兽药残留检测技术抗生素类PPT资料

第六章兽药残留(cánliú)检测技术抗生素类第一页，共96页。一、氨基(ānjī)糖苷类二、四环素类三、氯霉素类四、大环内酯类五、林可霉素类第二页，共96页。一、氨基(ānjī)糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取,或以天然品为原料半合成制取而得的一类水溶性较强的碱性抗生素。包括链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那毒素、阿米卡星、阿布拉霉素、斑伯霉素、妥布霉素、壮观霉素等,结构式见图。由于其分子结构中都有一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子,由配糖键相连接,因此最好称为(chēnɡwéi)氨基糖苷-氨基环醇类(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素,但因氨基糖苷类抗生素这一名称沿用已久，故仍用此名。氨基(ānjī)环醇氨基糖氨基糖第三页，共96页。从抗菌作用的特点看,氨基糖苷类是一类较优良的抗生素,然而,该类药物的治疗浓度范围窄,不良反应较常见,主要为肾毒性、耳毒性、神经肌肉阻滞、造血系统毒性反应和过敏性反应,其中有些是不可逆毒性。氨基糖苷类肌肉注射或静脉滴注吸收,内服后不吸收或很少吸收。与血浆蛋白结合很少,主要分布(fēnbù)在细胞外液。肾脏皮质内药物浓度可超过血药浓度10~50倍,也可进入内耳外淋巴液,其半衰期较血浆半衰期长5~6倍。氨基糖苷类药物在体内几乎不被代谢，约90%以原形经肾小球过滤排出,尿药浓度极高,约为血浆峰浓度的25~100倍。靶组织(zǔzhī)检测(jiǎncè)物第四页，共96页。例如(lìrú)：卡那霉素卡那霉素对耳毒性、肾毒性的发生率较高,仅次于新霉素。卡那霉素肌注,1h血药浓度达峰值,血浆(xuèjiāng)蛋白结合率很低。用药后24h内有90%的药物经肾以原形排泄。卡那霉素可透过胎盘进入羊水和胎儿循环中,在牛奶中可检测到。牛、羊、猪肌注,1日5~10mg/kg,分为2次给予,间隔12h,36h后牛奶中观测不到卡那霉素残留,肾脏中药物滞留期长。靶组织(zǔzhī)检测物第五页，共96页。链霉素、双氢链霉素链霉素和双氢链霉素对肾毒性反应稍轻,但可引起神经性紊乱,如听力减退、耳鸣或耳部胀滞、眩晕、麻木、针刺感、面部灼伤感;偶可发生生理力减退、皮疹、乏力、呼吸困难等。链霉素和双氢链霉素内服吸收差,大部分(bùfen)以原形随粪便和尿液排出。牛、羊、马肌注后,血药浓度于1h达到峰值。一次肌注有效浓度可维持12h。24h内,30%~90%的药物以原形经肾排出。注射部位和肾脏中链霉素残留滞留期较长,其他可食部分(bùfen)残留量低,停药期不必很长。乳牛肌注双氢链霉素后不久,乳汁中残留量很低,在间。乳房注入不吸收,药物滞留期应予注意,以免乳汁中残留超标。靶组织(zǔzhī)第六页，共96页。壮观霉素、新霉素壮观霉素毒副作用较小,无明显的耳毒性,但可引起肝、肾和血液(xuèyè)系统紊乱,偶可发生过敏性反应。壮观霉素主要以原形药物由肾排泄,半衰期约为。肝和肾中代谢物主要为双氢壮观霉素和壮观霉素。肝和肾中药物残留量高,滞留期约15天。新霉素几乎不被胃肠道吸收,乳腺很少吸收。药物不经胃肠道给予,体内药物生物转化很小。内服大部分以原形随粪便排出,注射吸收迅速,很快随尿液排出。新霉素在动物可食部分、鸡蛋、牛奶中药物滞留期长应予注意。靶组织(zǔzhī)靶组织(zǔzhī)第七页，共96页。（一）样品(yàngpǐn)处理与蛋白质和脂类等混杂较强极性多羟基碱性水溶性不挥发氨基糖苷类抗生素性质用塑料(sùliào)器皿盛放难以(nányǐ)用有机溶剂提取脱脂除蛋白液液萃取在水相中或加入离子对试剂进入有机相阳离子交换吸附剂进行固液萃取第八页，共96页。生物(shēngwù)样品预处理生物样品预处理是除去混杂物以免污染色谱柱和干扰氨基糖苷类的分离、分析。样品的预处理包括脱脂除蛋白(dànbái)、提取、净化和样品浓缩。生物样品中氨基糖苷类药物仍具有水溶性质,难以用有机溶剂提取,因此首先必须用蛋白(dànbái)沉淀剂或固相萃取柱除去生物组织(如蛋白(dànbái)质、脂肪等)。含脂高的生物样品一般在提取前先除去脂类。体液样品脱脂可采用离心或正己烷提取。固态样品(如肌肉、肾、肝)处理相对复杂些,包括匀浆、提取/脱脂等步骤。第九页，共96页。除蛋白(dànbái)的方法：一是沉淀法,即在样品(yàngpǐn)溶液中加入甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。二是酸提取法,即在样品(yàngpǐn)中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质,将生物样品(yàngpǐn)与酸溶液混匀或一起均质。某些情况下,如测定肾脏中阿布拉霉素,还需用浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解,保证有较好的样品(yàngpǐn)回收率。蛋白水解包括酸解法或碱解法,上清液再经中和。三是超滤法,经超滤法处理后的样品(yàngpǐn)不会引入新的盐类污染及假色谱峰。四是固相萃取法,这是近年来在残留分析中应用最广的一种快速、简便的除蛋白方法。第十页，共96页。1、提取(tíqǔ)用高或低的pH值介质可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。酸性(suānxìnɡ)介质：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-柠檬酸或甲醇-高氯酸溶液与样品一起均质、提取。碱性介质：如甲醇-氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布拉霉素。食品中氨基糖苷类药物的提取,可加入碱性缓冲液,并加热脱去蛋白,达到提取的目的。第十一页，共96页。2、净化(jìnghuà)净化方法包括(bāokuò)液-液分配、固相萃取和基质固相分散技术(MSD)、在线痕量富集法等。有时为了达到更好的净化效果,通常将几种方法结合应用。液-液分配是将干扰组分从水相直接转移至有机相中。由于氨基糖苷类的高极性,在pH范围内不能被提取到有机相中,仍留在水相中。唯一例外的是阿布拉霉素,在辛烷磺酸离子对试剂介质中,可以用乙酸乙酯进行提取,提取回收率约90%。第十二页，共96页。固相萃取法是近年发展起来的一种更有效、迅速和方便的提取及除蛋白方法。氨基糖苷类药物的浓缩和净化采用阳离子交换吸附剂较为理想,如CM-SephadexC-25、AmberliteCG-50、苯磺酸基、羧基阳离子交换柱等。正相或反相色谱吸附剂也能对样品进行提取和净化,如C18固相萃取柱净化时,提取液中预先加入适当庚烷磺酸离子对试剂,以提高氨基糖苷类抗生素的保留能力。基质固相分散技术应用(yìngyòng)相对较少第十三页，共96页。柱切换技术(jìshù)：采用在线痕量富集技术(jìshù)对初提取液进行净化,在含离子对试剂的流动相中,预柱(C18柱)对链霉素和双氢链霉素进行富集,干扰组分被淋洗除去,最后待测物被洗脱进入分析柱中。与预富集过程相反,在酸性流动相中,阳离子交换柱对干扰组分有吸附作用，不被保留的壮观霉素直接进入分析柱进行分离检测。第十四页，共96页。（二）分析方法1、气相色谱法气相色谱已被用于测定血清中的庆大霉素、妥布霉素、萘替米星和丁胺卡那霉素。样品脱蛋白和脱水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步衍生化,然后用电子捕获检测器（ECD）检测。还有报道(bàodào)采用三氯乙酸提取和离子交换净化的方法测定牛肉组织中的卡那霉素,提取液用七氟丁酰咪唑衍生化,随后用三甲基硅烷化,GC/ECD检测,回收率为74%~86%,检测限为。第十五页，共96页。2、液相色谱法氨基糖苷类药物可采用阳离子交换色谱柱或非极性反相色谱柱分离(fēnlí)。由于氨基糖苷类药物的极性和离子特征,它们在阳离子交换柱上的分离(fēnlí)效果较佳,在反相色谱柱上不易分离(fēnlí)。但在反相色谱分离(fēnlí)中,流动相中加入离子对试剂如磺酸钠或五氟丙酸,可以改善它们在C18柱上的分配性能。也可在反相柱分离(fēnlí)前,将氨基糖苷类药物衍生化,使极性下降,以改善其在色谱柱上的分配性能。使用C8和C18分离(fēnlí)柱,流动相一般由醋酸盐缓冲液和甲醇或乙腈组成,加入离子对试剂可以改变出峰顺序和改善峰形。第十六页，共96页。高效凝胶渗透色谱法亦应用于牛奶中氨基糖苷类药物的测定。利用蛋白排阻柱(Hisep)选择性地保留(bǎoliú)新霉素(进入凝胶孔穴中),而蛋白质分子不能进人凝胶的孔穴中,随流动相由固定相间隙通过色谱柱而不被保留(bǎoliú),达到分离的目的。第十七页，共96页。检测器紫外或荧光衍生化检测方法有荧光检测、电化学检测、示差折光检测和质谱检测。大部分氨基糖苷类分子中含-NH2基团,能与邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯、1-氟-2,4-二硝基苯(FDND)等反应,形成稳定的荧光产物。最常用的以邻苯二甲醛为衍生剂,采用柱前或柱后荧光衍生化。柱前衍生反应可在溶液中进行,亦可在离子交换(lízǐjiāohuàn)柱或硅胶柱的净化过程中进行。柱后衍生需要柱后衍生装置。第十八页，共96页。例子：荧光衍生化HPLC法测定牛奶(niúnǎi)中庆大霉素的四种主要组分取10mL牛奶样品于4℃中离心,弃去上层(shàngcéng)脂肪层,加入1mL30%三氯醋酸,离心,上清液过C18固相萃取柱,用水、水-甲醇(1+1)和甲醇淋洗,最后用16%氢氧化铵的甲醇溶液洗脱,洗脱液挥发至干,用水溶解残余物,取部分提取液加入离子对试剂戊磺酸,进样分析。色谱柱为SpherisorbODS2(15cm,5µm),以水-甲醇(82+18)含0.1%醋酸、硫酸钠和11mmol/L戊磺酸作流动相,邻苯二甲醛柱后衍生,荧光检测,检测限为15µg/kg。第十九页，共96页。二、四环素类四环素类(Tetracyclines)抗生素是一类碱性广谱抗生素。包括从链霉菌属培养物提取的四环素、土霉素、金霉素以及多种半合成四环素如强力霉素、美他霉素、米诺环素等。四环素类早在20世纪的60~70年代即广泛应用,在兽医上尤为滥用,以致细菌对四环素类的耐药现象颇为严重,一些常见(chánɡjiàn)病原菌的耐药率很高。四环素、土霉素等盐类,内服能吸收,但不完全,而四环素碱、土霉素碱吸收更差。第二十页，共96页。四环素内服吸收不完全,约为30%~70%。血药浓度较土霉素略高,对组织的透过率亦较高。蛋白结合率65%。在胆汁中浓度可达血清浓度的5~20倍,可透入胎盘进入乳汁。水牛(shuǐniú)、黄牛、猪一次静脉注射盐酸四环素的半衰期分别为、、。休药期:牛5日,猪5日,鸡2日。第二十一页，共96页。土霉素内服易吸收,但不完全。一次内服后,一般2~4h达血药峰浓度,牛因部分药物进入瘤胃后延缓吸收,需4~8h才达峰浓度。吸收后广泛分布于肝、肾、肺等组织和体液中,易渗入胸水、腹水、胎畜循环及乳汁中。主要以原形从尿中排出。一部分在肝脏(gānzàng)胆汁中浓缩,排入肠内,部分再被吸收,形成“肝肠循环”。肾功能减退时可在体内蓄积。第二十二页，共96页。（一）样品(yàngpǐn)处理四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团:二甲胺基[-N(CH3)2]、酰氨基(-CONH2)、酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统。本类抗生素是两性(liǎngxìng)化合物,分子中存在酚羟基和烯醇型羟基,显弱酸性;同时含有二甲胺基,显弱碱性,故遇酸及碱,均能生成相应的盐。四环素类抗生素的游离碱,在水中的溶解度很小,其溶解度与溶液的pH值有关,在之间时难溶于水,但若酸性或碱性增强,则溶解度增加。当pH值低于4或高于8时,可以得到高浓度的四环类化合物的水溶液。其盐类在水中会水解,当溶液浓度较大时,会析出游离碱,酸度大时能防止水解。第二十三页，共96页。由于四环类抗生素的分子内含有蒽酮类发色团,一般为黄色结晶性粉末,在270~360nm处有强的紫外吸收。四环类抗生素在碱性溶液中,C环打开,生成无活性的具有内酯类结构的异四环素。若在强碱性溶液中加热,几乎(jīhū)可以定量转化为异四坏素类产物,具有强烈荧光。液体样品(如牛奶)一般通过离心去除部分蛋白和颗粒,再用乙酸盐、磷酸盐、McⅡvaine或McⅡvaine/EDTA缓冲液稀释。组织样品(肌肉、肾脏、肝脏)提取前,样品需要剁碎或均质。第二十四页，共96页。1、提取(tíqǔ)从生物样品(yàngpǐn)中分离四环素类比较复杂,因为这类药物易与金属离子形成螯合物,以及与组织中的蛋白强烈结合,因此须用强酸或酸性脱蛋白剂进行提取。然而,在酸性条件下(pH＜2.0),四环素类药物降解为脱水物,加热时又可转变为差向异构体。因此,提取时最好用含有EDTA、琥珀酸盐、草酸等螯合剂的弱酸性溶剂。常用的弱酸性溶剂有EDTA-McⅡvaine缓冲液(pH4.0)、琥珀酸盐缓冲液(pH4.0)、酸化乙腈、酸化甲醇。另外,三氯乙酸(pH2.0)、柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)、柠檬酸盐缓冲液/乙酸乙酯(pH4~5)和盐酸/甘氨酸缓冲液亦用于样品(yàngpǐn)的提取和沉淀蛋白质。其他提取方法包括用含苯丁唑酮离子对试剂的二氯甲烷提取蛋中四环素类药物,超滤法提取牛奶、猪组织中四环素类药物。酸提取(tíqǔ)法+金属螯合剂第二十五页，共96页。2、净化(jìnghuà)初提取液中含大量的内源性干扰杂质,还需要净化处理,包括液-液萃取、固相萃取(SPE)、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等方法。为达到更好的净化效果,可将几种方法结合使用(shǐyòng)。（1）液-液萃取：四环素类药物不溶于二氯甲烷等疏水性有机溶剂,因此液-液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质洗去。但有四丁基铵离子对试剂存在时,二氯甲烷可直接提取水相中(pH8.2)的土霉素和四环素,其萃取率达85%以上。第二十六页，共96页。（2）固相萃取(cuìqǔ)(SPE)由于四环素类不易从水相进入有机相,可采用固相萃取柱净化。常用的SPE柱固定相为C18、多聚类和环己基填料。采用硅胶基质的SPE柱时,四环素类易与固定相的硅醇基发生吸附,可通过加入EDTA等硅醇基阻断剂来解决,并在淋洗液中加入草酸。将反相柱与阳离子交换柱串联使用,或使用混合填料的SPE柱,如C18与CM-SephadexC-25、苯磺酸型、羧酸型阳离子交换树脂(shùzhī)混合,可以提高净化效率。基质固相分散法采用C18吸附剂,已用于牛奶中的四环素类的提取和净化,加入等量的EDTA和草酸,可缩短提取时间。第二十七页，共96页。超滤和免疫亲和色谱法亦被用于牛奶样品的提取和净化。柱切换技术(jìshù)：有人采用金属螯合亲和柱作为富集柱(Anagel-TSKChelate-5PW),通过柱切换,在线浓缩净化动物组织和蛋中四环素类药物。第二十八页，共96页。（二）分析方法生物样品中四环素药物的含量(hánliàng)测定方法,除有微生物测定外,主要还有荧光分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等。第二十九页，共96页。1、荧光(yíngguāng)分光光度法四环素类抗生素本身在盐酸液中有微弱荧光,若将它们转变为脱水物,能使荧光强度增强。若在一定pH条件下,使脱水物与铝盐络合,形成的络合物具强烈荧光,可用于含量测定。由于本法灵敏度高(0.1mg/L),线性范围(fànwéi)在0~5mg/L间,适用于血浆中四环素类抗生素的测定。第三十页，共96页。血浆(xuèjiāng)中四环素的测定取血浆(xuèjiāng)2.0mL,加三氯醋酸液0.6mL,振摇,离心(3500r/min)5min,取上层液1.6mL,加盐酸液0.5mL,某中含有β-硫代丙酸1.0g/L;溶液于100℃加热10min后,立即将试管浸入冷水中冷却,加枸橼酸缓冲液(1L溶液中含枸橼酸125g和10mol/L氢氧化钠液160mL)1.0mL,然后加三氯化铝液0.5mL,振摇并在室温放置15min,于485nm处激发,555nm处检测荧光强度。第三十一页，共96页。四环素在pH5的条件下,与Al3+以1:1的定量关系形成具有强烈荧光的络合物,该络合物至少能稳定1h;试剂中加β-TPA,能增强四环素对光的稳定性,β-TPA为抗氧剂。该法适用于血浆中其他(qítā)四环类抗生素的测定。Gala等报道了荧光分光光度法筛选测定牛奶中四环素药物。Poiger等测定了组织中三种四环素类药物。Salinas等报道了一种4步荧光衍生化,荧光分光光度法测定蜂蜜中土霉素残留量。第三十二页，共96页。2、薄层(báocénɡ)色谱法薄层色谱法设备简单(jiǎndān),操作方便,可作为四环素类的筛选方法。薄层板一般采用硅胶板或C8板。硅胶板遍常以ETDA-2Na(pH7.0)-乙酸乙酯-氯仿-丙酮溶液作展开剂,C8板用含草酸的流动相展开;展开后,取出薄层板,晾干,检测方法包括生物自显影法(枯草杆菌)和分光光度法。荧光分光光度检测采用氯化镁和三乙胺显色,紫外分光光度检测采用快蓝BB和吡啶显色。第三十三页，共96页。3、毛细管电泳(diànyǒnɡ)法Chen等报道了毛细管电泳法测定牛奶中4种甲环素类药物。样品用金属螯合柱提取,洗脱液过C18固相萃取柱,乙醇洗脱,开管石英(shíyīng)毛细管柱(57cm×75µm)分离,电泳电压23kV,温度23℃,电泳液含10mmol/L十二烷基磺酸钠、50mmol/L硼酸盐和50mmol/L磷酸盐,pH8.5,紫外检测波长370nm,四环素类的检测限1.3~5.6ng/mL,定量检测限。第三十四页，共96页。4、高效(ɡāoxiào)液相色谱法HPLC法是四环素类药物残留分析最常用的方法,但采用硅胶基质的色谱柱时,常遇见两个问题:一是四环素类可与色谱系统中的金属离子形成螯合物,色谱行为差;二是四环素类与固定相发生吸附,造成峰形不对称(duìchèn),灵敏度下降。前者可通过加入EDTA解决,后者可通过对柱填料进行硅烷化或加入季铵盐等硅醇基的阻断剂来解决。亦可采用含金霉素的流动相预先淋洗过夜,金霉素作为硅醇基的阻断剂,以消除土霉素和四环素的峰形拖尾现象。第三十五页，共96页。土霉素、四环素和强力霉素在酸性水溶液中,268nm、270nm和269nm处有最大吸收,在350~370nm处亦有强的紫外吸收,检测灵敏度可达µg/kg水平。由于四环素类分子中含有两个共轭双键,因此在紫外光照下能产生荧光,它们的降解产物也具有荧光性质,可供测定。但四环素类的荧光检测更多的采用柱后荧光衍生化测定。例如,以二氯化氧锆作荧光衍生剂,柱后荧光检测组织中的四环素类药物残留,灵敏度可达pg水平,具有高的灵敏度和选择性。电化学检测具有高的灵敏度,但应用相对较少。质谱检测可提供化合物的结构信息,在残留分析(fēnxī)中作为确证分析(fēnxī)方法。第三十六页，共96页。HPLC法测定牛奶(niúnǎi)中土霉素和四环素取5mL牛奶样品,用硫酸调节至pH2.7,用10mL乙腈提取,吹干,用2mL磷酸盐缓冲液溶解,加入四丁基铵离子对试剂,二氯甲烷提取,再用高氯酸抽提。C18柱(25cm×5µm)分离(fēnlí),使用前用含金霉素的流动相淋洗过夜,以磷酸-乙腈(76+24)作流动相,流速1.2mL/min,柱温35℃,紫外检测波长355nm。在上述条件下,样品色谱图见图,可检测到牛奶样品中土霉素和四环素浓度10ng/mL。第三十七页，共96页。HPLC法测定牛和猪的组织(zǔzhī)与血清中的四环素取25g组织样,加3倍体积的1mol/L盐酸,血清中加入1倍体积的1mol/L盐酸,匀浆,取匀浆8mL加人(jiārén)乙腈32mL涡旋混合,静置后滤过,收集滤液20mL,加人(jiārén)二氯甲烷20mL和石油醚20mL,用力振荡,取水层200µL进样。色谱柱为PRR1柱(25cm×4.1mm,10µm),流动相为磷酸-甲醇(80+20)和0。01mol/L磷酸-乙腈-甲醇(30+50+zO),梯度淋洗,流速1mL/min。紫外检测波长355nm。在上述条件下,方法回收率:肌肉,92.7%;血清,99.5%。检测限:土霉素、四环素,10ng;金霉素,20ng。第三十八页，共96页。柱切换(qiēhuàn)技术采用柱切换技术,金属螯合亲和柱在线浓缩/净化动物组织和蛋中四环素类药物,分离测定土霉素、四环素、地美环素和金霉素残留量。取2g蛋样或组织样,用pH5的柠檬酸盐缓冲液(鸡肝,pH4)和乙酸乙酯均质,离心,上清液挥发至干,用甲醇溶解,注入Anagel-TSKChelate-5PW金属螯合亲和柱,通过(tōngguò)柱切换,将富集的分析物洗脱至分析柱(PLRRS,15cm×5µm)中进行分离,流动相为磷酸二氢钾柠檬酸和乙腈-甲醇-1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH4)(25+10+65),梯度淋洗:10min内从(100+0)到(0+100),350nm紫外检测,组织和蛋中检测限:土霉素3µg/kg、四环素5µg/kg、地美环素5µg/kg、金霉素6µg/kg。第三十九页，共96页。采用金属螯合亲和柱净化,LC分离测定牛奶中四环素类药物残留量。取牛奶样品于10℃离心15min,分离乳油,加入琥珀酸钠10mL,混匀后离心,上清液过金属螯合柱(已用Cµ2+处理过),洗脱液再过ENVⅠChromP固相萃取柱净化;色谱柱为PLRP-S柱(15cm×4.6mm,5µm),以甲醇-5mmol/L草酸溶液作流动相,梯度洗脱,流速1mL/min,紫外检测波长355nm。在上述条件下,保留(bǎoliú)时间:土霉素、四环素、金霉素15.7min;检测限﹤5ng/mL。第四十页，共96页。庞国芳等建立了一种HPLC法同时测定(cèdìng)禽肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的分析方法。Long等报道了基质固相分散-LC法测定(cèdìng)奶中土霉素、四环素、金霉素残留量。Wan等报道了一种新颖的化学发光检测-HPLC法测定(cèdìng)蜂蜜中四环素类(土霉素、四环素、美他环素)残留。Pena等采用柱后荧光衍生化LC测定(cèdìng)奶中土霉素、四环素和金霉素残留量,添加样品的回收率大于80%,在内可分析10个样品,方法灵敏、快速、可靠,满足残留检测的要求。Pena等采用LC荧光检测法测定(cèdìng)蜂蜜中土霉素和四环素残留量。第四十一页，共96页。Oka等最先报道(bàodào)了快速原子轰击LC-MS测定蜂蜜中四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的方法,后来用热喷雾电离LG-MS分析四环素类药物。Carson等报道(bàodào)了LC-MS法测定虾、牛奶中四环素类多残留的分析方法。张纯萍等报道(bàodào)了牛奶中四环素类药物的HPLC-MS/MS法。Goto报道(bàodào)了一种电喷雾串联质谱法对动物组织中四环素和青霉素类抗生素的高通量分析方法,可同时检测肌肉组织中土霉素、四环素、金霉素、青霉素G、氨比西林和萘呋西林残留。第四十二页，共96页。三、氯霉素类氯霉素类属酰胺醇类广谱抗生素,包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，后两者为氯霉素的衍生物。由于分子(fēnzǐ)中存在两个不对称碳原子,故有四个立体异构体。在这些异构体中,惟具左旋性的D-(-)-苏阿糖型有制菌活性。第四十三页，共96页。氯霉素氯霉素是一种广谱抗生素,具有良好的抗菌和药理特性,被广泛应用于各类家禽、家畜、水生动物(鱼、虾等)及蜜蜂(mìfēng)等动物的各种传染病的防治。但是氯霉素对人有严重的副作用,可导致再生障碍性贫血。、欧盟等国规定在动物源食品中不得检出氯霉素。第四十四页，共96页。氯霉素口服吸收良好(liánghǎo),在体内分布广泛,可进人胸水、腹水、滑膜液和玻璃体内。脑组织中药物浓度可高于血清浓度几倍,但脑脊液药物浓度只为血清浓度的1/2。可透过胎盘,并进入乳汁。在胆汁中含量较低,有一半以上药物在肝、肾和血清中与葡萄糖醛酸结合失活,肌肉中呈游离态。氯霉素肌内注射后在注射部位蓄积,吸收比内服慢(反刍动物除外),牛在2~12h产生并维持有效血浓度。琥珀氯霉素的水溶性强,注射后吸收迅速,给母牛一次肌注50mg/kg,其血药峰浓度较同量氯霉素高6倍,消失也较快。第四十五页，共96页。氯霉素注射后迅速进入肠肝循环,药物(yàowù)作用时间较长,数周内都可以检出药物(yàowù)的残留。例如,山羊肌注后残留量降到时,注射部位需要14天,非注射部位肌肉6天,脂肪9天,肝和肾11天。氯霉素在肝脏中的主要代谢产物为氯霉素-葡萄糖醛酸结合物、氯霉素碱、氯霉素醇和氯霉素草氨酸盐。肝中生物转化后,大部分随尿液排出。第四十六页，共96页。甲砜霉素甲砜霉素抗菌谱和抗菌作用与氯霉素相仿,体外抗菌作用比氯霉素略差。但体内比氯霉素强,具有较强的免疫抑制作用,是氯霉素的2.5~5倍。主要抑制细菌蛋白质合成和抑制抗体的生成,在畜牧业中用于预防和治疗牛、家禽呼吸道和肠道疾病。内服或注射吸收快而完全,给药后2h血药浓度达峰值,胆汁中浓度可为血药浓度的4倍。连续用药在体内无蓄积现象。甲砜霉素吸收后在体内分布广泛,以肾、脾、肝、肺等中的含量较多,比同剂量的氯霉素约高3~4倍。甲砜霉素在体内很少代谢,兔和鼠中90%以上药物以原形自尿中排出(páichū),部分自粪便中排出(páichū),但在猪中葡萄苷酸化相对较高。第四十七页，共96页。氟苯尼考氟苯尼考是氯霉素的第二代替代品,其结构与甲砜霉素相似,但抗菌活性、抗菌谱及不良反应方面明显优于甲砜霉素,其抗菌能力可达甲砜霉素的10倍之多。氟苯尼考在动物胃肠道内吸收良好。氟苯尼考在动物体内主要代谢产物是氟苯尼考胺(Flµrfenicolamine,FFA)和氟苯尼考醇。残留监控中把FFA作为鱼组织中氟苯尼考的标志残留物。氟苯尼考内服吸收良好,在动物体内呈全身性分布,但各组织器官药物浓度不同(bùtónɡ)。血液和肌肉中药物浓度相近,脑中药物浓度较低,胆汁中浓度高,且有较高的内服生物利用度(猪109%、犊牛88%、肉仔鸡55%),预示存在肠肝循环。在肾和眼球脉络模中有蓄积作用,说明氟苯尼考及其代谢物可能与黑色素结合。氟苯尼考主要经肾排泄,犊牛静脉注射和内服后分别有50%和65%的原药从尿排出,少量经粪便排出。第四十八页，共96页。（一）样品(yàngpǐn)处理液体样品(yàngpǐn)(如牛奶)通过离心脱脂,用水稀释后再经固相萃取柱净化。组织样品(yàngpǐn)(肌肉、肾脏、肝)在提取前,需要将样品(yàngpǐn)粉碎或均质。氯霉素有一半以上药物在肝、肾和血清中与葡萄糖醛酸结合,故用葡糖苷酸酶水解,释出游离的氯霉素,但在猪、鸡和牛肌肉组织中未发现有葡萄糖醛酸结合。第四十九页，共96页。1、提取(tíqǔ)组织样品的提取/脱蛋白一般用乙酸乙酯和乙腈。乙腈适合氯霉素类三种药物(yàowù)的同时提取,但其提取效率不及乙酸乙酯。其他有机溶剂/无机溶剂有丙酮、甲醇、乙醚、乙酸异戊酯、三氯乙酸、磷酸盐缓冲液(pH7.8)、水和尿素溶液。第五十页，共96页。2、净化(jìnghuà)初提取液净化可采用液-液分配、透析、固相萃取、基质固相分散、免疫亲和色谱、液相色谱和在线富集技术等。液-液分配是将水相中的药物提取到有机相中,或是(huòshì)将水相或有机相中的内源性干扰杂质洗去。乙酸乙酯提取水相中氯霉素类药物,提取率较乙醚等其他有机溶剂高。水相中加入氯化钠使浓度为3%~4%,可以提高乙酸乙酯的萃取效率,尤其对甲砜霉素和氟苯尼考效果更为明显。第五十一页，共96页。样液脱脂可用正己烷、石油醚、异丙酮和甲苯等有机溶剂,但在分析氯霉素和氟苯尼考时,尽量避免使用甲苯,因为在液-液分配过程中,部分药物会转化成甲苯。由于液-液分配过程中易产生乳化现象,导致样品损失,有人改用硅藻土小柱浓缩、净化样品,避免了液-液分配中的乳化现象,同时提高了萃取效率。除蛋白和杂质亦可采用基质固相分散技术(jìshù)(MSPD)和透析法。MSPD在净化肌肉组织和奶样中氯霉素时,用C18作为吸附剂。透析法用于牛奶样品中氯霉素的测定时,先用乙酸乙酯提取样品,提取液经透析膜选择性透析,使药物分子从基体中分离出来,达到与蛋白质及其他杂质分离的目的。第五十二页，共96页。提取液净化一般采用固相萃取(cuìqǔ)法,最常用的吸附剂为反相吸附剂如C18。C18固相萃取(cuìqǔ)柱净化样品,回收率高,但在许多情况下,C18柱净化后,再用C18分析柱分离,可能某些杂质与分析物一同出峰,干扰组分的测定。极性吸附剂如Florisil和氧化铝亦被用于组织样品的净化。组织样品经Florisil小柱净化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率为82.6%、75.4%、79.1%,而氧化铝小柱净化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率为75.8%、65.6%、63.4%。因此Florisil柱净化后得到的回收率要比氧化铝柱高,并且在除脂类杂质方面效果更好。免疫亲和柱具有高的专一性,vandeWater首先采用免疫亲和柱纯化猪肌肉和牛奶样品中的氯霉素。Moretti等应用柱切换技术,用免疫亲和柱在线纯化浓缩牛奶和猪肉中氯霉素。第五十三页，共96页。vanGinkel等采用LC法纯化牛肉和蛋中氯霉素,分离柱为LiChrosorbDiol柱。Tjaden等通过(tōngguò)柱切换技术,用反相柱在线纯化浓缩猪肾中氯霉素。Hµmmert等采用蛋白排阻色谱柱(Hisep)在线浓缩动物组织中氯霉素,通过(tōngguò)柱切换,洗脱剂将浓缩后的氯霉素洗脱至SµpelcoLC-18预柱中,再洗脱至分析柱中分离。第五十四页，共96页。（二）分析方法生物样品中氯霉素类的分析主要采用(cǎiyòng)色谱法,包括薄层色谱法、液相色谱法和气相色谱法。表列出了部分氯霉素类药物残留的分析条件。第五十五页，共96页。1、薄层(báocénɡ)色谱法薄层色谱法(TLC)测定食品中氯霉素类药物的文献很少。TLC法样品处理繁琐,显色过程复杂,方法重复性和灵敏度低,目前(mùqián)已很少应用。第五十六页，共96页。猪肉(zhūròu)中氯霉素的TLC测定方法样品用乙酸乙酯提取,离心分离,正己烷脱脂,然后用硅胶柱净化,依次用乙酸乙酯-正己烷(3+1)、乙腈-甲醇(95+5)淋洗柱子,用丙酮-正己烷(2+1)洗脱,洗脱液浓缩后,用50µL甲醇溶解,点样,以乙酸乙酯-正己烷(2+1)为展开剂,展开后,晾干,斑点进行衍生化:先喷氯化锶溶液,烘干后再喷氢氧化钠溶液,烘干,喷硼氢化钠溶液,烘干,最后用荧光胺显色,置紫外光(366nm)下检视,供试液如显杂质斑点,与对照溶液的主斑点比较,不得(bude)更深,该方法测定低限为。氯霉素斑点的检测亦可采用枯草杆菌的生物自显影法。第五十七页，共96页。2、气相色谱法氯霉素类药物为高极性、难挥发的化合物,须对它们的极性官能团进行酯化、硅烷化或酰化,生成热稳定和易挥发的衍生物,才能用GC或GC-MS进行测定。由于氯霉素类药物都有羟基,通过三甲基硅烷化(TMS)可以定量衍生,生成易挥发和热稳定的硅烷化衍生物。常用的硅烷化试剂有N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲硅基-N,N-二甲基氨基甲酸酯、六甲基二硅氧烷(HMDS)、六甲基乙硅氧烷-三甲基氯硅烷的吡啶(bǐdìng)溶液和N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)。七氟丁酸酐与羟基反应,生成酯类衍生物,用于牛奶中的氯霉素测定。第五十八页，共96页。由于氯霉素类分子中有吸电子的卤素,用电子捕获检测(jiǎncè)器检测(jiǎncè),具有高的灵敏度和专一性,检测(jiǎncè)限可达0.1~5ng/g。GC-MS法检测(jiǎncè)可提供化合物的结构信息,被用于动物源食品中氯霉素类残留的确证分析,质谱采用化学电离源接口。氢火焰离子检测(jiǎncè)器(FID)也可用于氯霉素和甲砜霉素的检测(jiǎncè),但灵敏度低且专一性差,通常仅作为GC-MS的辅助检测(jiǎncè)手段。第五十九页，共96页。牛奶(niúnǎi)中氯霉素类多残留的GC测定方法以间硝基氯霉素作内标物。牛奶样品用乙腈提取,离心,上清液浓缩至干,用水溶解残余物,过C18固相萃取柱,用甲醇-水(60+40)溶液洗脱,洗脱液挥发至干,用N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)试剂衍生化,加人甲苯(jiǎběn)和水,终止衍生反应,离心,有机相进样分析,色谱柱为OV-1石英毛细管柱(30m×0.25mm),载气为氦气,电子捕获检测器检测,可检测到牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量5µg/kg。第六十页，共96页。3、液相色谱法氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都有很强的紫外吸收,因此可直接用HPLC/µV检测。分析柱多采用C18或C8柱。一般来说C8柱用于分析那些在C18柱上不能很好保留的化合物。由于(yóuyú)C18柱可以很好地分离氯霉素和甲砜霉素,因此C18柱应用更广,流动相主要是甲醇或乙腈与磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。氯霉素的检测波长可选择214nm、254nm或278nm。在214nm氯霉素的检测灵敏度最高,但样品提取液的色谱图上会有许多内源性化合物的干扰峰,在278nm检测氯霉素时干扰峰较少。甲砜霉素和氟苯尼考在224nm、225nm或230nm进行检测。第六十一页，共96页。LC法测定猪肌肉(jīròu)中氯霉素试样中加入乙酸乙酯,超声提取,加入无水硫酸钠脱水,加入适量正己烷,过硅胶柱净化,用少量正己烷淋洗,再用甲醇洗脱氯霉素,洗脱液浓缩至干后用流动(liúdòng)相溶解,进样分析,色谱柱为Li-ChromspherC18柱(100mm×3.0mm,5µm),流动(liúdòng)相为乙酸钠缓冲液(0.01mol/L,pH4.3)-乙腈(75+25),检测波长280nm,样品添加浓度10~50µg/kg的平均回收率为79%。第六十二页，共96页。采用(cǎiyòng)柱切换技术,反相色谱法测定猪肾中氯霉素残留量样品用乙醚提取,提取液用氮气吹干,加入2mL乙腈和3mL石油醚溶解残余物,乙腈相吹干后,残余物用流动相溶解,进样。第一柱为Li-ChromspherC18柱(100mm×3.0mm,5µm),第二柱为PRP-l柱(100mm×3.0mm,5µm),检测波长(bōcháng)280nm,流动相为乙腈-水(90+10),方法检测限小于0.01µg/g,添加浓度在125µg/kg时的回收率为狃41.7%。第六十三页，共96页。LC法测定黄鳝(huángshàn)肉中氟苯尼考胺(FFA)的残留量样品先酸解(样品酸解可以将氟苯尼考及其代谢物转化为FFA,并从组织中释出),然后用乙酸乙酯提取,碱化后过固相萃取柱,C18柱分离,紫外检测,样品添加浓度(nóngdù)在0.075~35µg/g的回收率为85.7%~92.3%,相对标准偏差4.8%~17.2%,检测限。第六十四页，共96页。LC-MS/MS法测定奶制品中氯霉素残留量样品经液-液提取,固相萃取柱净化后进样,负离子电喷雾电离,MRM检测。由于氯霉素分子中有两个氯原子,因此NIRM选择4对离子对:m/z321→257,321→152(35Cl2)和323→257,323→152(37C135Cl),虽然m/z321→152的检测响应比其他离子对高,但基质对它有干扰,故选择仍m/z321→257作为定量离子对,添加(tiānjiā)水平在、、时,回收率和精密度符合欧盟残留检测的要求,测定限和测定能力分别为和。第六十五页，共96页。四、大环内酯类和林可霉素类大环内酯类(Macrolides)是一类具有14~16员大环的内酯结构的弱碱性抗生素,天然制品由链霉菌(méjūn)培养液中获取,经半合成改造可制得许多新型品种(图10-1)。自1952年发现代表品种红霉素以来已陆续有竹桃霉素、螺旋霉素、吉他霉素、麦迪霉素、交沙霉素及它们的衍生物问世。并出现动物专用品种如泰乐菌素、替米考星等。第六十六页，共96页。大环内酯类的抗菌谱和抗菌活性基本相似,主霉对需氧革兰阳性菌、革兰阴性球菌、厌氧球菌及军团菌属、支原体属、衣原体属有良好作用。仅作用于分裂活跃的细菌,属生长期抑菌剂。大环内酯类内服(nèifú)可吸收,体内分布广泛,胆汁中浓度很高,不易透过血脑屏障。主要从胆汁排出,粪中浓度较高。林可霉素类(Lincosa而des)是一类具有氨基酸侧链单苷结构的碱性抗生素,天然制品由链霉菌培养液中取得,经半合成改造可制得新型品种,代表品种有林可霉素、克林霉素和吡利霉素。第六十七页，共96页。林可霉素类抗菌谱较大环内酯类窄。革兰阳性菌及某些支原体(猪肺茨支原体、猪鼻支原体、猪关节(guānjié)液支原体)、钩端螺旋体均对本品敏感。而革兰阴性菌对本品耐药。林可霉素类的最大特点是对厌氧菌有良好抗菌活性。本类药物的作用机理同大坏内酯类,主要作用于细菌核糖体的59s亚基,通过抑制肽链的延长而影响蛋白质的合成。第六十八页，共96页。泰乐菌素动物组织中残留量取决于给药方式。肌注在注射部位和肾中残留量为最高,内服在肝中残留量为最高,而且肌注比内服残留量高、滞留时间更长。由于内服残留量比较低,因此饲料中即使(jíshǐ)添加1000mg/kg,家畜喂服后在肝脏中也很难检测到残留物。泰乐菌素可以迁入奶和蛋中,产蛋母鸡和泌乳奶牛禁用。有试验表明,奶17.6mg/kg,连续5日,停药后3天内奶中可检出残留量,平均浓度为。牛日因肌此注,奶牛用药后96h内采的奶不能供人类食用。肉鸡宰杀前,饲服休药期1天,肌注休药期3天。火鸡和猪宰杀前休药期5天和21天。第六十九页，共96页。替米考星与其他大环内酯类抗生素相比,替米考星用药安全性低,其毒作用的靶器官是心脏,可引起心动过速和收缩力减弱。内服或皮下注射本品后吸收快,组织穿透力强,分布容积大,尤以肝和乳中浓度较高。半衰期可达1~2日,体内维持时间长。通过给牛放射性标记替米考星的测定,发现主要通过粪排泄;可食组织、肝和肾中含高浓度的残留,尤以肝中残留量为最高且滞留(zhìliú)期长;28天后肝中母体残留量降至1mg/kg;在体内滞留(zhìliú)时间长,产奶期奶牛和肉牛犊禁用。第七十页，共96页。红霉素主要用于耐青霉素金黄葡萄球菌及其他敏感菌所致的各种感染,如肺炎、子宫炎、乳腺炎、败血症等。对鸡支原体病(慢性呼吸道病)和传染性鼻炎也有相当疗效。也可配成眼膏或软膏用于皮肤和眼部感染。红霉素可作为青霉素过敏动物的替代药物。红霉素能广泛分布到各种组织和体液中,在肝和胆汁中含量最高,胆汁中药物浓度为血清浓度的30倍。大部分药物在肝脏代谢,主要代谢途径(tújìng)为脱氧糖胺的N-去甲基化。主要经胆汁排泄,部分在肠道屮重吸收,少量以原形经尿排泄。其消除半衰期:猪1.21h,黄牛。第七十一页，共96页。竹桃霉竹桃霉素内服吸收慢,内服需用三乙酰竹桃霉素,但三乙酰竹桃霉素连续服用会损害肝脏,有皮肤过敏或腹泻等反应。三乙酰竹桃霉素在体内(tǐnèi)可代谢,但竹桃霉素在体内(tǐnèi)不代谢。内服或注射后,大部分组织如肝、肾、脾、心、肺和胆中可以检测到残留物。第七十二页，共96页。螺旋霉素内服胃肠吸收不规则,吸收后广泛(guǎngfàn)分布于体内。部分药物被胃酸分解为新螺旋霉素，其抗菌活性与螺旋霉素相似。螺旋霉素在肝脏代谢,主要经胆汁和肾排泄,部分由乳汁排出,乳汁中新螺旋霉素浓度是螺旋霉素浓度的6%~7%。螺旋霉素在体内吸收后滞留时间较长,药效维持时间长。牛注射30mg/kg后,肝和肾中药物浓度较高,肝中滞留期28天。犊牛日饲服25mg/kg,连续7日,肝和肾中药物残留很高,休药24天降至0.1mg/kg,而脂肪和肌肉休药3天后检测不出残留量。第七十三页，共96页。吉他(jítā)霉素本品内服吸收良好,广泛分布于主要脏器,尤以肾和肝中浓度为最高。猪单次内服达血药峰浓度4.5mg/kg,半衰期0.7h,1~2h达肾药峰浓度21mg/kg,肾/肝最高浓度比约为3/2。主要经肝胆系统排泄,在胆汁和粪中浓度高,少量经肾排泄。吉他霉素在肠道内吸收快,但释出亦快,24h后在脏器中无明显残留(cánliú),故其在组织中残留(cánliú)量是大环内酯类抗生素中最低的一种。第七十四页，共96页。林可霉素内服后可自胃肠道吸收,不被胃酸所破坏,空腹内服仅20~30%被吸收,食物可降低其吸收速度和吸收量。吸收后除脑脊液外,广泛及迅速分布于各体液和组织中,并能渗入骨组织内,也能进入乳汁和透过胎盘。林可霉素主要在肝内代谢,大部分随胆汁排泄,少部分随尿和乳汁排泄。犬内服后经粪便排泄的药物(yàowù)占77%,经尿排泄的占14%。肌内注射给药的消除半衰期为小动物3~4h、猪、奶牛、黄牛、水牛、马。第七十五页，共96页。克林霉素克林霉素内服吸收明显优于林可霉素,它吸收快而完全(约90%),进食对吸收的影响不大；体内分布广泛,可进入唾液、呼吸系统、胸腔积液、胆汁、肝脏、软组织、骨和关节(guānjié)等,也可透过胎盘,但不易进入脑脊液中。克林霉素在肝脏代谢,部分代谢物可保留抗菌活性。代谢物由胆汁和尿液排泄,约10%给药量以活性成分由尿排出,其余以不具活性的代谢产物排出。第七十六页，共96页。（一）样品(yàngpǐn)处理大环内酯类和林可霉素类都是弱碱性化合物,微溶于水,易溶于有机溶剂。除了竹桃霉素,大环内酯类抗生素在酸性或碱性条件下都不稳定(wěndìng)。大环内酯类抗生素为多官能团的糖苷结构,由大环内酯苷元部分和至少一个氨基糖组成。此类药物有14-内酯环的红霉素和竹桃霉素,以及多烯大环内酯的纳他霉素和两性霉素等。第七十七页，共96页。1、提取(tíqǔ)及脱蛋白液体样品(如牛奶)中的大环内酯类和林可霉素类残留分析时,一般先对样品离心脱蛋白处理。半固体样品(如肌肉(jīròu)、肾脏、肝脏)要进行研磨或匀浆处理,破碎组织。欲有效提取食物中的大环内酯类和林可霉素类残留,首先要将结合态的药物解离出来,尽可能去除蛋白质,这样能得到高的提取效率。第七十八页，共96页。由于本类抗生素与蛋白质的结合不是很强,对于液体样品的提取/脱蛋白,通常用有机溶剂振荡提取,离心脱蛋白质。对于半固体样品则加入(jiārù)有机溶剂,均质处理。常用的有机溶剂有乙腈、酸化乙腈或碱化乙腈、甲醇、酸化甲醇或者碱化甲醇、氯仿、碱化二氯甲烷。西地霉素属中性化合物,组织样可在酸性介质中用乙酸乙酯提取。从鱼组织中提取林可霉素,可先用钨酸钠溶液脱蛋白,再用酸性溶液提取。第七十九页，共96页。2、净化(jìnghuà)样品的粗提液要通过各种方法进一步纯化,这些方法包括液:液分配(fēnpèi)、固相萃取、液相色谱纯化。有时将几种方法结合使用,以获取高纯度的提取物。大环内酯类和林可霉素类具亲脂性,液-液分配(fēnpèi)时,在碱性介质中本类抗生素被抑制电离,可用二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿来提取占提取后有机提取物蒸发至干,用流动相溶解后进样分析,或用酸性缓冲液进行抽提。为达到更好的净化效果,有时需要凡步液-液分配(fēnpèi),以消除干扰杂质,但操作烦琐、费时,溶剂用量大。第八十页，共96页。固相萃取法常用吸附剂有非极性吸附剂如XAD-2树脂,或反相吸附剂如C18。采用戊磺酸离子对试剂可以提高本类抗生素在C18固相萃取柱上的保留能力。然而这些吸附剂在纯化肝脏和肾脏的粗提取液时效果一般。阳离子交换(jiāohuàn)树脂如苯磺酸型,或者极性吸附剂如硅胶、氨丙基、二醇,能够有效地分离纯化上述样品中的大环内酯类和林可霉素类。第八十一页，共96页。有报道，采用液相色谱法纯化牛奶和组织样中的林可霉素,步骤包括将样品(yàngpǐn)粗提取液上样到反相柱上(SµpelcosilLC-18或者LC-18-DB),用含离子对试剂的流动相洗脱,收集被分析物的馏分,再进行液相色谱分析。第八十二页，共96页。（二）分析方法大环内酯类和林可霉素类药物残留的分析方法有薄层(báocénɡ)色谱法、气相色谱法、液相色谱法等。表10-1列出了部分大环内酯类和林可霉素类药物残留的分析条件。第八十三页，共96页。1、薄层(báocénɡ)色谱法薄层色谱法可以(kěyǐ)和生物检测法结合，用枯草杆菌或者黄色微孢子门菌做生物显色。TLC-生物自显影法能够鉴别动物组织、牛奶和鸡蛋中的大环内酯类和林可霉素类药物残留第八十四页，共96页。2、气相色谱法有报道采用气相色谱-质谱法测定和鉴别牛肉和猪肉中的红霉素,样品需要用吡啶/醋酸酐(suāngān)衍生化,故操作较烦琐。第八十五页，共96页。3、生物(shēngwù)传感器法Galdow等报道了一种细胞质表皮因子(SPR)的光学生物传感器,用于牛奶中泰乐菌素的检测。本法和LC-MS/MS法进行(jìnxíng)比较，测定结果一致。第八十六页，共96页。4、液相色谱法本类药物的液相色谱分离一般采用非极性固定相,如C18、C8、苯基和聚合反相柱,尤以C18应用(yìngyòng)最广,常用甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲液作流动相。西地霉素和吡利霉素的分离,也可用极性的固定相如硅胶和氰丙基柱。第八十七页，共96页。5mg/kg,半衰期0.一般来说C8柱用于分析那些在C18柱上不能很好保留的化合物。在体内滞留(zhìliú)时间长,产奶期奶牛和肉牛犊禁用。HPLC法测定牛和猪