免疫组织化学解析课件

免疫组织化学报告人：傅琦博指导老师：胡翊群傅琦博F0318102免疫组织化学报告人：傅琦博傅琦博F0318102何谓免疫组化免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。傅琦博F0318102何谓免疫组化免疫组织化学是指在组织细胞原位通过免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化标记物与抗体集合形成标记抗体标本的处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜下观察结果傅琦博F0318102免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异3组织抗原抗体标记物

标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标傅琦博F0318102组织抗原抗体标记物标记抗体1荧光傅琦博F0318104组织抗原免疫细胞化学反应原理：＋标记抗体标记的抗原抗体复合物傅琦博F0318102组织抗原免疫细胞化学反应原理：＋标记抗体标记的抗原抗体复合5间接法直接法

两种免疫细胞化学反应方法傅琦博F0318102间接法直接法两种免疫细胞化学反应方法傅琦博F03186标本的处理标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞标本的固定与保存酶消化处理

组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。傅琦博F0318102标本的处理标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细7标本的固定与保存

固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。好的固定剂：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应傅琦博F0318102标本的固定与保存固定的目的：是细胞内蛋白质凝固8标本的固定与保存抗原固定剂固定温度与时间蛋白质95％乙醇室温，3～15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1％聚甲醛4℃，4～5h细菌丙酮、甲醇室温，3～10min病毒丙酮，无水乙醇室温，5～10min四氯化磺4℃，30～60min类脂质10％甲醛室温，3～10min细胞悬液1％聚甲醛室温，2min各种抗原的固定傅琦博F0318102标本的固定与保存抗原固定剂固定温度与时间蛋白质95％乙醇室温9标本的固定与保存

冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构的破坏。石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但是抗原的保存量不如冰冻切片。傅琦博F0318102标本的固定与保存冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中10酶消化处理石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。傅琦博F0318102酶消化处理石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固11抗体处理与保存抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应钱或不着色。抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。傅琦博F0318102抗体处理与保存抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异12免疫染色标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。傅琦博F0318102免疫染色标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；免疫染13免疫染色

对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。傅琦博F0318102免疫染色对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加14免疫组化染色中标识物的选择用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定

目前常用标识物质有荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶等傅琦博F0318102免疫组化染色中标识物的选择用量微小，容易在光镜或电镜下识别15设立对照实验

为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。傅琦博F0318102设立对照实验为确定结果的可靠性，在实验中必须设16免疫组化的结果判断染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强显色定位特定，具有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同程度显色无分布规律，某一片均匀着色

免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。傅琦博F0318102免疫组化的结果判断染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞17几种常用的免疫组化检测技术荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术免疫标记电镜技术……傅琦博F0318102几种常用的免疫组化检测技术荧光免疫组织化学技术傅琦博F0318

免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位

免疫荧光技术傅琦博F0318102免疫荧光技术将荧光素作为标记物免疫荧光技术傅琦博19

１.异硫氰酸荧光素FITC２.四乙基罗达明３.四甲基异硫氰酸罗达明４.藻红蛋白

▲呈现不同的荧光：绿色荧光(FITC)

橙色荧光

橙红色荧光

红色荧光等

荧光素作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物傅琦博F0318102１.异硫氰酸荧光素FITC荧光素傅琦20

荧光：

在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失

荧光显微镜：

荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检标本内的荧光物质发出发射光傅琦博F0318102傅琦博F031810221海马细胞

微管蛋白绿色(胞体、树突)

轴突终末蛋白红色(突触)傅琦博F0318102海马细胞傅琦博F031810222

培养的成纤维细胞微管呈绿色核呈蓝色傅琦博F0318102培养的成纤维细胞傅琦博F023免疫组织化学技术的应用

荧光免疫组织化学技术主要用于病原体感染的早期诊断，自身抗体检测，分析淋巴细胞表面标记物质及抗原、抗体的免疫组化定位等；在病原生物学方面，主要用于菌种的坚定和抗原结构的分析；在细胞免疫学检测中，用以检测拎包细胞表面的各种CD抗原、免疫球蛋白受体、HLA抗原和各种膜受体等。酶免疫组织化学技术主要用于组织切片或其它抗原的定位检测。组织切片中的各类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、姜细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。免疫标记电镜技术由于需要电子显微镜，目前仍较多用于科研分析。傅琦博F0318102免疫组织化学技术的应用荧光免疫组织化学技术主24免疫组化在临床病理诊断中的应用标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度;协助肿瘤良恶性的诊断;鉴别低分化癌和肉瘤;鉴别转移癌的性质;协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶;鉴别小细胞恶性肿瘤;癌组织耐药基因的检测;为癌症患者治疗方案的拟定提供依据;确定肿瘤组织的增殖活性;评估癌症患者的预后;检测病原体。傅琦博F0318102免疫组化在临床病理诊断中的应用标记淋巴造血组织及其肿瘤的细25鉴别低分化癌和低分化肉瘤鉴别低分化癌和恶性淋巴瘤鉴别微小转移癌灶鉴别某些转移癌的类型鉴别低分化癌的类型鉴别低分化肉瘤的类型傅琦博F0318102鉴别低分化癌和低分化肉瘤鉴别低分化癌和恶性淋巴瘤傅琦博26谢谢！傅琦博F0318102傅琦博F0318102谢谢！傅琦博F0318102傅琦博F0318102免疫组织化学报告人：傅琦博指导老师：胡翊群傅琦博F0318102免疫组织化学报告人：傅琦博傅琦博F0318102何谓免疫组化免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。傅琦博F0318102何谓免疫组化免疫组织化学是指在组织细胞原位通过免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化标记物与抗体集合形成标记抗体标本的处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜下观察结果傅琦博F0318102免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异30组织抗原抗体标记物

标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标傅琦博F0318102组织抗原抗体标记物标记抗体1荧光傅琦博F03181031组织抗原免疫细胞化学反应原理：＋标记抗体标记的抗原抗体复合物傅琦博F0318102组织抗原免疫细胞化学反应原理：＋标记抗体标记的抗原抗体复合32间接法直接法

两种免疫细胞化学反应方法傅琦博F0318102间接法直接法两种免疫细胞化学反应方法傅琦博F031833标本的处理标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞标本的固定与保存酶消化处理

组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。傅琦博F0318102标本的处理标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细34标本的固定与保存

固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。好的固定剂：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应傅琦博F0318102标本的固定与保存固定的目的：是细胞内蛋白质凝固35标本的固定与保存抗原固定剂固定温度与时间蛋白质95％乙醇室温，3～15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1％聚甲醛4℃，4～5h细菌丙酮、甲醇室温，3～10min病毒丙酮，无水乙醇室温，5～10min四氯化磺4℃，30～60min类脂质10％甲醛室温，3～10min细胞悬液1％聚甲醛室温，2min各种抗原的固定傅琦博F0318102标本的固定与保存抗原固定剂固定温度与时间蛋白质95％乙醇室温36标本的固定与保存

冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构的破坏。石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但是抗原的保存量不如冰冻切片。傅琦博F0318102标本的固定与保存冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中37酶消化处理石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。傅琦博F0318102酶消化处理石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固38抗体处理与保存抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应钱或不着色。抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。傅琦博F0318102抗体处理与保存抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异39免疫染色标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。傅琦博F0318102免疫染色标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；免疫染40免疫染色

对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。傅琦博F0318102免疫染色对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加41免疫组化染色中标识物的选择用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定

目前常用标识物质有荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶等傅琦博F0318102免疫组化染色中标识物的选择用量微小，容易在光镜或电镜下识别42设立对照实验

为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。傅琦博F0318102设立对照实验为确定结果的可靠性，在实验中必须设43免疫组化的结果判断染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强显色定位特定，具有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同程度显色无分布规律，某一片均匀着色

免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。傅琦博F0318102免疫组化的结果判断染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞44几种常用的免疫组化检测技术荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术免疫标记电镜技术……傅琦博F0318102几种常用的免疫组化检测技术荧光免疫组织化学技术傅琦博F0345

免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位

免疫荧光技术傅琦博F0318102免疫荧光技术将荧光素作为标记物免疫荧光技术傅琦博46

１.异硫氰酸荧光素FITC２.四乙基罗达明３.四甲基异硫氰酸罗达明４.藻红蛋白

▲呈现不同的荧光：绿色荧光(FITC)

橙色荧光

橙红色荧光

红色荧光等

荧光素作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物傅琦博F0318102１.异硫氰酸荧光素FITC荧光素傅琦47

荧光：

在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失

荧光显微镜：

荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检标本内的荧光物质发出发射光傅琦博F0318102傅琦博F031810248海马细胞

微管蛋白