因生物的检测基因型检测绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（D48实时荧光PCR绝对定量方法标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值unknown104103实时荧光PCR绝对定量方法标准品，标准曲线unknown1049SYBRGreenI方法SYBRGreenI方法50反应体系的建立按照常规PCR方法配制反应体系，并加入SYBR染料程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.Goto2repeat397.72c5min8.4cforever9.End问题：PCR的不特异性产物；SYBRGree