药监系统官方培训 王知坚 益生菌相关药物的质量分析与控制 浙江省食品药品检验研究院

含益生菌成分药品质量分析现状和相关标准探讨浙江省食品药品检验研究院王知坚浙江省食品药品检验研究院浙江省药品监督管理局直属公益一类事业单位4个国家药品监督管理局重点实验室（药品微生物检测与预警重点实验室）国家级药品包装材料检验中心（浙江省级重点实验室）家级口岸药品检验所、

2011协同创新中心核心成员单一期建筑面积23

90m2二期食品检验检测大楼拟建13500m21100余台（套），

2亿元260余名，其中高级

称67人，硕士及

以上人员占比超过60%目录>12行业现状质量分析现状34国内外法讨质量控制方向1行业现状含益生菌成分

品分类现状含益生菌成分药品10◼国产含益生菌成分药品42个品种◼进口含益生菌成分药品10个品种国产药品进口药品42含益生菌药品分类管理情况国药准字Z国药准字B国药准字H国药准字S➢

共计1个品类➢

共计1个文号➢

共计1个品类➢

共计2个文号➢

共计13个品类➢

共计38个文号共计35个品类共计54个文号➢➢东三省13家北京5家山东10家前言基本要求制造检定保存、运输及有效期《

国药典》三部微生态活菌制品总论生物制品含益生药品分《中国药典》四部通则<1105>非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法：除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。应符合制剂通则项下相关标准/微生物限度检查《新药转正标准》等标准/中药/保健药品分类不同导致执行标准不同计数培性检查法计数方法

用性薄滤法<105>非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法法“培养与计数

点计平板上供试

检查生长的菌落数”结断“培养基上的总菌落数”无法进行合理且符合规定的方法适用性试验<1107>非无菌产品微生物限度标准含益生菌成分药品无法满足相关微生物限度标准1.增加稀释液或培养基体积2.加入适宜的中和剂<1106>非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查方法适用性试验<1105>抗菌活性的或灭活剂去除或灭活3.采用薄

过滤法.上述几种方法的联合使用若未检出试验菌，应

除供试品的抑菌活性

见非无菌产品微生物检査：微生物计需使用抑制益生菌生长但不影响控制菌生长的灭活剂，可操作性低数法(105)中的“抗菌灭活”

]，并重新进行方法适用性试验。活性的化学药品地标升国标16册白葡萄球菌片含量测定：总磷量、无机磷、有机磷缺少益生菌含量测定相关内容，质量控制存在不足2质量现状分析案例1—胰酶散全国评价性抽验品种复方胰酶散-按化学药品管理的含益生菌复方制剂，活菌来自乳酶生。乳酶生-二部药典收载的

化学原料药管理的益生菌制品，包含活微生物为屎肠球菌。不合格样品：有益生菌，有杂菌。乳酶生0.1g/袋粉酶0.1g/袋胰酶0.1g/袋案例1—胰酶散产品：胰酶散（国药准字H13023859

）我国1980年开始在各省进行注册生产。曾用名胖得生。现标准为《化学药品地标升国标第9册》，国外药典无收载。国内共有19家生产企业，20个批准文号。途：用于小儿消化不良及营养障碍应符合《中国药典》片剂通则下的相关要求。即通则<110>非无菌药品微生物限度标准中相关内容。不合格项目：微生物计数✓

需氧菌总数（TAMC）✓

霉菌和酵总数（TYMC）案例1—胰酶散微生物计数方法适用性：◆

检测条件：1:10供试液，0.2ml/皿，涂布◆

培养基：TSA、SDA、玫瑰红钠琼脂◆

测试结果

TSA、SDA上，活菌生长，标准测试菌株回收率大于90%。

瑰红钠琼脂上，活菌不生长，标准测试菌株回收率大于90%。案例1—胰酶散微生物限度检查结果案例1—胰酶散需氧菌总数Max

2000cfu/g霉菌和

母菌总数Max

200cfu/g屎肠球菌6样品Min

10

cfu/g：：：1234920010

00满足要求4000440045048006900400满足要求满足要求0560050004301400015000440023000600满足要求满足要求满足要求满足要求满足要求满足要求06781009540032003001011121345008004800250059005300满足要求满足要求案例1—胰酶散胰酶散中杂菌类别◆

细菌─泛菌属（分散泛菌、septica、alhagi）─地衣芽胞杆菌未见较强致病菌，多为分布在空气、环境、土壤中的微生物淀粉芽胞杆菌◆

霉菌─曲霉属（灰绿曲霉、花斑曲霉、赭曲霉、邬氏黄丝曲

）─出芽短梗霉菌◆

酵母菌─粘质红酵母─浅白隐球酵母案例2—肠泰合剂◼

肠泰合剂

制剂概况

生产企业：重庆赛诺

执行标准：

WS-11511（ZD-1511）-2002

剂型：合剂，口服液

规格：10ml/支

包装规格：6支/盒，10支/盒

成份：红参、白术、茯苓、甘草、双歧杆菌培养液、陈皮糖浆。

儿科消化

良常用药案例2—肠泰合剂需氧菌总数序号鉴定结果cfu/ml1234568910111213141516171819202122040505080植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌植物乳杆菌/1101402607701700190023002400340037006200<1010

双

歧

杆

菌

严

格

厌

氧

特

性

，不干扰需氧条件计数杂菌。

样品检出菌

=

杂菌////<10<10<10<102/案例2—肠泰合剂MRS琼脂培养基（GB4789.35）

(ISO

29981-TOS丙酸盐

119#培养基琼脂

（企业用）◼

肠泰合剂

双歧杆菌分离检

标准规定：适宜培养基，没有明确。

培养条件：37℃，厌氧袋培养

双歧杆菌属测试菌株生长良好：CC6068、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌

pH3.0的样品环境中，双歧杆菌存在不稳定。2010)蛋白胨10g牛肉粉5g酵母粉4g葡萄糖20g酪蛋白水解物10g

大豆蛋白胨5g/胰蛋白胨5g酵母粉10g葡萄糖10g酵母粉1g/吐温801.0mL磷酸氢二钾2g//磷酸氢二钾4.8g磷酸氢二钾0.04g磷酸二氢钾0.04g/磷酸二氢钾3gL-半胱氨酸盐酸盐0.5g丙酸钠15g半胱氨酸盐酸盐0.5g醋酸钠5g当采取GB及ISO推荐的培养基检查时，23批肠泰合剂中均未分离到双歧杆菌活菌。柠檬酸三铵2g硫

铵3g氯化镁0.0192g硫酸镁0.2g硫酸锰0.05g硫酸镁0.2g/低聚半乳糖混合物10g琼脂15氯化钙0.008g碳酸氢钠0.4g/氯化钠0.08g琼脂15g水1000mLpH6.2琼脂15~20g水1000mLpH7.0水1000mLpH6.3案例2—肠泰合剂出处种标准收录◼

中成药品种，WS-11511(ZD-1511)-2018修订内容中未涉及微生物内容。/属双歧杆菌属双歧杆菌科双歧杆菌目放线菌纲◼

2004版标准，2018版标准中并未明确生产菌种的种名，只标称双歧杆菌。科目◼

企业对于菌

的生产过程控制意识不足。◼

2019年

企业联系相关专业领域进行生产调整。纲门放线菌门案例3—复合乳酸菌胶囊◼

104批样品中均存在鼠李糖乳杆菌和屎肠球菌。◼

随着室温放置时间延长，菌数不断下降。样品检出伯杰氏手册伯杰氏手册胶囊标准收录胶囊标

样品检出

胶囊标出处1984年乳酸乳杆菌重命名准收录

（小菌落）

准收录

乳酸链球菌

（大菌落）重命名种属德氏乳杆菌乳酸亚种乳酸乳球菌乳酸亚种乳杆菌嗜乳杆菌

鼠李糖乳杆菌

乳酸链球菌屎肠球菌乳杆菌属乳杆菌科链球菌属

乳

菌属

肠球菌属链球菌科

肠球菌科科目纲门乳杆菌目芽孢杆菌纲厚壁菌门案例3—复合乳酸菌胶囊•

企业、三部微生态制剂

药典委员会进行标准协调。•

2019.1公示的标准中，修订了菌种名称，增订了“杂菌”检查的要求。3国内外法规探讨中国药典《中国药典》2015年版三部，包含：➢

前言➢

基本要求➢

造➢

检定➢

保存、运输及有效期附录1

已批

上市的微生态活菌制品附录2

微生态活菌制品活菌数测定方法附录3

微生态活菌制品杂菌检查法中国药典杂菌检查法（计数及控制菌

查）种子批到成品的检定活

数测定方法种子批的检定：生化反应：按通则3605“细菌生化养基”选择相应的培养基或其他事宜方法进行，结果应符合原始菌种的特性。选择性琼脂培

基是指最适宜制剂（或菌粉）中活菌生长的培养基。须经批准后方可使用。控制菌检查

—定性测定产品中

否污染特定致病菌或者条件致病菌；非致病性杂菌

—

定量测定产品中污染的杂菌；真菌计数

—定量测定产品中污染的真菌；➢培➢➢美国药典〈64〉

PROBIOTIC

TESTSIDENTIFICATION•

ENUMERATION•

PERFORMANCE

TESTS•

CON

AMINANTS•

ADDITIONALREQUIREMENTS美国药典菌种鉴定程序不产芽孢菌的鉴定法：用特异性引物鉴定乳酸菌和双歧杆菌美国药典活菌计数目前，本章收载了乳酸菌和双歧杆菌的计数方法。其他益生菌株的计数方法，入芽孢菌、非芽孢菌、酵母菌或霉菌后续也将在本章中收载。也可采用其他微生物替代方法进行计数试验，与USP<1223>接轨，一些新技术及替代方法也可被用于活菌计数只要证明是等效的。美国药典欧洲药典•

LIVE

BIOTHERAPEUTICPRODUCTSFORHUMANUSE•

2.6.36.

MICROBIOLOGICALEXAMINATIONOFLIVEBIOTHERAPEUTICPRODUCTS:TESTS

FORENUMERATIONMICROBIALCONTAMINANTS•

2.6.38.

MICROBI

LOGICALEXAMINATIONOFLIVEBIOTHERAPEUTICPRODUCTS:TESTS

FORSPECIFIEDMICRO-ORGANISMS欧洲药典特征鉴定包括确定该菌株的表型和基因型，采用宏观和微观方法、生测试、分子遗传学测试、测序或质谱分析。株水平的鉴定欧洲药典通过适当的微生物计数试验，以CFU为单位来确定活性微生物数量。果以CFU/g、CFU/mL或CFU/unit示；应不小于规定值或在规定的范围内。经批准，可以活细胞数/mL表示。活菌计数方法应经相应的方法适用性试验欧洲药典杂菌计数检查法，若活菌生物制剂（LBP）会干扰杂菌计数，则可按照右图进行优化。合理且验证的其他方法也可被使用。欧洲药典控制菌检查采用2.6.6已验证的方法消除活菌或

他物质的影响，如仍有干扰，则根据右图所示进行优化。欧洲药典若杂菌检查方法不适用，则采取检测是否存在特定的致病性微生物来代替杂数试验。欧洲药典菌株必须具有稳定的表型和基因型。菌株的抗菌素耐受性明确，任何可能从某种微生物转移到相关微生物菌群

耐药性须进行调查和排除。在安全性方面，必须对毒力因子的存在进行调查和评估。对菌株安全性的要求与中国药典三部微生态活菌制品总论基本一致食品、保健食品相关法规联合于2012年1月3日提出用作食品成分的益生菌推荐标准，并将其包括在新的附录

XV中细菌17个属酵母15个属35个属真菌3个属美国USP及FCC食品、保健食品相关法规鉴定菌数配套相关的标准规范进行约束安全性标签与效力美国监管机构运行模式活性与遗传稳定性纯度定期更新备案信息和标准方法国际保藏/参考菌株株传代程序采用“企业备

制”运输和贮存美国USP及FCC食品、保健食品相关法规EFSA建立安全资格认证QP，对添加到酵母11属14种食品中的微生物实施上市前风险评估细菌15属74种通过安全资质认证的益生菌菌株88种EFSA（欧洲食品安全局）2016版食品、保健食品相关法规分类学地位：通常要求其鉴定到种水平QPS菌种相关信息：使用历史，科学文献，临床工业应用，生态学及其他适当因素估内容致病性

：不具产毒特性最终用途EFSA（欧洲食品安全局）2016版食品、保健食品相关法规不得携带临床用抗生素的耐药性基因获得性耐药基因包括但不限于以下36种tetvanDaphvatbla

V

ManEaadblaKPCvanGarmblaCTX-MvanLrmtvanAvanMermvanBaaclnuvgaeremefmremsrmphcatlinlsacfruldhfrfloflexqepqnＲoqxAB食品、保健食品相关法规否分类地位明确是知识体系完善是否计划用途是否与传统用途相似？计划用途是否与人或动物直接接触？是是否已知的致病变体？是否是否产生有害代谢物？否是否是是其他危害？（如环境、耐药性）毒性能否排除或人/动物其他危害？（如环境、耐药性）致病性能被排除

？接触不多？是是否否否可界定的可界定的否是否否是QPS不适用QPSQPS不适用QPS不适用QPS（根据其他应用）食品、保健食品相关法规有效

科学

开放EFSA（欧洲食品安全局）2016版食品、保健食品相关法规卫生部办公厅

《可用于食品的菌种名单》食品、保健食品相关法规卫生部办公厅

《可用于婴幼儿食品的菌种名单》食品、保健食品相关法规国家市场监管总局

《益生菌类保健食品申报与审评规定（试行）》食品、保健食品相关法规050307010904080206国家市场监管总局

《益生菌类保健食品申报与审评规定（试行）》4质量控制方向完善质量标准规定◆

解决同类产品归属不同类别管理带来的质量差异对不同类产品统一标准要求益生菌计数开展方法适用性试验，尽量真实的反应样品中的活菌数培

基选择策略——多联的制品必要时考虑培养基的选择性（对某些微生物有抑制）；尽量选择非选择的培养基；同类培养基结果一致时选择已获得、性价比高的培养基。培养条件选择策略——培养温度可以比较《中国药典》四部通则需氧菌总培养时间选择策略——通供

液制备过绘制活菌数随培养时间变化趋势图确定适宜的培养时间。数培度和国选择策略——比较不同混匀方式；加入表面活性剂等。其他因素标中同类菌培养温度；培养方式根据菌种特性选择确定即可。益生菌计数供试液的制备供试液的制备混合方式稀释度无菌称取3.0g制品或菌粉（胶囊取内容物），加入27.0

l稀释液中，充分摇匀。稀释液使用灭菌生理

化钠溶液或其他适宜的稀释液。选择策略混匀方式需考虑（手摇、均质袋均质、刀片匀浆、涡旋）；混匀时间；当存在辅料影响计数结果时（快速沉降），可以考虑

当加入表面活性剂。混合时间添加剂益生菌计数例：蜡样芽胞杆菌片活菌计数加玻璃珠振荡器振30min加玻璃珠振荡器振60min计数结果差异大，重复性差先手工研磨后加玻璃珠振荡器振30min静置2

in后加玻璃珠振荡器振30min益生菌计数例：蜡样芽胞杆菌片活菌计数匀浆杯7500rpm匀浆40s匀浆杯3000rpm匀浆3min•

各方法计数结果均比较稳定•

加入表面活性剂吐温80计数结果增加加1%吐温后，匀浆杯7500rpm匀浆40s加1%吐

后，匀浆杯3000rpm匀浆3min益生菌计数◆

供试品制备对结果的影响计数结果差异大重复性差常规方法制备供试液计数结果增加重复性得以改善入玻璃珠后手工震荡制备供试液计数结果增加重复性良好供试液中加入表面活性剂益生菌计数◆

稀释度选择对结果的影响微生物的分布以水中微生物分布为例。整瓶混合好的水中共含有30个细菌，将整瓶水平均分成10等份，每份平均含3个细菌，但实际每份细菌的数量在0～7范围内。水中微生物分布图益生菌计数计数结果为AB低稀释级2.5×108

cfu/g10-6稀释级计数结果为253、237计数结果为高稀释级1.8×108

cfu/g10

稀释级计数结果为14、21益生菌鉴定某些微生物有蔓延或者不规则生长的特性益生菌计数保障产品活菌存供试液制备、培养基选择等因素活

，例如压片时

头的压力生产工艺检验方法产品本身本身含菌的种类及其性质等例：芽孢类微生态制剂的芽孢率对益生菌计数结果影响大益生菌计数探索方案探索获得全部营养体（芽孢率小于1%）以及全部芽孢的实验条件显微镜检作为试验样本经典100℃加热法流式细胞

术建立该产品的芽孢率测定方法益生菌计数60%50%40%系列120%10%0%051520253035时间（h）显微镜观察芽孢率随

床培养变化趋

图全部营养体（芽孢率小于1%）流式细胞仪检测结果注：P5为芽孢，P6为营养体益生菌计数9008007006005000120100806040200系列1系列1300200100005152025303505101520253035时间（S）时）100℃加热全部营养体活菌化趋势图00℃加热样品活菌数变化趋势图益生菌计数图1为样品采用SYBRgreen+PI双染后流式细胞仪的测定结果；图2为样品仅采用SYBRgreen单染后流式细胞仪的测定结果；图3为摇床振荡培养25h后SYBRgreen+PI双染流式细胞仪的测定结果；图图2图4为摇床振荡培养25h后SYBRgreen单染流式细胞仪的测定结果图3图4益生菌鉴定生化鉴定复杂多联产品成分易相互影响01

0203

04对于常

语微生物活菌制品的菌，对其进行鉴定往往需要三十种以化反应，成本高、操作复杂。对于多联产品，其成分较为复杂，难以对每一种成分进行完全的分离培养。生化反应不稳定成本高、耗时长对于株水平的生化反应存在不稳定性，

定合适的传统生化鉴定需进行大量的生化反应，且从培养到鉴定需要数天。质量管

标准。益生菌

定技术难点菌种鉴定◆

株水平的鉴定✓

脉冲场凝胶电泳技术ulsedFieldGel

Electrophoresis(PFGE)✓

核糖体分型技术Ribotyping(RiboPrinter)✓

全基因组测序Whole

Genome

Sequencing(WGS)✓

随机扩增多态性DNA标记Random

AmplifiedPolymorphic

DNA(RAPD)✓

扩增片段长度多态性AmplifiedFragmentLengthPolymorphism(AFLP