现代实验技术概述课件

现代实验技术概述研究思路

整体（动物模型、ELISA）

组织、细胞（组织、细胞培养）

分子（RNA、DNA、Protein）

基因（基因克隆）整体研究动物模型自发性动物模型（SpontaneousAnimalModels）是指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病。这类模型在遗传病、代谢病、免疫缺陷病、内分泌疾病和肿瘤等方面的应用正日益增多。诱发性或实验性动物模型（ExperimentalAnimalModels）是指研究者通过使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或毒使动物患相应的传染病，又如用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。是药物筛选研究工作所首选。

ELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）（3）酶反应的底物。ELISA双抗体夹心法测抗原

双抗原夹心法测抗体

组织、细胞培养培养：将取得的组织、细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。组织、细胞培养组织块培养：直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。细胞培养：一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。CO2培养箱

分子水平研究

转录

翻译

DNA

RNA

Protein

逆转录

中心法则核酸制备步骤破碎细胞提取纯化总RNA的提取

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相关键的是抑制ＲＮＡ酶活性

TRIZOL法

TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。氯仿离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。异丙醇沉淀还原水样层中的RNA。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提DNA的提取从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大，一般达2×10道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。蛋白质提取基本步骤：清洗组织/细胞（缓冲盐液）裂解细胞（裂解液）离心去除膜组分等获得可溶性蛋白质纯化（离心、层析、电泳等）电泳概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。原理：在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，但制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。

聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点。用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高。

聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。水平板式电泳槽垂直板式电泳槽反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-Polymerasechainreaction）

抽提RNA总RNARTcDNAPCRDNAAnalysis:QuantificationorcDNAcloneRT－PCRPCR－聚合酶链式反应体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段。原理：类似于DNA的体内复制在试管中的DNA的体外合成。用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。◆◆◆引物1引物2模板PCR原理示意图目的基因增加2n20～30循环94℃变性5’3’3’5’变性94℃引物退火45-65℃延伸72℃PCR过程示意图模板PCR反应产物积累规律示意图平台期产物量时间（循环数）PCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析淬灭基团R荧光定量PCR示意图模板DNADNA探针RQQ报告基团WesternBlotting§印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。§1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。§而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlotting蛋白质分离：十二烷基磺酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）蛋白质转印：蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC）上，称为一个印迹（blot）固相免疫测定(ECL)：一抗、酶标二抗、底物NorthernBlottingRNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。应用：检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。提取RNA琼脂糖凝胶变性电泳碱变性、转移到NC膜与DNA或RNA探针杂交放射自显影Northern印迹杂交NorthernBlottingRNA分离：琼脂糖凝胶变性电泳（去除RNA

中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离）RNA转印：RNA转移到硝酸纤维素滤膜上探针杂交X光片进行放射自显影

pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartGEFmRNANorthernblottinghybridization基因克隆

基因克隆（分子克隆molecularcloning）应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。基因克隆示意图基本步骤提取目的基因:人工基因合成法(RT-PCR)目的基因与载体结合:限制性内切酶、DNA连接酶将目的基因导入受体细胞:转化目的基因的检测和表达:无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物载体（Vector）：是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。

限制性核酸内切酶：切割DNADNA连接酶：生成3’－5’磷酸二酯键原核载体：质粒(pBR322,pUC…）、噬菌