生物化学-2017核酸杂交

分子生物学技术分子生物学在分子水平上

命现象的科学生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生等方面来阐明各种生命现象并加以应用（疾病）技术解决问题的方法及其原理生物大分子（

）获取与鉴定技术核酸与蛋白质分离纯化、文库、、分子杂交的扩增（DNA克隆-重组DNA，PCR)高通量（

）功能研究技术超表达，观察表型、RNAi干扰技术生物大分子相互作用（酵母双杂交、CHIP、EMSA)蛋白表达与抗体蛋白在细胞中的定位编辑技术（crispr/cas9，NgAgo-gDNA？）应用与

治疗生物分子（核酸）杂交技术

Nucleic

acidhybridization内容分子杂交概述核酸探针杂交信号的检测核酸分子杂交的类型核酸分子杂交实验的影响因素与优化技术第一节分子杂交概述加热变性复性复温DNA的变性和复性变性是指某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。复习DNA变性的方法：热变性：温度升高到90~100℃酸碱变性：pH值低于3或高于10化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、等变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加（增色效应）复习增色效应(hyperchromiceffect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。DNA解链时的紫外吸收变化复习DNA的解链曲线(溶解曲线)连续加热DNA的过程中以温度相对于

A260值作图，所得的曲线称为解链曲线解链温度(meltingtemperature，Tm)解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。复习影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：外部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。复习复性过程单链分子间碰撞形成局部双链局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列形成完整的双链分子影响复性速度的因素DNA浓度段的大小DN温度溶液的离子强度DNA顺序的复杂性核酸的分子杂交将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。杂化双链

(heteroduplex)核酸分子杂交技术具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下

按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。

杂交的双方是待测核酸（目的

）和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)核酸分子杂交技术1961年,Hall等-------液相杂交探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体1962年,Bolton等设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。核酸分子杂交技术发展历程核酸分子杂交技术发展历程组60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞的方法。从不同生物体（细菌、酵母等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。第二节核酸探针（Probe）探针从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。探针技能，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对其它分子进行检测的一种技能含标记物的分子-----探针用放射性核素、生物素或荧光

标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。核酸探针技术DNA探针最常用，长度在几百碱基对以上的单链或双链DNA组DNA探针：如

DNAcDNA探针：互补于mRNA的DNA分子,最常用寡核苷酸探针：10-50bp，

、点突变RNA探针特异性强，但RNA极易降解，不宜操作核酸探针的种类DNA探针的特点：探针多已克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，

方法简便。不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。能用于同位素和非同位素标记。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等探针标记标记物是什么？怎样加上去？（探针标记法）如何检测杂交信号检测探针标记物理想探针标记物应具备的特性：高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性放射性标记物非放射性标记物放射性标记物----放射性核素放射性核素能产生射线,将核素标记在核酸所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA或RNA中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的或射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。产生射线的核素：32P、3H、35S,如：[32P]dATP产生射线的核素：125I常用的放射性核素32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14.3天），位和位标记。35S：分辨率高、半衰期长（87.1天），敏感度低放射性标记物的缺点放射性污染成本高：半衰期短，不能长期保存半抗原：地高辛配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫

酸荧光素、

等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光常用的非放射性标记物地高辛甙元又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP连接起来,形成DIG-11-dUTPDIG-11-dUTP-----通过一定方法掺入到DNA中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物----加底物显色灵敏度较高：0.1pg特异性较生物素高是较理想的非放射性标记物地高辛甙元生物素：1-2pg生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----生物素-抗生物素蛋白-酶的复合物----加底物显色生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素标记的探针生物素化的核苷酸和光敏生物素生物素光敏基团优点无放射性污染成本低、操作简单缺点敏感性、特异性均低于放射性核素非放射性标记物探针标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为代谢的底物，在细胞

代谢时使

核素掺入到新

的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中探针体外标记法化学标记法标记物分子上的活性

与探针分子上的某些

反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上探针的酶促标记法缺口翻译法（nick

translation）或切口平移随机引物法（random

priming)末端标记法(end-labeling)其他PCR标记法cDNA探针的标记（反转录

单链cDNA探针）RNA探针的标记（体外转录的方法）小片段323个氨基酸5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604个氨基酸

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N

端C

端木瓜蛋白酶DNA-pol

ⅠKlenow片段是

DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。切口平移法（nicktranslation)利用DNase

I在DNA双链上造成单链切口利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，

新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中缺口平移法的特点快速、简便、标记的探针均一、特异性高仅适用于较长的双连DNADNA多聚酶必须是E.ColiDNA多聚酶的全酶DNA酶I的浓度一定要适宜随机引物法（random priming

)原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为新链的引物，在DNA聚合酶E.coli

DNA聚合酶I的Klenow大片段的催化下，按53方向

一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。时，带标记的核苷酸掺入到新

的DNA分子中随机引物法的特点：能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以上可直接在低

琼脂糖溶液中进行标记末端标记法将标记物导入线型DNA或RNA的3’末端或5’末端的一类标记法，可分为5’末端标记法3’末端标记法T4聚合酶替代法5’末端标记法最常用的标记物是[γ32P]ATP。T4多聚核苷酸激酶能特异地将[γ32P]ATP中的32P转移到DNA或RNA的5’—OH末端，而大多数DNA或RNA的5’端都因磷酸化而含有磷酸基团。因此标记前要先用碱性磷酸酶去掉磷酸基团。末端脱氧核糖核苷酸转移酶(terminal

deoxynucleotidyl

traferase，TdT)催化标记的dNTP加到单链或双链DNA的3’末端上3’末端标记法T4聚合酶替代法：在缺乏核苷酸的情况下，利用DNA聚合酶从3’→5’端对双链DNA进行水解，产生带凹缺的3’端DNA分子，加入4种核苷酸，DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性受抑，在5’→3’聚合酶活性的作

用下，DNA分子开始修复，带有标记的核苷酸就掺人到修复的3’端片段中。探针的纯化乙醇沉淀法无水乙醇可以沉淀DN段，可去除dNTP和蛋白质凝胶过滤柱层析法利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是

Sephadex

G-50微柱离心法其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针第三节杂交信号检测放射性核素探针的检测放射自显影利用放射线在X线片上成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。放射性同位素所发射出来的带电离子(β粒子)作用于感

光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的"像"非放射性核素探针的检测偶联反应显色反应非放射性核素探针的检测偶联反应半抗原——通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。地高辛-抗地高辛-酶的复合物配体——亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-plex

，ABC）显色反应：通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。酶学检测：酶促反应使底物形成有色产物。最常用辣根过氧化物酶（

HRP

）碱性磷酸酶（AKP

）酸性磷酸酶β–半乳糖苷酶AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。地高辛标记探针的检测抗地高辛抗体－碱性磷酸酶复合物＋底物（BCIP+NBT)紫色的不溶性化合物生物素标记探针的检测辣根过氧化物酶＋

底物（ＤＡＢ）抗生物素蛋白生物素棕褐色不溶性的化合物显色反应：荧光检测：异硫

酸荧光素（FITC）和

，可被紫外线激发出荧光而被检测到。主要应用于原位杂交。化学发光法：在化学反应过程中伴随的发光反应。目前常用的是（

HRP）催化

（luminol）伴随的发光反应。适合于Southern、Northern及斑点杂交。电子密度标记：利用重金属的高电子密度、在电子显微镜下进行检测，适合于细胞原位杂交。第四节核酸分子杂交类型按核酸分子杂交环境大致分为:液相杂交待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为和误差较高。RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法固相杂交---最常用固相杂交：根据支持物的不同又可分为：滤膜杂交（印迹杂交）Southern

印迹法Northern

印迹法Western

印迹法斑点杂交菌落原位杂交组织原位杂交理想的固相支持物（滤膜）应具备的特性具有较强结合核酸分子的能力不影响与探针的杂交反应与核酸分子结合稳定牢固具有良好的机械性能非特异吸附少常用的滤膜硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强（在高离子强度下，单连DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2）杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高化学活化膜：段有同等优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DN结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。印迹杂交技术印迹杂交操作基本流程印迹转移将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上杂交将具有核酸印迹的滤膜与带有标记的DNA或RNA探针进行杂交Southern

blottingDNA印迹与杂交1975年，英国Edwen

Southern创建定义：检测DNA杂交方法，即将DNA电泳分离、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方

法。应用：

组DNA的定性和定量分析、

诊断、分子克隆、法医学等Southern

blotting的主要步骤（8步）待测DNA样品的

、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜(印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针Southern杂交(预杂交、杂交)洗膜（除去游离探针）杂交信号检测标记的探针1、待测DNA样品的

、酶切DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA

，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。步骤解析2.待测DNA样品的电泳分离琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4.Southern转膜(印迹)待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上，即印迹。Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法其基本原理是：利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DN

段垂直向上运动，凝胶中的DN 段移出凝胶而滞留在膜上。重物玻璃板吸水纸滤纸凝胶盐桥毛细管转移法（

Southern转印）（2）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。转移快（3）真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。较毛细管虹转移更为有效，快捷各种转移方法的比较毛细管虹吸法操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。电转移法效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。真空转移法效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。6、Southern杂交预杂交：固相膜可结合DNA,包括探针

封闭固相膜上多余的结合位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液（常用非特异性DNA或蛋白质）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交5.

探针建立杂交条件需要考虑的因素离子强度：一般，探针长500bp，G+C含量为５０％，离子强度为５x

SSC；杂交液中不含甲酰胺，Tm值为93.4Ｃ，杂交温度68

Ｃ，含甲酰胺，Tm值为68.4

Ｃ，杂交温度42.4

Ｃ杂交温度：杂交反应在低于Tm值15-25

Ｃ温度下进行减少非特异性杂交反应：预杂交7.洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的

DNA离子强度：0.1x

SCC洗膜温度：低于

Tm值

5-12

C探针长500bp，G+C含量42%,离子强度0.1xSSC,不含甲跣胺，Tm值为67Ｃ，则洗膜温度为55-62

Ｃ.8.

杂交信号的检测Northern印迹杂交Northernblot印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交。基本原理和基本过程与Southern

blot基本相同鉴别RNA探针可用DNA或RN

段待测样品为总RNA或mRNANorthern印迹与Southern印迹的不同点变性：>RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂（凝胶中加保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性转膜