微生物发酵制药宝典-第十章2制药微生物菌种建立课件

制药工艺学主讲教师：元英进教授天津大学化工学院制药工程系PharmaceuticalTechnology制药工艺学主讲教师：元英进教授天津大学化工学院制药工程系P1第二篇生物技术制药工艺第二篇生物技术制药工艺2第十章微生物发酵制药工艺10.1概述10.2微生物生长与生产的关系10.3制药微生物菌种建立10.4制药微生物培养基制备10.5灭菌工艺10.6微生物发酵培养技术10.7发酵工艺过程的检测与控制第十章微生物发酵制药工艺10.1概述310.3制药微菌种的建立10.3.1新药生产菌种的选育10.3.2菌种保藏10.3.3菌种库建立与质量控制

发酵制药生产菌种的建立10.3制药微菌种的建立10.3.1新药生产菌种的选育发4制药生产对菌种的要求1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种，无杂菌及噬菌体。2.易生长性：生长旺盛、迅速；4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用制药生产对菌种的要求1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退5自然分离目的：出发菌的获取样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体预处理：根据分离目的和微生物的特性。温度；化学处理；离心、膜过滤培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。分离方法：（1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液（2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃，45－50℃；7－14天至1月。发酵制药生产菌种的建立自然分离目的：出发菌的获取发酵制药生产菌种6药物的筛选琼脂扩散法——活性测定：非致病菌为对象，筛选生物活性物质。耐药和超敏菌种。HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。靶向筛选高通量筛选高内涵筛选发酵制药生产菌种的建立药物的筛选琼脂扩散法——活性测定：发酵制药生产菌种的建立7微生物药物与菌种的筛选流程样品采集微生物分离培养筛选鉴定筛选方法学建立阳性结果化合物分离纯化鉴定前药－新化合物新药研究与开发菌种鉴定与保藏生产出发菌发酵制药生产菌种的建立微生物药物与菌种的筛选流程样品采集微生物分离培养筛选鉴定筛选8

生产选育概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。应用：（1）菌种的提纯复壮。（2）防止退化，稳定生产水平。1年1次。过程菌种单孢子单菌落测活平板分离优良菌株效率低（10－E5－E8），增产幅度小发酵制药生产菌种的建立生产选育概念：不经过人工诱变处理，根据菌种9诱变育种概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。生物类：噬菌体，转座子。特点：快速，简单，效益大。缺点：无定向性，大量筛选。发酵制药生产菌种的建立诱变育种概念：人为创造条件（诱变剂处理），10诱变方案设计出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量（80％致死率）。选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。发酵制药生产菌种的建立诱变方案设计出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。发酵制药生11诱变育种流程出发菌种单孢子悬液稀释涂板单菌落初筛高产菌株诱变处理稳定性特性放大中试复筛投入生产发酵制药生产菌种的建立诱变育种流程出发菌种单孢子悬液稀释涂板单菌落初筛高产菌株诱变12原生质体融合育种概念通过化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞，产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。特点：有一定的定向性，效果显著。发酵制药生产菌种的建立原生质体融合育种概念发酵制药生产菌种的建立13d.筛选，鉴定e.高产菌株a.原生质体制备：用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体。操作过程hybridcell

c.细胞壁再生b.原生质体融合：异核体或重组子菌株1菌株2去细胞壁原生质体1原生质体2高渗，PEG处理杂合原生质体发酵制药生产菌种的建立d.筛选，鉴定e.高产菌株a.原生质体制备：操作过程hyb14概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，即经济适用的菌种。特点：短时、快速，定向应用：效果很显著基因组shuffling发酵制药生产菌种的建立概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质体融合技术为基15基因组Shuffling过程突变：随机突变获得单个性状优良的菌株重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1）筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株多轮循环：再次融合，得到融合库F2、F3、F4…….,筛选鉴定……结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种发酵制药生产菌种的建立基因组Shuffling过程突变：随机突变获得单个性状优良的16例1：改良青霉菌生产青霉素的产量随机突变育种方法：X-射线(X)紫外线(UV)氮芥(N)120units2658units发酵制药生产菌种的建立例1：改良青霉菌生产青霉素的产量随机突变育种120unit17toothpick1.01菌落1菌落0.5ml2.510菌落10菌落CKE.coliINVaF'0.5E.coliINVaF'-80℃stocktoothpick0.5ml0.5ml2.02.02.5-80℃stock2菌落-80℃stock例2：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）发酵制药生产菌种的建立toothpick1.01菌落1菌18生长曲线(选择压2.5M)黑色：出发菌种;蓝色：耐0.5绿色：耐1.25;红色：耐2.5发酵制药生产菌种的建立生长曲线(选择压2.5M)黑色：出发菌种;蓝色：耐0.5发酵19例3：提高泰乐菌素生产能力突变育种 基因组shuffling出发菌种效果ZhangYX,etal.,Nature,415(6872):644-666.发酵制药生产菌种的建立例3：提高泰乐菌素生产能力突变育种 基因组shuf201年，24,000次分析发酵制药生产菌种的建立1年，24,000次分析发酵制药生产菌种的建立2110.3.2菌种保藏原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化，不污染，随时为生产供菌。原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏）发酵制药生产菌种的建立10.3.2菌种保藏原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异22保藏方法比较发酵制药生产菌种的建立保藏方法比较发酵制药生产菌种的建立2310.3.3菌种库建立与质量控制依据：GMP对药品生产的有关要求和规定建立各级种子细胞库，实施种子批系统管理，进行验证确保菌种的稳定、无污染，保证生产正常有序进行。发酵制药生产菌种的建立10.3.3菌种库建立与质量控制依据：发酵制药生产菌种的建24建库的流程WCBQCWCBQCQCMCB新菌种或细胞系原始培养物QC质保实验室，繁殖保存实验室，繁殖主菌种库MCB：来源于原始菌种或细胞培养物工作菌种库WCB：由主菌种库或主细胞库繁殖而来。发酵制药生产菌种的建立建库的流程WCBQCWCBQCQCMCB新菌种或细胞系原始培25菌种库的质量管理发酵制药生产菌种的建立菌种库的质量管理发酵制药生产菌种的建立26保藏机构－中国中国典型培养物保藏中心:ChinaCenterforTypeCultureCollection(CCTCC)。中国科学院典型培养物保藏委员会,下设9个库中国普通微生物菌种保藏管理中心：ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter(CGMCC)，微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：中国医学科学院抗生素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所发酵制药生产菌种的建立保藏机构－中国中国典型培养物保藏中心:ChinaCente27保藏机构－国外WFCC：Worldfederationforculturecollections,http://www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml美国的典型菌种保藏中心ATCC:AmericanTypeCultureCollection,/日本发酵研究所IFO:InstituteforFermentation,Osaka,Japan英国国家典型菌种保藏所NCTC:NationalCollectionofTypeCulture,London,UK发酵制药生产菌种的建立保藏机构－国外WFCC：Worldfederationf28小结与要求生产菌种选育：自然分离获得出发菌种，生产选育、诱变和原生质体融合、Shuffling，提高菌种生产性能菌种保藏：防止失活和退化（物理手段）建立菌种库：GMP的要求，质量控制，保证生产菌种活力和供给了解菌种选育和保存的方法及其原理理解其生产应用价值，掌握突变和原生质体育种技术能设计育种研究方案和能实际应用。发酵制药生产菌种的建立小结与要求生产菌种选育：自然分离获得出发菌种，生产选育、诱变29思考题（1）如何进行生产菌的分离与筛选？（2）比较各种菌种选育方法的优缺点。（3）菌种保藏的原理是什么？有那些主要方法，各有何优缺点？发酵制药生产菌种的建立思考题（1）如何进行生产菌的分离与筛选？发酵制药生产菌种的建30制药工艺学主讲教师：元英进教授天津大学化工学院制药工程系PharmaceuticalTechnology制药工艺学主讲教师：元英进教授天津大学化工学院制药工程系P31第二篇生物技术制药工艺第二篇生物技术制药工艺32第十章微生物发酵制药工艺10.1概述10.2微生物生长与生产的关系10.3制药微生物菌种建立10.4制药微生物培养基制备10.5灭菌工艺10.6微生物发酵培养技术10.7发酵工艺过程的检测与控制第十章微生物发酵制药工艺10.1概述3310.3制药微菌种的建立10.3.1新药生产菌种的选育10.3.2菌种保藏10.3.3菌种库建立与质量控制

发酵制药生产菌种的建立10.3制药微菌种的建立10.3.1新药生产菌种的选育发34制药生产对菌种的要求1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种，无杂菌及噬菌体。2.易生长性：生长旺盛、迅速；4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用制药生产对菌种的要求1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退35自然分离目的：出发菌的获取样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体预处理：根据分离目的和微生物的特性。温度；化学处理；离心、膜过滤培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。分离方法：（1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液（2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃，45－50℃；7－14天至1月。发酵制药生产菌种的建立自然分离目的：出发菌的获取发酵制药生产菌种36药物的筛选琼脂扩散法——活性测定：非致病菌为对象，筛选生物活性物质。耐药和超敏菌种。HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。靶向筛选高通量筛选高内涵筛选发酵制药生产菌种的建立药物的筛选琼脂扩散法——活性测定：发酵制药生产菌种的建立37微生物药物与菌种的筛选流程样品采集微生物分离培养筛选鉴定筛选方法学建立阳性结果化合物分离纯化鉴定前药－新化合物新药研究与开发菌种鉴定与保藏生产出发菌发酵制药生产菌种的建立微生物药物与菌种的筛选流程样品采集微生物分离培养筛选鉴定筛选38

生产选育概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。应用：（1）菌种的提纯复壮。（2）防止退化，稳定生产水平。1年1次。过程菌种单孢子单菌落测活平板分离优良菌株效率低（10－E5－E8），增产幅度小发酵制药生产菌种的建立生产选育概念：不经过人工诱变处理，根据菌种39诱变育种概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。生物类：噬菌体，转座子。特点：快速，简单，效益大。缺点：无定向性，大量筛选。发酵制药生产菌种的建立诱变育种概念：人为创造条件（诱变剂处理），40诱变方案设计出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量（80％致死率）。选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。发酵制药生产菌种的建立诱变方案设计出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。发酵制药生41诱变育种流程出发菌种单孢子悬液稀释涂板单菌落初筛高产菌株诱变处理稳定性特性放大中试复筛投入生产发酵制药生产菌种的建立诱变育种流程出发菌种单孢子悬液稀释涂板单菌落初筛高产菌株诱变42原生质体融合育种概念通过化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞，产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。特点：有一定的定向性，效果显著。发酵制药生产菌种的建立原生质体融合育种概念发酵制药生产菌种的建立43d.筛选，鉴定e.高产菌株a.原生质体制备：用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体。操作过程hybridcell

c.细胞壁再生b.原生质体融合：异核体或重组子菌株1菌株2去细胞壁原生质体1原生质体2高渗，PEG处理杂合原生质体发酵制药生产菌种的建立d.筛选，鉴定e.高产菌株a.原生质体制备：操作过程hyb44概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，即经济适用的菌种。特点：短时、快速，定向应用：效果很显著基因组shuffling发酵制药生产菌种的建立概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质体融合技术为基45基因组Shuffling过程突变：随机突变获得单个性状优良的菌株重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1）筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株多轮循环：再次融合，得到融合库F2、F3、F4…….,筛选鉴定……结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种发酵制药生产菌种的建立基因组Shuffling过程突变：随机突变获得单个性状优良的46例1：改良青霉菌生产青霉素的产量随机突变育种方法：X-射线(X)紫外线(UV)氮芥(N)120units2658units发酵制药生产菌种的建立例1：改良青霉菌生产青霉素的产量随机突变育种120unit47toothpick1.01菌落1菌落0.5ml2.510菌落10菌落CKE.coliINVaF'0.5E.coliINVaF'-80℃stocktoothpick0.5ml0.5ml2.02.02.5-80℃stock2菌落-80℃stock例2：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）发酵制药生产菌种的建立toothpick1.01菌落1菌48生长曲线(选择压2.5M)黑色：出发菌种;蓝色：耐0.5绿色：耐1.25;红色：耐2.5发酵制药生产菌种的建立生长曲线(选择压2.5M)黑色：出发菌种;蓝色：耐0.5发酵49例3：提高泰乐菌素生产能力突变育种 基因组shuffling出发菌种效果ZhangYX,etal.,Nature,415(6872):644-666.发酵制药生产菌种的建立例3：提高泰乐菌素生产能力突变育种 基因组shuf501年，24,000次分析发酵制药生产菌种的建立1年，24,000次分析发酵制药生产菌种的建立5110.3.2菌种保藏原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化，不污染，随时为生产供菌。原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏）发酵制药生产菌种的建立10.3.2菌种保藏原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异52保藏方法比较发酵制药生产菌种的建立保藏方法比较发酵制药生产菌种的建立5310.3.3菌种库建立与质量控制依据：GMP对药品生产的有关要求和规定建立各级种子细胞库，实施种子批系统管理，进行验证确保菌种的稳定、无污染，保证生产正常有序进行。发酵制药生产菌种的建立10.3.3菌种库建立与质量控制依据：发酵制药生产菌种的建54建库的流程WCBQCWCBQCQCMCB新菌种或细胞系原始培养物QC质保实验室，繁殖保存实验室，繁殖主菌种库MCB：来源于原始菌种或细胞培养物工作菌种库WCB：由主菌种库或主细胞库繁殖而来。发酵制药生产菌种的建立建库的流程WCBQCWCBQCQCMCB新菌种或细胞系原始培55菌种库的质量管理发酵制药生产菌种的建立菌种库的质量管理发酵制药生产菌种的建立56保藏机构－中国中国典型培养物保藏中心:ChinaC