生物量传感器与检测技术医用传感器教学

内容简介生物传感器生物传感器是用生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）作为敏感基元构成分子识别系统，对被测物进行高选择性的识别，通过各种化学和物理换能器捕捉目标物与敏感基元之间的作用，并将作用程度用离散或连续信号表达出来，从而得出被测物的种类和含量的装置。生物传感器的构成一是生物敏感膜(分子识别元件),是具有分子识别能力的生物活性物质，是生物传感器的关键部分，直接决定传感器的功能和质量;二是物理或化学转换器(换能器)，将各种生物的、化学的和物理的信号转换为电信号。主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。生物传感器分类根据生物传感器的信号转换器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、热生物传感器、光生物传感器、声波生物传感器等根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞传感器。7.1生物材料的固定化技术固相生物材料具有一系列优点①热稳性提高；②可重复使用；③不需要在反应后进行催化物质与反应物质的分离；④可以根据已知的半衰期(half—life)确定传感器膜的寿命；⑤能够避免外源微生物对生物功能物质的污染和降解(decay)等。

如果说“一些重要的生命功能都是以生物膜为舞台而展现出来的”，那么也可以说，没有生物功能膜就不称其为生物传感器。

前者是指天然的生物膜，后者指生物传感器分子识别器件，包括各种固定化生物功能膜。固定化的首要目的是将酶等生物活性物质限制在一定的空间，但又不妨碍底物的自由扩散。吸附法所谓吸附法就是依据带电荷的细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力的作用，使细胞固定在载体表面和内部形成生物膜。其可分为物理吸附法和离子吸附法两种。物理吸附法是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、硅藻土、多孔砖、陶瓷片、木屑等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化；离子吸附法是利用微生物在解离状态下离子键合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上。共价法共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共价键连接，从而固定微生物。

许多生物分子，如脂质分子和一些蛋白质分子，在洁净的水表面展开后能形成水不溶性液态单分子膜，小心压缩表面积使液态膜逐渐过渡到成为一个分子厚度的拟固态膜。这种膜以技术的发明者Langmuir和Blodgett命名，称为L—B膜。

六．L-B膜技术

一是酶膜可以制得很薄(数nm厚)，厚度和层数可以精确控制；

二是可以获得高密度酶分子膜。由此可能协调响应速度和响应活性这对矛盾。Tsuzuki等采用L-B技术首次制成GOD电极，基本步骤如下：(1)

使二性化合物在水相上形成单分子膜；(2)

用三甲基氯盐配制的10％的甲苯溶液处理SnO2电极，使其疏水化；(3)

在20mN／m的表面压力下用垂直提升法使单分子膜沉积在SnO2电极表面；(4)

2.5％戊二醛处理单分子膜l小时，使外层引入甲酰基团；(5)

表面甲酰基团与GOD溶液反应1小时，形成单分子GOD膜。7.2经典生物传感器原理与应用一般原理：巧妙地利用了生物活性物质对特定物质所具有地选择性亲和力，即分子识别能力这一特点，来进行识别和测量，并利用电化学反应进行电信号转换，从而实现定量测量。

一．酶传感器的原理一种将酶与电化学传感器相连结的用来测量底物浓度的电极叫做酶电极(或称酶传感器)。

用酶膜和离子选择性电极相结合构成的酶电极,当底物与酶膜作用时，产生单价阳离子H+、NH4+等，为离子选择性电极所测得。可见电极电位与待测物离子浓度的对数成线性关系，由此可定量地检测待测物的含量。迄今使用的电位计式酶电极主要以H+、NH4+电极为基础的。

酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜可以选择性地“识别”被检测的物质，并且催化被“识别”出的物质发生化学反应；变换器则把这一催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，进而通过仪表显示出来。

其原理是当工作电极相对于参考电极维持在一恒定的极化电压时测量输出电流。当工作电极表面上电活性物质还原或氧化时，产生一个电流。该电流在一定的条件下可由下式给出：在合适的极化电压下，电极能产生一个高而平稳的电流--极限电流。极限电流与极化电压无关而与活性物质的浓度成线性关系。

n-分子量F-电荷法拉第常数A-电极面积f-电活性物质到电极的流通量

基本上由酶膜和克拉克型氧电极或过氧化氢电极组成。

通过测定被消耗的氧或生成的过氧化氧来测定葡萄糖的含量

酶传感器的研究重点均放在提高识别分子部位的酶膜特性上。

(1)聚丙烯酰胺凝胶膜对葡萄糖有很大的阻止扩散的能力，薄膜结构比较复杂，反应速度比较慢。(2)胶原膜用包埋法制作，阻止扩散的能力较小，反应速度较快。

(3)在不同类的多细孔膜中间固定的酶，酶被多孔膜覆盖，样品液中的高分子物质不直接与酶接触，延长了酶的寿命。(4)在酶膜上被覆的多孔膜醋酸纤维素、1、8丁氨基—1—氨基乙基辛烷、戊二醛等易使葡萄糖扩散，加快了反应速度。在综合判断酶传感器的检测灵敏度、反应速度、稳定性及使用的简易程度时，两者并无明显的差异。

免疫传感器由于抗体与其分别对应的抗原有选择性结合能力，因此可确立利用抗原、抗体反应的免疫测定法。据此设计的生物传感器称为免疫传感器。

一．非标识免疫传感器

原理：根据红血球中所含的血型物质(凝集素)与血清中血型抗体的结合反应。A、B、O型系统的血型物质为糖脂质，将这些血型物质从红血球中抽提出来调制成抗原膜，抗原膜的膜电位在凝集反应时发生显著变化，从而可容易地判别血型。

(1)竞争的抗原抗体反应

在含有测定对象的抗原样品溶液中，添加一定量的标识抗原。标识抗原与非标识抗原竞争做地在传感器的抗体膜表面上结合，形成抗原抗体结合体。

(2)清除游离的抗原

清洗传感器的抗体膜，清除没有形成抗原抗体结合体的游离抗原。

二．标志免疫传感器

当在红血球或脂质体(双层磷脂结构)等表面存在抗原时，就可能在这些表面形成抗原抗体复合物。由于抗原抗体结合后蛋白构象的改变，暴露了补体的结合点，补体与之相结合，导致红血球或脂质体膜的破裂，使内容物迅速外溢。根据这个原理，如果在红血球或脂质体中将预先用离子电极所检出的标识离子封入，则进行补体反应时，抗原抗体复合物上就会释放出数量众多的标识离子。微生物传感器是一种生物选择性电化学探测器，是由经适当方法培养的细菌细胞(或经固定化的细胞)覆盖于相应的电化学传感器件表面而成。它利用细胞中酶对待测物的水解、氨解或氧化等反应的选择性催化作用，以及电化学传感器元件对反应物的有选择探测，依据反应的化学计量关系，定量地测出底物存在量的信息。用微生物取代酶作为生物活性物质。呼吸活性型微生物传感器由好氧性微生物固定化膜和氧电极组合而成，测定时以微生物的呼吸活性为基础。当微生物传感器插入溶解氧保持饱和状态的试液中时，试液中的有机化合物受到微生物的同化作用，微生物的呼吸加强，在电极上扩散的氧减少，电流值急剧下降。当有机物由试液向微生物膜的扩散活动趋向恒定时，微生物的耗氧量也达到恒定。此时向电极扩散的氧量趋向恒定，得到一个恒定的电流值。可以看出，在此恒定电流值与试液中的有机化合物浓度之间存在着相关关系。代谢活性型微生物传感器测定时以微生物的代谢活性为基础，其结构如图所示。当微生物摄取有机化合物，生成的各种代谢产物中含有电极活性物质时，用安培计(电流法)可测的氢、甲酸和各种还原型辅酶等代谢物，而用电位计(电压法)则可测得二氧化碳、有机酸(氢离子)等代谢物。由此可以得到有机化合物浓度的信息。

把硝酸菌从废水处理设施的硝化槽中分离出来，放在指定的培养液中培养。然后把硝酸菌移到多孔性乙酸纤维膜上固定，接着再把纤维膜覆盖在隔膜氨电极的聚四氮乙烯膜表面上，就制成了氨生物传感器。

原理：肠膜明串珠菌只要缺少微量的苯丙氨酸就不能生长，其代谢产物主要为乳酸。将乳酸氧化酶(LOD)通过共价键固定制备乳酸氧化酶膜，将制得的酶膜固定在氧电极上构成乳酸生物传感器。7.2新型生物传感器原理及应用一．生物芯片的基本概念广义生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄形器件。狭义的生物芯片是微阵列芯片。在被分析样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析。生物芯片基因芯片蛋白质芯片组织芯片细胞芯片其它芯片根据芯片上的固定的探针不同如果芯片上固定的是蛋白，则称为蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA，就是DNA芯片。

某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如：一段8个碱基的寡核苷酸有65，536种排列的可能，通过32个化学步骤，8个小时就能合成65，536个探针。

点样法是将预先通过液相化学合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器（ARD）或阵列点样机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。生物芯片可以进行基因表达检测、寻找新基因、DNA测序、突变体和多态性的检测等，为研究不同层次多基因协同作用提供手段。生物芯片能为现代医学发展提供强有力的手段，可帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为“第二阶段医学”）”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）”上了解疾病的发生、发展过程，以便采取预防及治疗措施。生物芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性评价方面都有其它方法无可比拟的优越性。DNA芯片技术可用于水稻抗病基因的分离与鉴定。组织芯片是新兴的生物高科技技术。它是将数十个甚至数千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列（tissuemicroarray）。

基因芯片和蛋白芯片是为检测同一样本中的不同实验指标而设计组织芯片技术是针对在原位检测不同样本中同一实验指标设计的，是将几十到几百个小组织样本以规则的阵列方式包埋于同一蜡块后，进行切片而制作成的，每张玻片上可同时排列几十到几百例小组织样本，可同时进行同一实验指标的研究。组织芯片的优点：可提高实验效率有助于减少实验误差便于设置实验对照有利于原始存档蜡块的保存右图给出的是美国Zymed实验室研制的人体正常组织芯片，包含30种从不同器官获取的组织样本，每个组织样本直径约为1.5mm。细胞传感器（cell-basedsensor）是生物传感器研究中的一个热点，它利用活细胞作为探测单元，可以测量被分析物的功能性信息。

特点：细胞传感器敏感性高，选择性好，响应迅速，在生物医学、环境监测、药物开发中有广泛的应用。按照能够从细胞获得的信息，我们对细胞传感器进行分类：

（1）监测细胞内外环境的细胞传感器（2）监测细胞电生理状态的细胞传感器（3）监测细胞力学性能的细胞传感器（4）监测细胞特殊性能的细胞传感器（5）利用基因设计的细胞传感器（1）监测细胞内外环境的细胞传感器细胞内生理状态的改变，会引起细胞外代谢物（如离子、生物大分子等）的相应变化。细胞微生理计（microphysiometer）：用建立在硅技术基础上的传感器检测细胞酸化的微环境。细胞由于能量代谢产生酸性物质，使外环境酸化，利用光寻址电位传感器（LAPS）可以测量细胞外微环境的pH值变化，定量计算细细H+排出速率，从而可以分析细胞的代谢率。（2）监测细胞电生理状态的细胞传感器可兴奋细胞，如神经细胞、肌肉细胞、内分泌细胞等，均能产生动作电位响应外界刺激（如光、电、药物等）。直接测量细胞膜电位的基本方法是采用膜片钳（PatchClamp）技术。用微细加工技术制作的平面微电极阵列（MEA）或场效应管阵列应运而生，它能无损、同步地记录多个可兴奋细胞或组织的动作电位的传播。这类传感器不仅可以研究神经元的电生理现象，也能研究细胞间的通讯。MDCK细胞在不同毒素的刺激下，悬臂梁发生不同程度的偏转。实验结果初步表明，这种集成细胞的悬臂梁可以实时监测活细胞的力学性能。

一些细胞对于荷尔蒙刺激会产生移动，某些种类细胞的病毒感染将会引起细胞骨架的变化。

（4）监测细胞特殊性能的细胞传感器有一类独特的细胞传感器，可以用来测量某些细胞的特殊性质，进而研究这些生物体对外界刺激的响应。如基于生物发光的细胞传感器：某些具有发光特性的细菌或用荧光素酶基因设计的细菌，可能对某些重金属产生敏感，基于这种细菌的生物传感器，可以进行环境的监测。如基于细胞色素的细胞传感器，则是诱发色素细胞与酶相关的运动，改变细胞颜色，通过检测颜色变化来测量神经毒素。在加入ISO后，β1-AR

KO细胞的膜外动作电位几乎没有变化，而β2-AR

KO细胞和正常细胞(WT)都有很强的响应，从而证实了ISO的作用靶位是β1-肾上腺素受体。去除细胞上某些可疑受体，即把那些我们认为对某一响应起作用的受体击出，使细胞成为击出（kickout,KO）细胞。任何对击出受体起作用的生物试剂都能在正常细胞中产生响应，在KO细胞中则不能。基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。基因表达检测。实验研究表明芯片技术易于监测非常大量的mRNAs并能敏感地反映基因表达中的微小变化。利用基因芯片技术人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究。寻找新基因。如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技术发现的。DNA测序。芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即是一种新的高效快速测序方法。核酸突变的检测及基因组多态性的分析。有关实验结果已经表明DNA芯片技术可快速、准确地研究大量